Collybistin對神經病理性疼痛的調控作用

韋 佳，丁韶麗，高學明，張雅敏，吳樹金，孫延慶

(1.甘肅省人民醫院功能科，2.甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000)

神經病理性疼痛在普通人群中的發病率為10%左右，其特點是反復、持續發作[1]。迄今，傳統的鎮痛藥物治療效果很差、副作用大。資料顯示，外周神經系統和中樞神經系統的病變都可引發神經病理性疼痛，具體表現為痛覺過敏 (hyperalgesia)、痛覺超敏 (allodynia) 和自發性疼痛等。神經病理性疼痛不僅嚴重影響人的生活質量 (食欲、睡眠等)，還會增加精神類疾病的發生率。然而，目前，誘發神經病理性疼痛的機制仍不清楚。

脊髓背角作為痛覺信息從外周向中樞傳遞的初級整合中樞，在神經病理性疼痛的發生發展中具有重要的作用。脊髓背角中的抑制性中間神經元在痛覺傳遞中發揮“剎車”作用，而抑制性受體介導的抑制性突觸傳遞負責其“剎車”作用[2-3]。外周神經損傷之后，抑制性突觸傳遞減弱；而提高抑制性突觸傳遞，則能夠緩解痛敏癥狀[3-4]，突觸可塑性參與了痛覺調控，我們以往的研究表明，抑制小鼠海馬組織ChAT活性，提高ChAT活性、升高ChAT蛋白的表達從而促進腦內乙酰膽堿的合成，可能是增強突觸可塑性的重要機制之一[5]。Collybistin是一種鳥嘌呤交換因子，與突觸可塑性密切相關[6-7]，有文獻報道，collybistin表達于抑制性突觸傳遞中，與抑制支架蛋白gephyrin相互作用，穩定抑制性受體在突觸后的表達[8-10]。Collybistin可能參與癲癇、焦慮等病理過程的發生、發展[8-9]，但是否參與神經病理性疼痛，仍不清楚。因此，本研究利用免疫組織化學、行為學和電生理等技術，探究collybistin在神經病理性疼痛發生發展中的作用。這一研究極有可能為神經病理性疼痛的預防、治療提供新的干預靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，♂，6～8周齡，(18～22) g，購買于蘭州大學動物中心。每籠飼養3～5只，自由進水、食，控制飼養環境溫度(22～26) ℃、相對濕度40%～60%。

1.2 主要試劑shRNA-collybistin和scrambled shRNA購買于上海吉瑪制藥技術有限公司；抗collybistin抗體 (SAB4500963) 和河豚毒素 (tetrodotoxin;TTX) 購買于sigma；CNQX和DAP-5購買于愛必信生物科技有限公司；CY3和Alexa Fluor 488 標記的熒光二抗以及辣根過氧化物酶標記的二抗均購買于Abcam。

1.3 主要方法

1.3.1坐骨神經分支損傷(spared nerve injury,SNI)模型的制備 手術器械和手術臺面消毒完成后，腹腔注射戊巴比妥鈉 (45～60 mg·kg-1) 麻醉成年小鼠，乙醚輔助麻醉。剪開皮膚、鈍性分離肌肉，充分暴露坐骨神經及其分支 (脛神經、腓總神經、腓腸神經)；玻璃分針慢慢分離腓腸神經，結扎脛神經和腓總神經，并在離結扎處2 mm的位置將神經剪斷；對肌肉和皮膚依次縫合，術后用碘伏進行消毒。對照側暴露坐骨神經，腓總神經和脛神經不進行結扎手術。確保造模成功后即可進行實驗。

1.3.2行為學測試

1.3.2.150%機械縮足閾值 (paw withdrawal thresholds,PWTs)檢測 實驗采用“Up-Down”法測試小鼠的機械縮足閾值。測試前將小鼠放置于底部有鐵絲網的行為籠中，適應30 min，待小鼠處于安靜狀態(停止探索行為及梳理毛發)后。用von Frey纖維垂直刺向小鼠足底掌心區域，使其彎曲至30°，單次刺激時間控制在3～5 s，間隔應不少于2 min。觀察小鼠的反應，若小鼠出現縮足、舔足或甩腿反應，記為陽性反應；反之，則記為陰性反應。通過以下公式計算50%縮足閾值 (PWT):50% PWT=10[Xf+Kδ]/10 000。xf為最后一個使用的Von Frey纖維的力度值，k值查表可得，δ為0.26。

1.3.2.2熱縮足潛伏期 (paw withdrawal latencies;PWLs) 檢測 實驗前將小鼠置于儀器的透明玻璃板上方，適應30 min。測試時，將熱刺痛儀上的“十”字形標記置于小鼠后足足底掌心，記錄從開始照射到小鼠出現縮足回避的時間，單次測試時間上限為10 s，以免出現組織損傷。重復實驗3次，求平均值作為小鼠的PWLs，測量間隔為5 min。測試期間及時清理小鼠在玻璃板上的排泄物，防止其影響實驗結果。

1.3.3鞘內轉染 首先將小鼠固定在實驗臺上，使其背部朝上，穩定小鼠脊椎，手持25 μL 微量進樣器從小鼠L5～L6棘突間隙進針，以空洞感及小鼠甩尾視為針尖到達蛛網膜下腔處。緩慢推注shRNA，待推注完后，針頭稍作停留緩慢拔出，防止滲出。

1.3.4Western blot實驗 實驗小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液 (80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，行椎板切開術，分離L4～L5節段脊髓，轉移至預冷的蛋白裂解液裂解30 min。離心 (14 000 r·min-1,4 ℃,10 min) 后，取上清，加入4×Sample Buffer，振蕩混勻、煮沸3 min，冷卻上樣。蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳后轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜。d2,再用相對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光試劑盒顯色。最后使用ImageJ軟件對圖像進行灰度分析。

1.3.5免疫組織化學染色 實驗小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液 (80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，暴露心臟，經左心室灌流20 mL含肝素鈉生理鹽水，10 mL 4%多聚甲醛。分離小鼠脊髓轉移4%多聚甲醛中后固定2 h，再移至30%蔗糖溶液脫水過夜。d2,冰凍切片機 (CM1860,Lecia) 切取厚40 μm的脊髓片。脊髓片轉移至包含0.25% Triton X-100和10%山羊血清 (normal goat serum,NGS) 的PBS中封閉過夜。一抗孵育脊髓片24 h。PBS 溶液清洗脊髓片5次，每次20 min。脊髓片與相對應的熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS 清洗脊髓片切片 5次，每次20 min。PVP封片液封片，激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。

1.3.6電生理記錄 實驗小鼠麻醉后，行椎板切開術，分離脊髓快速轉移至切片液中。剝離脊髓軟硬脊膜后，利用震動切片機切取厚400 μm的脊髓片。電生理記錄前先將脊髓片置于切片液中室溫孵育至少1 h，持續通入95% O2和5% CO2恢復細胞狀態。將脊髓片轉移至操作臺上，持續灌流氧飽和的人工腦脊液 (artificial cerebrospinal fluid,ACSF)，以維持細胞的活性。在顯微鏡下挑選健康的II板層外側神經元，記錄微小抑制性突觸后電流 (miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)，記錄過程中電壓鉗制在0 mv。在ACSF中加入10 μmol·L-1CNQX和50 μmol·L-1DAP-5、以阻斷興奮性突觸傳遞，加入1 mol·L-1TTX、以阻斷鈉通道電流。

2 結果

2.1 Collybistin表達于脊髓神經元中為了觀察collybistin在脊髓中的表達情況，我們進行了Western blot實驗。Fig 1A顯示，抗Collybistin抗體在小鼠脊髓裂解液中發現了明顯的信號，說明collybistin分布在脊髓中。利用免疫組織化學染色，分析collybistin是否分布在脊髓神經元中。如Fig 1B所示，神經元標志物NeuN與collybistin共染，表明脊髓神經元中表達collybistin。

2.2 外周神經損傷減少脊髓collybistin的蛋白表達為了明確外周神經損傷對脊髓collybistin表達的影響，我們選取成年小鼠，制備坐骨神經分支損傷 (spared nerve injury,SNI) 模型，14 d后，進行Western blot。行為學測試結果顯示，與假手術組相比，SNI明顯降低了小鼠的機械性縮足閾值 (Fig 2A)，說明神經病理性疼痛模型成功建立；Western blot結果表明，與生理鹽水組相比，SNI明顯降低了脊髓中collybistin的蛋白表達 (Fig 2B)。

Fig 1 Collybistin expressed in spinal cord of mice

2.3 敲低脊髓collybistin的表達導致痛覺敏化為了探究collybistin在痛覺調控中的作用，我們首先構建了針對collybistin的shRNA (shRNA-collybistin)，通過抑制內源性collybistin蛋白的表達驗證這一實驗目的。Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，shRNA-collybistin明顯降低了collybistin的蛋白表達，而scrambled shRNA 組無明顯變化 (Fig 3A)。接著我們進行了行為學測試，如Fig 3B和3C顯示，與scrambled shRNA組相比，鞘內轉染shRNA-collybistin明顯降低了小鼠的縮足閾值 (paw withdrawal thresholds,PWTs) 和縮足潛伏期 (paw withdrawal latencies;PWLs)，表現出機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。

2.4 脊髓過表達collybistin緩解痛覺敏化Fig 4結果顯示，SNI模型小鼠的PWTs和PWLs值明顯降低；與GFP組相比，鞘內轉染collybistin能夠明顯提高小鼠的PWTs (Fig 4A) 和PWLs值 (Fig 4B)，說明過表達collybistin可緩解外周神經損傷誘發的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。

2.5 敲低脊髓collybistin降低抑制性突觸傳遞電生理實驗結果顯示，與基礎值相比，collybistin抗體明顯降低脊髓背角神經元中的微小抑制性突觸后電流 (miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs) 的幅值和頻率 (Fig 5A)，說明collybistin能夠維持正常的抑制性突觸傳遞。為了再次驗證這一現象，我們在小鼠鞘內轉染shRNA-collybistin后，記錄mIPSCs。結果顯示，與scrambled shRNA組相比，鞘內轉染shRNA-collybistin同樣明顯降低了mIPSCs的幅值和頻率 (Fig 5B)。

2.6 過表達collybistin增強神經病理性疼痛小鼠的抑制性突觸傳遞Fig 5表明，collybistin在維持正常的抑制性突觸傳遞中發揮重要作用，那么我們猜測，過表達collybistin可緩解外周神經損傷對抑制性突觸傳遞的減弱作用。Fig 6結果顯示，與空白對照組相比，SNI模型組小鼠的mIPSCs的幅值和頻率明顯降低；與SNI模型組相比，過表達collybistin能夠明顯提高SNI模型組小鼠mIPSCs的幅值和頻率 (Fig 6A)。

3 討論

本實驗發現，collybistin表達于脊髓神經元中，外周神經損傷可明顯降低脊髓collybistin的蛋白表達。結果提示，collybistin可能在痛覺調控中發揮作用。接著，行為學測試觀察collybistin對小鼠痛行為學的影響，結果表明，干擾collybistin可誘發正常小鼠的痛覺敏化。最后，全細胞電記錄結果表明，collybistin在維持正常小鼠的抑制性突觸傳遞中發揮核心作用。

Fig 2 The reduced expression of collybistin observed after peripheral nerve injure

Fig 3 Knockdown of collybistin in spinal cord of mice induced pain n=6)

Fig 4 Spinal overexpression of collybistin attenuated neuropathic n=6)

文獻報道，collybistin分布在海馬和皮質神經元中，與突觸傳遞以及可塑性密切相關，參與癲癇、焦慮等神經退行性疾病[9,11]。大量資料已經證明，脊髓背角是傳遞、整合痛覺信息的初級中樞[12]。我們的研究顯示，collybistin大量表達在脊髓神經元中；神經病理性疼痛小鼠脊髓中collybistin的蛋白表達明顯降低。這一結果提示，collybistin可能參與痛覺突觸傳遞。然而，collybistin在脊髓中分布的細胞類型以及是否在外周神經系統中表達，還需要進一步的探究。

Fig 5 Collybistin regulated inhibitory synapse n=6)

Fig 6 Spinal overexpression of collybistin prevented peripheral nerve injury from decreasing inhibitory synaptic transmission. n=6)

在成年哺乳動物脊髓中，抑制性突觸傳遞能夠門控外周傷害性信息向腦區的傳遞[2,3,13]。鞘內給予化學抑制劑阻斷抑制性受體、或利用基因技術沉默受體，都可誘發正常小鼠的痛覺中樞敏化[3,14]。最近的研究表明，collybistin可與抑制性突觸支架蛋白gephyrin相互結合，維持抑制性受體在突觸的聚集。結果顯示，鞘內轉染shRNA-collybistin，誘發正常小鼠的痛覺過敏和痛覺超敏。同時，我們利用collybistin的特異性抗體、或shRNA-collybistin拮抗細胞內collybistin功能之后，發現脊髓背角神經元中的抑制性突觸傳遞明顯降低。有研究表明，collybistin還可能通過與GABAAR α2亞基和甘氨酸受體α1亞基的相互作用，增加抑制性受體的突觸表達[9-10]。

當小鼠發生外周神經損傷之后，GABAAR和甘氨酸受體介導的抑制性功能受損，表現出痛覺敏化[4,15]。然而，增強抑制性突觸傳遞能夠緩解小鼠的痛敏癥狀[3]。我們發現，脊髓過表達collybistin，可明顯緩解外周神經損傷誘發的痛覺敏化。此外，還能恢復外周神經損傷導致的“去抑制”。

綜上所述，本研究揭示了collybistin在痛覺調控中的作用，為闡明神經病理性疼痛的發病機制提供相應依據，這一研究為神經病理性疼痛的治療提供新的思路。