基于網絡藥理學和分子對接研究紫藤瘤對胃癌的作用機制及初步驗證

楊 輝，王文君，徐澤榮，黃宇飛，程 卉，劉勁松，4，5，王國凱，4，5

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫藥大學科研技術中心，安徽 合肥 230038；4.中藥研究與開發安徽省重點實驗室，5.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

近年來，我國胃癌總體發病率呈上升趨勢，在我國，胃癌是僅次于肺癌的第二大高發癌癥，且胃癌患病率以及死亡率均超過世界平均水平的2倍[1]。紫藤瘤(Wisteriasinensistumor)是由細菌侵染紫藤莖，植物應激反應后，在莖體上寄生的病變組織。當前西醫治療胃癌的手段仍為手術、放療以及化療，易損傷機體正常組織細胞，若胃癌手術未能完全切除腫瘤容易復發，具有一定的弊端和局限性。中醫藥治療胃癌已成為目前國內外研究的熱點[2]。紫藤瘤具有止痛、解毒、殺蟲以及抗腫瘤作用，在日本民間一直被用作抗胃癌的藥物使用。課題組前期對紫藤瘤的化學成分進行了系統研究[3-11]，在此基礎上，本研究擬通過網絡藥理學和分子對接技術探討紫藤瘤抗胃癌潛在的有效成分和作用機制并通過體外實驗驗證，為后續研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 紫藤瘤藥物靶點篩選使用化學專業數據庫以及查找文獻收集紫藤瘤的所有化學成分；利用中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacological，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)計算這些化學成分的ADME值并對口服生物利用度(OB)、類藥指數(DL)值進行評估，選取OB≥30%，DL≥0.18的活性較高的化合物作為紫藤瘤候選活性成分，在有機小分子生物活性數據庫PubChem (https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索經過篩選的活性較高的化合物，保存化合物的Canonical SMILES號，然后使用在線靶標預測網站SwissTargetPrediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，檢索保存的Canonical SMILES號得到化合物的潛在靶點。

1.2 胃癌疾病靶點篩選通過人類孟德爾遺傳綜合數據庫 (online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org)以及DrugBank數據庫(https：//go.drugbank.com/)對胃癌潛在靶點進行預測，搜索已報道的與胃癌相關的基因，并搜索文獻驗證。

1.3 藥物靶點與疾病靶點的標準化以及共有靶點的映射將得到的紫藤瘤靶點和胃癌疾病靶點分別導入到UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)中得到UniProt數據庫識別碼格式，篩選得到物種種屬為“Homo sapiens(Human)”相應的靶點，得到紫藤瘤藥物靶點數據集和胃癌疾病靶點數據集。將上述已經標準化的紫藤瘤藥物靶點和胃癌疾病靶點上傳至Venny2.1.0平臺(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，得到紫藤瘤靶點與胃癌靶點的映射，篩選紫藤瘤靶點與胃癌靶點的共有靶點，獲得紫藤瘤治療胃癌的潛在靶點的Venny圖。

1.4 PPI網絡構建與分析為進一步明確紫藤瘤潛在靶點與胃癌疾病靶點之間的相互作用關系，將篩選得到的共有靶點導入STRING數據庫(https：//string-db.org/)，在“Multiple proteins”條件下將種類定義為Homo sapiens進行分析，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，且最低相互作用閾值取中等“medium confidence”(≥0.4)獲得靶蛋白相互作用核心網絡關系，導入Cytoscape3.7.2軟件制作藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用網絡圖并進行可視化分析。

1.5 GO富集分析與KEGG通路注釋分析為說明藥物的靶點在基因功能中的作用，將上述篩選出的紫藤瘤與胃癌的共有靶點導入Metascape數據庫(https：//metascape.org/)中，將種屬選為人(“H.sapiens”)，選擇自定義分析(Custom Analysis)，設定P值為0.01，最小計數為3，富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計數與偶然期望的計數之比的術語)，得到富集分析結果，分別從功能、參與的生物途徑及細胞中的定位對基因產物進行標準化描述，并得到GO富集分析柱狀圖和KEGG通路注釋分析柱狀圖。

1.6 靶點-信號通路網絡的構建為進一步明確紫藤瘤活性成分、共有靶點與信號通路之間相互作用關系，將上述KEGG通路注釋分析所得到的通路與紫藤瘤活性成分以及共有靶點之間相互匹配，制作紫藤瘤候選活性成分-胃癌靶點-通路網絡表，將紫藤瘤候選活性成分-胃癌靶點-通路信息導入Cytoscape3.7.2軟件構建紫藤瘤候選活性成分-靶點-信號通路網絡圖，以實現紫藤瘤治療胃癌作用機制的可視化。

1.7 成分與治療胃癌關鍵靶點分子對接選擇紫藤瘤治療胃癌的蛋白相互作用(PPI)網絡中度值較高的5個關鍵靶點與其對應的潛在活性成分進行分子對接，查找相關文獻或者檢索pubchem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得活性成分的2D結構式，利用ChemBio3D Ultra 14.0繪制其3D結構，進行能量最小化處理后保存為mol 2格式。在PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/structure)中下載關鍵靶點pdb格式，利用Pymol Win軟件進行去水去配體處理后保存。利用Autodock Vina軟件將治療胃癌的關鍵靶點與相應的活性化合物進行分子對接。分子對接成功后，其結果用Pymol Win軟件進行可視化處理。

1.8 細胞實驗驗證

1.8.1細胞株 人胃癌細胞SGC-7901購自中國科學院(上海細胞生物學研究所)培養庫。

1.8.2試劑 MTT(1212U054)、PBS (726P022) 購自北京索萊寶公司；青霉素-鏈霉素溶液( 080421211018)、0.25%胰酶細胞消化液( L112421211204)購自上海碧云天公司；胎牛血清(FBS,RB39736)購自美國Hyclone公司；RPMI-1640(WH0021F141)購自武漢普諾賽公司；DMSO(EZ7890A253)購自德國BioFroxx公司；化合物由課題組從紫藤瘤中分得，經質譜及核磁確定其純度和結構。

1.8.3儀器 CO2培養箱、-80 ℃冰箱購自日本Sanyo公司；CK2型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；生物安全柜購自浙江蘇凈凈化設備有限公司；低速離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋購自常州國華電器有限公司；多功能酶標儀購自美國MD公司；細胞培養瓶、培養板購自美國Corning公司；液氮罐購自成都金鳳液氮容器公司。

1.8.4細胞培養 快速從液氮罐中取出凍存的細胞置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍，融化后迅速進入生物安全柜中無菌操作，將凍存管中的細胞懸液吸入裝有5 mL完全培養基的15 mL的離心管內，1 000r·min-1，5 min，離心后棄去上清，加入6 mL完全培養基，吹打混勻后，將細胞懸液接種培養瓶，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.8.5MTT比色法 取對數期生長的人胃癌細胞SGC-7901，調整細胞濃度為2×108個·L-1，接種于96孔板中，每孔細胞培養液100 μL，每組設6個復孔，設空白組(只加完全培養基100 μL，不加細胞懸液)、對照組(細胞懸液只加完全培養基，即藥物濃度為0)和不同濃度藥物組(10、20、40、80、160、320、640 μmol·L-1)，細胞培養過夜，待貼壁后吸去對照組和藥物組培養基。加入不同濃度的藥物培養基100 μL，培養24 h，吸去舊培養基，每孔加入10 μL MTT，操作過程避光，并用錫紙將96孔板包裹避光繼續培養4 h。吸去培養基，每孔加入150 μL DMSO，操作過程避光，并用錫紙將96孔板包裹避光置于搖床上緩慢振搖15 min后。在酶標儀490 nm波長下測吸光值。計算細胞存活率公式如下：

細胞存活率/%=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.8.6AV-PI 染色流式細胞儀檢測芒柄花素誘導SGC-7901細胞凋亡的作用 對數生長期的SGC-7901細胞，以2×105個/孔接種于96孔板中，每孔含完全培養基2 mL，孵育過夜后棄去原培養基，換成含不同濃度的芒柄花素培養液。繼續培養24 h后，用不含 EDTA-Na2的胰酶消化液消化離心并收集細胞。4 ℃預冷的PBS緩沖液清洗細胞2遍，1 800 r·min-1離心5 min。加入500 μL預冷的PBS重懸細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，用移液器吹打均勻，避光15 min，吸取5 μL PI加入繼續吹打使之充分混合，于室溫下避光孵育約5 min。流式細胞儀上FL1和FL3通道進行檢測。

1.8.7鈣離子水平檢測 對數生長期的SGC-7901細胞，以2×105個/孔接種于96孔板中，每孔加入完全培養基 2 mL，37度培養箱孵育過夜后棄去原培養基，換成含不同濃度的芒柄花素完全培養基。繼續培養24 h后，用胰酶消化液消化離心并收集細胞。4 ℃預冷的PBS緩沖液清洗細胞2遍，1 800 r·min-1離心5 min。加入100 μL預冷的PBS重懸細胞，加入FIuo-3AM染料避光染色15 min，于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.8.8統計學方法 使用Graph Pad Prism 6等軟件進行數據統計分析，組間差異均使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 紫藤瘤候選活性成分的獲取使用化學專業數據庫以及查找文獻收集紫藤瘤的所有化學成分；在TCMSP數據庫中篩選所有化學成分，經篩選符合要求的成分共有8個，分別是異豆素、美迪紫檀素、芒柄花素、豆甾醇、α-菠甾醇、蒲公英賽醇、β-谷甾醇棕櫚酸酯、(22E，24R)-5α，8α-過氧麥角甾-6，22-二烯-3β-醇，見Tab 1。

2.2 紫藤瘤藥物靶點及胃癌疾病靶點的獲取從PubChem中檢索上述成分Canonical SMILES號，通過SwissTargetPrediction數據庫檢索得到上述成分的潛在靶點，去掉重復，最終得到308個靶點；通過OMIM數據庫和DrugBank數據庫篩選胃癌疾病的相關靶點，最終得到269個胃癌疾病靶點。

Tab 1 Screening results of active ingredients from

2.3 紫藤瘤治療胃癌的潛在靶點預測通過UniProt數據庫將上述靶點和胃癌疾病靶點轉化為UniProt數據庫識別碼格式。使用Venny2.1.0在線平臺，將紫藤瘤藥物靶點與胃癌疾病靶點進行映射取交集，見Fig 1。預測到紫藤瘤候選活性成分的胃癌潛在靶點即紫藤瘤藥物靶點與胃癌疾病靶點的交集，共19個，分別為MET、EGFR、PIK3CA、CCND1、BRAF、KIT、MTOR、CHEK2、RET、ESR1、FGFR1、RAF1、MDM2、PTGS2、MAP2K1、CBR1、AKR1C3、PTPRF以及NOS2。

Fig 1 Venn diagram of Wisteria sinensis tumor targets

2.4 紫藤瘤治療胃癌的蛋白相互作用(PPI)將共有靶點上傳至STRING數據庫，導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到靶蛋白相互作用網絡圖。可知度值較高的靶點是蘇氨酸蛋白激酶(MTOR)、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸-3-激酶催化亞單位α異構體(PIK3CA)、雌激素受體(ESR1)、S-特異性細胞周期蛋白-D1(CCND1)、表皮生長因子受體(EGFR)。

Fig 2 PPI protein interaction network diagram

2.5 KEGG和GO分析篩選出19個直接作用靶點作為本次KEGG通路注釋分析的參與靶點。將符合篩選條件的直接作用靶點呈遞到Metascape數據庫進行KEGG通路注釋分析和GO功能分析。KEGG分析結果表明，紫藤瘤治療胃癌的相關信號通路主要有7條：惡性腫瘤通路、甲狀腺激素信號通路、甲狀腺癌通路、黏著小帶通路、小細胞肺癌通路、花生四烯酸代謝通路以及p53信號通路，見Fig 3。另外，惡性腫瘤通路是KEGG通路富集分析中與胃癌相關靶點最多的通路，以紫藤瘤活性成分參與惡性腫瘤通路為例，利用R語言clusterProfiler程序包繪制靶點在關鍵通路中發揮作用過程可視化圖，見Fig 4，紅色靶點代表紫藤瘤中活性成分的關鍵靶點在該信號通路中所參與的過程，這些靶點在該信號通路中起著關鍵作用。這表明紫藤瘤活性成分可以通過參與多種通路協調發揮治療胃癌的作用。

GO富集分析包括GO生物過程(biological process，BP)分析、分子功能(molecular function，MF)分析和細胞組分(cellular component，CC)分析。GO-BP分析結果見Fig 5，共得到18條結果，進行統計學分析并按照相關度排列，主要通過調節3個生物過程進而發揮對胃癌的治療作用，包括蛋白激酶B信號通路的正向調節、激酶活性的正向調節、肽酰絲氨酸磷酸化；GO-MF分析結果見Fig 6，發現紫藤瘤活性成分主要通過蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結合等分子功能發揮治療胃癌的作用；GO-CC分析結果見Fig 7，發現紫藤瘤活性成分主要通過受體復合物、核膜、細胞器外膜等細胞組分發揮治療胃癌的作用。

2.6 成分-胃癌靶點-信號通路網絡將KEGG通路注釋分析的結果與成分和共有靶點之間相互匹配，得成分-胃癌靶點-通路網絡表，將信息導入Cytoscape3.7.2軟件構建網絡圖，見Fig 8。

Fig 3 KEGG pathway barplot diagram

Fig 4 Process of target playing a role in critical pathway

Fig 5 Functional analysis of GO biological process

Fig 6 GO molecular function analysis

Fig 7 GO cell component analysis

Fig 8 Medicinal-disease-component-target-pathway

圖中藍色圓形節點代表8個成分，紅色菱形節點代表19個潛在靶點，綠色正六邊形節點代表可能涉及的7條信號通路，邊代表它們之間的相互關聯，節點的大小和顏色的深淺代表度值的大小，節點越大，顏色越深代表相關性越大。從圖中可以看出，美迪紫檀素(medicarpin)和異豆素(isoduartin)治療胃癌的潛在靶點最多，一氧化氮合酶(NOS2)、雌激素受體(ESR1)、S-特異性細胞周期蛋白-D1(CCND1等靶點)參與紫藤瘤治療胃癌的關聯度最大，發揮作用最大的通路是惡性腫瘤通路。從圖中可看出同一活性成分可對應于不同的靶點，同一靶點也可對應于不同的活性成分，充分體現了紫藤瘤治療胃癌多成分、多靶點的作用特點。

2.7 成分-靶點分子對接結果篩選度值較高的5個關鍵靶點和其對應的潛在活性化合物進行了分子對接驗證，見Tab 2。結合能小于0，說明受體分子與配體分子能自發結合，結合能絕對值越高，對接能力越強，對接后分子的穩定性越高。對接結果顯示化合物與治療胃癌的受體蛋白的結合能均小于-7 kcal·mol-1，說明成分與關鍵靶點分子均能較穩定的結合。分子對接的可視化結果見Fig 9。

Tab 2 Binding energy of compounds and top

Fig 9 Visual results of molecular docking of compounds

2.8 化合物抑制胃癌細胞SGC-7901的作用利用MTT法檢測不同濃度的化合物抑制胃癌細胞SGC-7901增殖的影響，見Fig 10。與空白對照組相比，芒柄花素能顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901的增殖。

Fig 10 Effect of formononetin on viability of SGC-7901

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.9 AV-PI染色流式細胞儀檢測芒柄花素誘導SGC-7901細胞凋亡的作用芒柄花素作用于SGC-7901細胞4 h后，Fig 11結果顯示，正常對照組細胞凋亡率為(3.47±0.92)%，隨著芒柄花素濃度的增加細胞凋亡率明顯增加，對SGC-7901的細胞凋亡率分別為(7.12±1.36)%、(27.65±4.12)%，與空白組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.10 芒柄花素對SGC-7901細胞鈣離子水平的影響通過FIuo-3AM檢測芒柄花素作用SGC-7901細胞前后鈣離子水平的變化，Fig 12可見，空白組細胞呈現均一暗淡的綠色熒光，而隨著芒柄花素藥物濃度的增加，綠色熒光水平呈濃度依賴性增加，在芒柄花素80 μmol·L-1濃度組中可見明亮的綠色熒光。表明芒柄花素可以濃度依賴性增加細胞鈣離子的水平。

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法和分子對接探討紫藤瘤治療胃癌的可能有效成分及潛在作用機制，并通過細胞實驗進行驗證。結果挖掘了紫藤瘤治療胃癌的8個候選活性成分和相應的19個靶點及7條信號通路，證明紫藤瘤確實具有一定的抗胃癌潛力。

在8個活性成分當中，美迪紫檀素、異豆素以及芒柄花素治療胃癌的潛在靶點最多，提示其在紫藤瘤治療胃癌中可能會發揮重要作用。在此基礎上，選取了這3個成分與MTOR、PIK3CA、CCND1等關鍵靶點進行分子對接驗證，結果表明，其結合能均小于-7.0 kcal·mol-1，提示有較好的結合活性。利用體外實驗進行驗證，結果表明芒柄花素能顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901的增殖。董陳誠等[12]研究表明，芒柄花素可能會通過激活NF-κB信號通路抑制人胃癌MKN-45細胞株的增殖、促進細胞凋亡。李偉東等[13]研究美迪紫檀素對人肝癌細胞Hep2有抑制和殺滅的作用，本研究結果也為后續研究提供了思路。

成分-靶點-通路圖中表明了紫藤瘤通過多成分、多靶點、多通路治療胃癌。通過圖中關聯度比較可以看出，NOS2、ESR1、CCND1、EGFR等靶點可能是紫藤瘤抗胃癌的核心靶點。NOS2一氧化氮合酶，其在胃癌組織中的表達水平高于正常胃旁組織。梁春艷[14]研究表明通過誘導AGS細胞凋亡，可以抑制NOS2的表達，從而提高胃癌患者的總生存率。ESR1為雌激素受體，它可以通過多種途徑與其他信號分子相互作用，在胃癌中，其與細胞增殖、轉移和侵襲相關[15]。CCND1是S-特異性細胞周期蛋白-D1，劉久鵬等[16]通過實驗證實通過降低胃癌MGC-803細胞增殖，抑制細胞生長，下調CCND1的表達可以將人胃癌MGC-803細胞阻滯于G0/G1期。EGFR是表皮生長因子受體，繆鵬飚等[17]研究發現，干擾EGFR的表達能夠調節基因組變化來抑制胃癌細胞的生長達到治療胃癌的目的。

Fig 11 Effect of formononetin on apoptotic rate of SGC-7901 cells detected by flow cytometry**P<0.01 vs control

Fig 12 Effect of anthocyanin on calcium level of SGC-7901 cells detected by Fluo-3AM staining(×100)**P<0.01 vs control

KEGG通路結果顯示，惡性腫瘤信號通路富集靶點最多，提示其可能是紫藤瘤治療胃癌較顯著的通路，在靶點參與通路的可視化圖中，EGFR、MET等基因參與了調節惡性腫瘤通路發揮作用。另外，研究也發現p53信號通路在治療胃癌中的影響作用愈發明顯[18]。

綜上所述，本研究探討了紫藤瘤治療胃癌的可能活性成分及潛在作用機制，為進一步研究及臨床應用提供了參考。