白藜蘆醇通過促進(jìn)活化T淋巴細(xì)胞凋亡改善小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎

陳藹如，沈 燕，羅 瓊，徐 強(qiáng)

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京 210023)

T淋巴細(xì)胞最初來源于骨髓，在胸腺發(fā)育并經(jīng)歷陽性選擇和陰性選擇之后，成熟的T細(xì)胞來到外周淋巴器官。正常情況下，這些T淋巴細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，一旦遇到“非己”抗原，便會迅速增殖進(jìn)入炎癥部位發(fā)揮免疫功能。當(dāng)外來物被清除的時候，為了維持免疫穩(wěn)態(tài)，活化的T淋巴細(xì)胞必須立刻被清除，否則會引起自身免疫性疾病[1]。T淋巴細(xì)胞在沒有接收到相應(yīng)共刺激信號，而T淋巴細(xì)胞受體(T cell receptor)又被再次刺激的時候，會通過Fas/FasL信號通路發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這種調(diào)節(jié)機(jī)制可以避免效應(yīng)T淋巴細(xì)胞過度表達(dá)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，維持外周的免疫耐受，同時還能保存記憶細(xì)胞[2]。人類多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)的患者體內(nèi)就出現(xiàn)了這一機(jī)制的差異性表達(dá)：相較于健康人群，MS患者的Th1細(xì)胞對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感，而Th17、Th1/17細(xì)胞則出現(xiàn)了抵抗[3]。因此，開發(fā)調(diào)控活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的藥物對自身免疫性疾病的治療有著積極作用。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學(xué)名為3，4’，5-三羥基-1，2-二苯基乙烯，是天然的多酚類植物抗毒素，也是非黃酮類植物雌激素[4]。Res在人們?nèi)粘Ｊ秤玫墓?例如葡萄、花生、桑葚、大豆等)中大量存在，并且具有廣泛的藥理學(xué)活性，在抗氧化、抗炎、抑癌、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等方面都有很好的效果[5]。本文重點考察Res促進(jìn)活化T淋巴細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用特點，并探討其分子機(jī)理，在此基礎(chǔ)上考察Res對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的治療效果。

1 材料

1.1 實驗動物健康C57BL/6J雌性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，6～8周齡，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養(yǎng)于南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物實驗室，在(21±2) ℃、自由取食、自由飲水和12 h晝夜交替的SPF級條件下飼養(yǎng)。所有動物實驗均在南京大學(xué)實驗動物委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行，且實驗方法符合動物實驗的相關(guān)指南。

1.2 細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 試劑Res(R5010)、Caspase Inhibitor VI(219007)、PMA(P8139)、離子霉素(Ionomycin)(I3909)、弗氏不完全佐劑(F5506)、百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)(P7208)購自MERCK；Purified anti-mouse CD3(145-2C11)、Purified anti-mouse CD28(37.51)購自BD；Mouse IL-2(P04351)購自R&D；Annexin V-EGFP/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(40303ES20)購自翌圣生物；mouse CD4(L3T4)、MicroBeads(130-117-043)購自Miltenyi；結(jié)核分枝桿菌H37-Ra(Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra)(231141)購自Difco；MOG35-55凍干粉由生工合成；anti-PARP、anti-Caspase-3、anti-Cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；anti-Tubulin抗體購自Abmart。

1.4 儀器FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD)；垂直凝膠電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)槽(Bio-Rad)；倒置顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞制備無菌摘取正常小鼠的腹股溝、腋下、頸部及腸系膜淋巴結(jié)置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用5 mL注射器針芯輕柔研磨將淋巴細(xì)胞擠出。反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液均勻，通過篩網(wǎng)收集細(xì)胞懸液，300g離心5 min。棄上清后用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌1次，計數(shù)待用。

2.2 CD4+T淋巴細(xì)胞的純化小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞純化按說明書進(jìn)行。大致流程如下，取淋巴結(jié)細(xì)胞，離心并重懸于分選液中，每108個細(xì)胞加10 μL微珠。在4 ℃孵育30 min，每10 min震蕩1次。孵育完離心，用分選液重懸并計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整到1010L-1。使用2 mL分選液潤洗裝架的分選柱，每次500 μL，不能流干。潤洗完后，每次500 μL將細(xì)胞懸液過柱，然后用2 mL分選液洗柱子。待液體接近流盡時，一次性補(bǔ)加5 mL分選液。最后將分選柱從架子上取下，用注射器推至離心管中，即為純化的CD4+T淋巴細(xì)胞。將純化后的細(xì)胞進(jìn)行FITC-CD4染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度，純度大于95%。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)收集的淋巴結(jié)細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞以及Jurkat細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。

2.4 活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模型將純化的小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞與anti-CD3/CD28抗體(1 mg·L-1)孵育，培養(yǎng)72 h后，用新鮮無血清培養(yǎng)基洗2-3次，隨后置于含50 kU·L-1IL-2的完全培養(yǎng)基中靜息培養(yǎng)。靜息期間，在不同時間點分別加入Res共培養(yǎng)0、6、12、24、48 h。最后用anti-CD3抗體(1 mg·L-1)和IL-2(100 kU·L-1)再次刺激細(xì)胞6 h，誘導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Jurket細(xì)胞與Res共孵24 h，隨后用新鮮無血清培養(yǎng)基洗2～3次，再用100 μg·L-1PMA和1 mg·L-1離子霉素刺激24 h，誘導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

2.5 Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗1遍，用1× Binding buffer重懸，先加入Annexin V-EGFP，避光孵育5 min，再加入PI Staining solution和適量PBS，上機(jī)檢測。

2.6 PI單染檢測細(xì)胞凋亡收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗1遍，加入PI Staining solution和適量PBS，上機(jī)檢測。

2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞，提蛋白定量，沸水煮5 min后，經(jīng)12.5% SDS-PAGE凝膠分離，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛奶中封閉2 h后，加入一抗(一抗均1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日，用PBST洗3遍，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。PBST洗3遍后，用ECL發(fā)光液顯影。

2.8 小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型取MOG35-55凍干粉溶于PBS中(MOG：200 μg·只-1)；稱取結(jié)核分枝桿菌溶于IFA中(終濃度6 g·L-1)；將上述兩種混懸液按1 ∶1比例充分乳化成油包水狀態(tài)，制成誘導(dǎo)EAE的乳劑；采用多點注射法，于小鼠頸部及脊柱兩旁選3～4點皮下注射0.2 mL乳劑；同時尾靜脈注射百日咳毒素0.2 mL(含百日咳毒素 400 ng)；48 h后再次尾靜脈注射百日咳毒素0.2 mL。自免疫當(dāng)天開始，每天給小鼠稱體質(zhì)量，觀察，并進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分標(biāo)注為通用的5級評分法：0分，不發(fā)病；1分，尾部無力；2分，尾部無力并且不完全后肢(1～2支后肢)癱瘓；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢和任一前肢均癱瘓，被動翻身后不能復(fù)位；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉為溶劑對照，給藥組小鼠每天灌胃給予100 mg·kg-1Res，給藥從免疫當(dāng)天開始，持續(xù)至實驗結(jié)束。

平兒被停在窗前的一塊板上，用白布給他蒙住眼睛。隔院的人們都來看著，因為要曉得“鬼子”怎樣治病，“鬼子”治病究竟怎樣可怕。

3 結(jié)果

3.1 Res促進(jìn)小鼠活化T淋巴細(xì)胞的凋亡將不同濃度的Res與na?ve T淋巴細(xì)胞或anti-CD3/CD28抗體活化的T淋巴細(xì)胞共孵24 h，Annexin V/PI雙染細(xì)胞后通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。如Fig 1A所示，Res可以劑量依賴性地誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞進(jìn)入凋亡，并且大多數(shù)凋亡細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡。當(dāng)Res劑量為20 mg·L-1時，活化T淋巴細(xì)胞凋亡率達(dá)到0.55。但是，Res對非活化的T淋巴細(xì)胞則幾乎沒有影響(Fig 1B)。

3.2 Res促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡體外利用純化的小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞建立活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模型。PI單染結(jié)果(sub G1峰)顯示，與正常組相比，anti-CD3抗體再刺激導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，而Res孵育則讓細(xì)胞對凋亡更加敏感，T淋巴細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度和啟動速度都明顯高于對照組(Fig 2)。

此外，我們在Jurkat細(xì)胞上也建立了活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模型。Annexin V/PI雙染實驗顯示，PMA/離子霉素刺激誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，而Res孵育則劑量依賴性地促進(jìn)早期凋亡進(jìn)一步發(fā)生(Fig 3)。

3.3 Res通過Caspase通路促進(jìn)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡為探討Res促進(jìn)活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式，我們檢測了Caspase 3和PARP的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Res共孵后，Jurkat細(xì)胞中剪切形式的Caspase 3和PARP增加(Fig 4A)，而這種增加可以被Caspase抑制劑逆轉(zhuǎn)(Fig 4B)。同時，Caspase抑制劑的預(yù)處理也明顯抑制了Res的促凋亡作用(Fig 4C)。

3.4 Res改善小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型EAE小鼠自d 11開始發(fā)病，發(fā)病率為37.5%，d 12就已超過50%，并在d 15達(dá)到100%，小鼠體質(zhì)量也從模型發(fā)病時開始降低。自免疫當(dāng)天起每天灌胃給予Res(100 mg·kg-1)干預(yù)，并考察其對小鼠EAE的影響，包括體質(zhì)量變化以及臨床評分。如Fig 5A所示，給藥組小鼠盡管也從d 11開始發(fā)病，但發(fā)病率只有12.5%，d 14才達(dá)到50%；給藥組小鼠發(fā)病引起的體質(zhì)量變化總體趨勢與模型組一致，雖差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但從圖中可以看出較模型組相比更為緩和；給藥組小鼠的臨床評分從d 17開始明顯低于模型組(P<0.05)，并一直維持到d 20。HE染色結(jié)果表明，Res可以減少小鼠脊髓中炎性細(xì)胞的浸潤和“血管套”樣病變(Fig 5B)。

Fig 1 Dose-effect of Res on apoptosis in activated T lymphocytes (A) and na?ve T cells (B)

Fig 2 Effect of Res on activation-induced cell death of CD4+ T cells

Fig 3 Effect of Res on activation-induced cell death of Jurkat cells

Fig 4 Res enhanced Caspase signaling cascades

在模型進(jìn)展高峰期(d 18)，收集溶劑對照組和給藥組小鼠的脾臟和引流淋巴結(jié)，分離純化CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并加1 mg·L-1anti-CD3抗體再刺激24 h，檢測細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果表明，給藥組小鼠CD4+T細(xì)胞凋亡比例相較于溶劑對照組有所增加，但在anti-CD3抗體的誘導(dǎo)下，凋亡水平明顯升高，說明給藥組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更敏感(Fig 6)。

Fig 5 Res relieved development of

4 討論

我們的研究表明Res可以選擇性誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞凋亡，而對非活化T淋巴細(xì)胞沒有影響，同時還能讓T淋巴細(xì)胞對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感。Res促進(jìn)凋亡的機(jī)制與Caspase-3和PARP的剪切密切相關(guān)。Caspase-3在凋亡信號通路的終末端被剪切激活并發(fā)揮作用，其最主要的底物是PARP[10]。PARP是DNA損傷的感受器，參與DNA損傷修復(fù)，而在凋亡過程中，PARP被剪切失活，使細(xì)胞更加不穩(wěn)定[11]。我們利用Caspase抑制劑發(fā)現(xiàn)Res的促凋亡效應(yīng)被明顯逆轉(zhuǎn)。這樣的選擇性作用對于免疫性疾病的治療意義重大，因為免疫性疾病大多需要長期服藥，包括環(huán)孢素A、糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的很多免疫抑制劑因其非選擇性作用常發(fā)生嚴(yán)重的毒副作用[12-13]。

Fig 6 Res promoted activation-induced cell death of CD4+ T lymphocytes in EAE

A:The apoptosis of CD4+T lymphocytes was measured by flow cytometry;B:Quantification of apoptosis level as in A.*P<0.05vsVehicle-treated-anti-CD3-;△P<0.05vsRes-treated-anti-CD3-;##P<0.01vsVehicle-treated-anti-CD3+.

此外，我們還在小鼠EAE模型上考察了Res對免疫性疾病的治療效果。MS是一種慢性自身免疫病，主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變[14]。炎癥反應(yīng)在MS的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了重要作用[15]，因為其發(fā)病機(jī)制主要由T細(xì)胞介導(dǎo)。T細(xì)胞首先被CNS的自身抗原活化，穿過血腦屏障激活小膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞不僅可以直接損傷神經(jīng)纖維周圍的髓鞘，還能誘導(dǎo)構(gòu)成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡[16]。EAE是目前研究MS的最佳動物模型。我們的研究表明口服Res可以明顯改善模型的各種癥狀，包括延緩小鼠發(fā)病時間、抑制模型嚴(yán)重程度、緩解由于小鼠發(fā)病引起的體質(zhì)量下降，并能減少小鼠脊髓中炎性細(xì)胞的浸潤，同時給藥組小鼠也未見食欲匱乏、行動遲緩等癥狀，提示并不存在明顯副作用。此外，給藥組小鼠體內(nèi)的CD4+T淋巴細(xì)胞對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感。接下來，我們將從Caspase-3入手進(jìn)一步探究Res誘導(dǎo)EAE小鼠中活化T淋巴細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

綜上所述，Res可以通過激活Caspase-3選擇性促進(jìn)活化T淋巴細(xì)胞凋亡，并使其對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更敏感，同時在動物模型中也顯示出良好的治療效果。這不僅揭示了Res的作用特點，也提示選擇性促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡用于治療自身免疫疾病具有可行性。