鹽度對(duì)不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦生理生化及蛻皮相關(guān)基因表達(dá)的影響

黎蘭詩，戴習(xí)林*

（1水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306；2水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）屬大型的淡水蝦類，具有生長快、養(yǎng)殖周期短、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，是我國主要的淡水蝦養(yǎng)殖品種（姜建萍等，2019）。甲殼動(dòng)物在生長發(fā)育過程中均需要經(jīng)歷多個(gè)蛻皮周期，主要分為蛻皮后早期A、蛻皮后晚期B、蛻皮間期C、蛻皮前期D和蛻皮期E（葉城凱等，2019）。在高密度集約化養(yǎng)殖環(huán)境中，甲殼動(dòng)物處于蛻皮期時(shí)，是其整個(gè)生命最脆弱的階段，也是最容易發(fā)生同類相殘的時(shí)候（Abu et al.，2020），水產(chǎn)生物經(jīng)常受到生存環(huán)境中各種環(huán)境因子的刺激，從而使其蛻皮生理生化指標(biāo)等發(fā)生變化，延長了生產(chǎn)周期，經(jīng)濟(jì)效益下降，因此，研究環(huán)境因子與甲殼動(dòng)物蛻皮之間的關(guān)系尤為重要（李江濤等，2021；李安涵，2020）。監(jiān)測環(huán)境脅迫下蝦類的生理變化，確保蝦類處于最佳的養(yǎng)殖環(huán)境，是蝦類集約化養(yǎng)殖的重點(diǎn)。因此，研究鹽度對(duì)不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦生理生化及蛻皮相關(guān)基因表達(dá)的影響對(duì)羅氏沼蝦培育具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】鹽度作為蝦類養(yǎng)殖環(huán)境的一個(gè)重要理化因子，與蝦類的滲透壓、能量代謝和行為等密切相關(guān)（Chand et al.，2015）。能量代謝最主要的途徑包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等。三羧酸循環(huán)將葡萄糖氧化為機(jī)體提供能量，琥珀酸脫氫酶（Scinate dhydrogenase，SDH）活力大小可反映有氧代謝水平（戴超等，2013）。丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）是最典型的限速調(diào)節(jié)酶，在糖酵解的過程中主要作用是控制速率，其活力的大小在一定程度可直觀體現(xiàn)糖酵解的能力（Laiz-Carrión et al.，2003）。蛻皮抑制激素（Molt-inhibiting hormone，MIH）、蛻皮激素受體（Ecdysteroid receptor，EcR）、維甲酸X受體（Retinoid X receptor，RXR）和保幼激素酯酶環(huán)氧水解酶（Juvenile hormone epoxide hydrolase，JHEH）等酶基因的相對(duì)表達(dá)量在很大程度上體現(xiàn)羅氏沼蝦在不同鹽度條件下蛻皮情況的差異，也有利于判斷羅氏沼蝦在鹽度脅迫下的耐受程度（Gao et al.，2020）。目前，關(guān)于鹽度脅迫對(duì)羅氏沼蝦的影響主要集中在免疫（姜蘭等，2002）、代謝（鄒中菊等，2004）、行為與運(yùn)動(dòng)學(xué)（何竺柳等，2018）、生長和性別分化（鄔育龍等，2020）、基因克隆（楊光等，2020）及營養(yǎng)（周劍等，2021）等方面。近年來，研究者的目光更多聚焦于羅氏沼蝦蛻皮研究方面，如Kamaruding等（2017）將頭胸甲硬度與顆粒結(jié)構(gòu)和性腺發(fā)育情況相結(jié)合，詳細(xì)劃分羅氏沼蝦各個(gè)蛻皮時(shí)期；盧徐斌等（2018）比較了生長阻滯蝦與正常生長蝦的蛻皮周期及各蛻皮時(shí)期的鑒定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用第二游泳足置顯微鏡觀測的方法可從生理結(jié)構(gòu)的角度劃定蛻皮周期。在能量代謝方面，Lago-Lestón等（2007）分析溫度和鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦MIH基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示MIH基因在鹽度16.0‰時(shí)表達(dá)量最高，高鹽和低鹽均對(duì)其表達(dá)有極顯著影響；張俊功等（2020）運(yùn)用能量收支方程和凱氏定氮法計(jì)算羅氏沼蝦的蛻殼能、呼吸能和代謝能，并分析其在不同水溫及雌雄配比下能量代謝的變化；邱慶慶等（2020）成功克隆了羅氏沼蝦的EcR基因，檢測到EcR基因在雌蝦肝胰腺組織中廣泛表達(dá)，為研究EcR基因與生長發(fā)育調(diào)控作用提供理論依據(jù)；Kluebsoongnoen等（2020）研究發(fā)現(xiàn)維甲酸X受體是誘導(dǎo)母蝦卵細(xì)胞成功繁殖的重要手段，其通過與RARE結(jié)合調(diào)控Vg在蝦卵巢和肝胰腺中表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】目前很多研究主要是針對(duì)羅氏沼蝦蛻皮或環(huán)境因子進(jìn)行研究，主要集中在免疫營養(yǎng)的研究方面，關(guān)于能量代謝方向的研究較少。但在世界范圍內(nèi)廣泛存在土地鹽堿化、海水倒灌等不良環(huán)境因子，導(dǎo)致羅氏沼蝦養(yǎng)殖環(huán)境面臨低鹽脅迫的狀況，在探究甲殼動(dòng)物生理生化的同時(shí)，應(yīng)多考慮蛻皮等相關(guān)因素，但目前鮮見將理化因子與羅氏沼蝦蛻皮時(shí)期相結(jié)合的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過人工海水環(huán)境模擬鹽度脅迫條件，記錄羅氏沼蝦蛻皮生長等相關(guān)的生理指標(biāo)，對(duì)羅氏沼蝦的鰓、肝胰腺和肌肉進(jìn)行能量代謝酶活力測定，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)量，探討羅氏沼蝦生長蛻皮與能量代謝酶的相關(guān)性，以及不同鹽度對(duì)羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)基因表達(dá)的影響，為羅氏沼蝦的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蝦來源及暫養(yǎng)管理

挑選300只無病、健壯的蝦作為試驗(yàn)蝦，平均初始濕體質(zhì)量為4.28±0.53 g/尾，均由上海市申漕特種水產(chǎn)有限公司提供。吸水紙吸干蝦體水分，游標(biāo)卡尺測量蝦體長度，電子天平測量蝦體質(zhì)量，試驗(yàn)蝦初始平均體質(zhì)量為4.28±0.53 g，試驗(yàn)前放入室內(nèi)暫養(yǎng)水泥池（3.50 m×7.15 m×1.10 m）進(jìn)行一周的暫養(yǎng)，試驗(yàn)全程采用充分曝氣的自來水，水溫為26℃，pH弱堿性，光照周期為14 L∶10D，連續(xù)充氣，每天定時(shí)（7：00，16：00）投喂飼料兩次，飼料投喂量為體重的2%，每天吸取殘餌，暫養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)移至藍(lán)色塑料箱（50 cm×60 cm×70 cm）進(jìn)行正式試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及鹽度馴化

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)鹽度梯度，分別為0.2‰（對(duì)照）、3.0‰、6.0‰、9.0‰和12.0‰。每個(gè)梯度設(shè)5個(gè)重復(fù)，將試驗(yàn)蝦逐個(gè)放入試驗(yàn)箱內(nèi)，每個(gè)蝦體用自制的小網(wǎng)兜隔開飼養(yǎng)，以便于觀察蛻皮。試驗(yàn)用鹽為商用海水晶，以每日提升3.0‰的鹽度至目標(biāo)鹽度。將商品溫控裝置放置于每個(gè)試驗(yàn)箱中，初始水溫為24℃，將水溫升至26℃后維持該溫度。每隔2 d換水1次，吸取箱底多余殘餌。

試驗(yàn)環(huán)境與暫養(yǎng)時(shí)的條件保持一致，對(duì)每只蝦體進(jìn)行依次編號(hào)并設(shè)計(jì)記錄表格，每箱放置12尾試驗(yàn)蝦，每隔6 h觀察1次，發(fā)現(xiàn)蛻皮后及時(shí)取出，以每只蝦完整經(jīng)歷1次蛻皮開始記錄，2次連續(xù)的蛻皮之間的時(shí)間設(shè)為一個(gè)完整的蛻皮周期，記錄蛻皮周期、蛻皮時(shí)間、蛻皮次數(shù)及蛻皮后的體質(zhì)量。此次試驗(yàn)記錄3種蛻皮時(shí)期，包括蛻皮前期D、蛻皮后期（A、B）和蛻皮間期C）。蛻皮時(shí)期判斷采用以顯微鏡觀察為主，以外部腸道攝食情況、蝦運(yùn)動(dòng)活躍、頭胸甲的軟硬程度情況為輔助判斷的方法，顯微鏡觀察時(shí)，取游泳足末端置于顯微鏡下觀察。

1.3 樣品采集及蛻皮測定

在各鹽度組中，當(dāng)試驗(yàn)蝦蛻皮時(shí)期分別達(dá)到A、B、C、D期時(shí)取樣，同一鹽度組取不同時(shí)期試驗(yàn)蝦12只。取樣時(shí)用吸水紙吸干蝦體水分，游標(biāo)卡尺測量蝦體長度，電子天平測量蝦體質(zhì)量，在冰盒中迅速解剖，取肝胰腺、胃、肌肉、眼柄和鰓，放入1.5 mL離心管中，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍保存。羅氏沼蝦蛻皮周期為從蛻皮后期A到蛻皮前期D。蛻皮頻率（%）=蛻皮總次數(shù)/（飼養(yǎng)天數(shù)×每箱尾數(shù)）；蛻皮增重率（%）=（二齡蝦體平均體質(zhì)量-一齡蝦體平均體質(zhì)量）/一齡蝦體平均體質(zhì)量×100。

1.4 能量代謝相關(guān)生化指標(biāo)測定

測定的生化指標(biāo)包括PK、SDH及總蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定，其中，PK用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，波長為340 nm。SDH和總蛋白含量用可見光分光光度計(jì)進(jìn)行測定，SDH檢測波長600 nm。具體測定方法參考說明進(jìn)行操作。

PK和SDH活性測定的組織樣本為鰓絲、肌肉和肝胰腺。分別取0.1 g上述組織放入勻漿器中，用0.01 mol/L的PBS溶液作為PK和SDH提取液，研磨時(shí)加入9倍體積的提取液，在冰上充分研磨，勻漿液倒入1.5 mL離心管中，2500 r/min 4℃離心10 min，取上清放冰上待測。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

利用TRIzol試劑（TaKaRa）分別提取鰓絲、肝胰腺和肌肉的總RNA。然后按照FastKing-RT Supermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。利用Fast-Fire qPCR PreMix SYBR Green［天根生化科技（北京）有限公司］，qRT-PCR檢測蛻皮相關(guān)基因JHEH、EcR、RXR和MIH的相對(duì)表達(dá)量，在LightCycler?Real-Time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。以β-actin為內(nèi)參基因，每對(duì)引物的效率值均為90%～110%。反應(yīng)體系20.0μL：2×FastFire qPCR PreMix 10.0μL，500 ng/μL cDNA模板0.5μL，10μmol/μL正、反向引物各0.6μL，無核酸酶水8.3μL。擴(kuò)增程序：95℃180 s；95℃5 s，60℃10 s，72℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因重復(fù)3次，通過熔解曲線分析檢測每對(duì)引物的特異性。用2-ΔΔCt法計(jì)算蛻皮相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以鹽度和蛻皮分期為主要要因素進(jìn)行Two-ANOVA分析，采用Duncan和LSD法進(jìn)行多重比較，GraphPad Prism 8.3.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對(duì)羅氏沼蝦蛻皮周期、每日蛻皮率、蛻皮增重率和體質(zhì)量的影響

不同鹽度下，羅氏沼蝦的蛻皮周期、每日蛻皮率、體質(zhì)量和蛻皮增重率如表1所示。不同鹽度對(duì)羅氏沼蝦的蛻皮周期、每日蛻皮率、體質(zhì)量和蛻皮增重率有不同程度的影響，其中，蛻皮周期總體上隨鹽度的增加而逐步延長，以6.0‰鹽度組的蛻皮周期最長，顯著高于0.2‰和3.0‰鹽度組（P＜0.05，下同），但與9.0‰和12.0‰鹽度組差異不顯著（P＞0.05，下同）；9.0‰鹽度組每日蛻皮率達(dá)29.30%，顯著高于其他鹽度組，0.2‰、3.0‰、6.0‰和12.0‰鹽度組的每日蛻皮率差異均不顯著；羅氏沼蝦蛻皮增重率隨著鹽度的升高呈波動(dòng)式變化趨勢，0.2‰鹽度組和3.0‰鹽度組的蛻皮增重率顯著高于其他鹽度組，以6.0‰鹽度組的蛻皮增重率最低。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 Information of qRT-PCR primers sequences

2.2 鹽度對(duì)不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦肝胰腺中PK和SDH活力的影響

整個(gè)試驗(yàn)過程中各個(gè)處理組未發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦死亡或者蝦體活動(dòng)異常的情況。不同鹽度下，羅氏沼蝦不同蛻皮時(shí)期肝胰腺PK和SDH活力如圖1所示。在5個(gè)鹽度下，蛻皮后羅氏沼蝦肝胰腺中PK和SDH活力均先升高，在蛻皮后期B達(dá)最大值，隨著鈣化時(shí)間的延長，總體呈下降趨勢。3.0‰、6.0‰、9.0‰鹽度組中，蛻皮后期B的羅氏沼蝦肝胰腺PK和SDH活力顯著高于蛻皮前期A和蛻皮間期C，但在12.0‰鹽度組，羅氏沼蝦肝胰腺PK和SDH活力受到明顯抑制，各個(gè)時(shí)期差異不顯著。除12.0‰鹽度組外，隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦肝胰腺中PK和SDH活力總體呈升高趨勢。在9.0‰鹽度組時(shí)，蛻皮后期A的SDH活力和蛻皮后期B的PK活力達(dá)最大值。

2.3 鹽度對(duì)不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦鰓絲PK和SDH活力的影響

由圖2-A可知，在5個(gè)鹽度下，羅氏沼蝦鰓絲的PK活力隨蛻皮后期A到蛻皮前期D整體呈下降趨勢，除12.0‰鹽度組外，其余鹽度組均在蛻皮后期A達(dá)最大值，在蛻皮間期C或蛻皮前期D為最小值，顯著低于其他蛻皮時(shí)期PK活力。在同一蛻皮時(shí)期，隨著鹽度升高，羅氏沼蝦鰓絲PK活力總體呈先升高后降低的趨勢。由圖2-B可看出，在0.2‰鹽度組中羅氏沼蝦鰓絲的SDH活力在蛻皮后期B達(dá)最大值，且顯著高于其他鹽度組蛻皮后期B的SDH活力；在5個(gè)鹽度下，羅氏沼蝦鰓絲SDH活力隨著蛻皮后時(shí)間的延長總體呈下降趨勢，各鹽度組最大值均出現(xiàn)在蛻皮后期A或者蛻皮后期B，高于其他蛻皮時(shí)期。除3.0‰和6.0‰鹽度組外，在其余的同一鹽度組中，隨著蛻皮后時(shí)間的延長，羅氏沼蝦鰓絲SDH活力總體呈先上升后下降趨勢。經(jīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，鹽度和蛻皮時(shí)期的雙因子交互作用對(duì)羅氏沼蝦鰓絲的PK和SDH活力影響達(dá)極顯著（P＜0.01）。

表2 不同鹽度條件下羅氏沼蝦蛻皮周期、每日蛻皮率和蛻皮增重率Table 2 Molting cycle，daily molting rate and molting weight gain rate of M.rosenbergii under different salinity conditions

2.4 鹽度對(duì)不同蛻皮時(shí)期羅氏沼蝦肌肉PK和SDH活力的影響

由圖3-A可看出，在3.0‰、6.0‰、9.0‰和12.0‰鹽度組中，羅氏沼蝦肌肉的PK活力隨著蛻皮后時(shí)間的延長，總體呈先升高后降低的趨勢，且在9.0‰鹽度組蛻皮間期C時(shí)達(dá)最大值，而在0.2‰鹽度組下則隨著蛻皮時(shí)間延長而下降的趨勢，在蛻皮間期C和蛻皮前期D達(dá)最小值，顯著低于同組其他蛻皮時(shí)期；在同一蛻皮時(shí)期，各鹽度組羅氏沼蝦肌肉PK活力呈逐漸升高再降低的趨勢，在6.0‰鹽度組下，蛻皮后期B的PK活力顯著高于其他鹽度組。由圖3-B可看出，除12.0‰鹽度組外，其余4個(gè)鹽度組的羅氏沼蝦肌肉SDH活力均隨蛻皮時(shí)間的延長均呈先上升再下降的趨勢，且各鹽度組在蛻皮后期B達(dá)最大值，但在12.0‰鹽度組中，蛻皮前期D的SDH活力突然升高，顯著高于同組蛻皮間期C的SDH活力；在同一蛻皮時(shí)期，各鹽度組SDH活力總體在鹽度3.0‰時(shí)先下降，然后又上升。經(jīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，鹽度和蛻皮時(shí)期的雙因子交互作用羅氏沼蝦肌肉的PK和SDH活力影響差異極顯著（P＜0.01）。

2.5 鹽度對(duì)羅氏沼蝦肝胰腺M(fèi)IH和RXR基因表達(dá)的影響

由圖4-A可知，MIH基因在各鹽度組的相對(duì)表達(dá)量均隨蛻皮后時(shí)間的延長明顯下降，且在0.2‰鹽度組和3.0‰鹽度組蛻皮后期A和蛻皮后期B的相對(duì)表達(dá)量顯著高于蛻皮間期C（P＜0.05），而在6.0‰和12.0‰鹽度組蛻皮后期A和蛻皮后期B的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001），在3.0‰和9.0‰鹽度組蛻皮前期D的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于0.2‰鹽度組（P＜0.001）。由圖4-B可知，除9.0‰鹽度組外，其余鹽度組中RXR基因在蛻皮間期C的相對(duì)表達(dá)量最高，0.2‰和12.0‰鹽度組在蛻皮前期、蛻皮后期的RXR基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于蛻皮間期C（P＜0.001）。只在6.0‰和9.0‰鹽度組中，蛻皮前期D時(shí)RXR基因相對(duì)表達(dá)量較蛻皮間期C差異不顯著。

2.6 鹽度對(duì)羅氏沼蝦鰓絲JHEH和EcR基因表達(dá)的影響

由圖5-A可知，除12.0‰鹽度組外，其余4個(gè)鹽度組JHEH基因的相對(duì)表達(dá)量均在蛻皮后期A或蛻皮后期B最高，其中，3.0‰鹽度組JHEH基因在蛻皮后期A和蛻皮后期B的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001），其他3個(gè)鹽度組均在蛻皮后期A或蛻皮后期B極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001），但JHEH基因在12.0‰鹽度組蛻皮前期D的相對(duì)表達(dá)量較高，極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001）。由圖5-B可知，0.2‰鹽度組中，EcR基因在蛻皮前期D的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001），在蛻皮后期A和蛻皮后期B的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于蛻皮間期C（P＜0.01），但在3.0‰和9.0‰鹽度組時(shí)，EcR基因在蛻皮后期B的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于蛻皮間期C（P＜0.001）。

3 討論

蛻皮是甲殼動(dòng)物實(shí)現(xiàn)生長的重要方式，其生長為跳躍式生長，每蛻殼一次，個(gè)體明顯增大，體重也成倍增加（宋宗巖等，2002；徐建榮等，2006）。羅氏沼蝦同其他甲殼動(dòng)物一樣，生長呈現(xiàn)出不連續(xù)狀態(tài)，通過每次蛻皮來實(shí)現(xiàn)生長（楊明和丁福江，2021）。已有研究證實(shí)，鹽度環(huán)境的變化會(huì)影響蝦類的生長和生理（Li et al.，2019）。董蘭芳等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，不同鹽度對(duì)中國鱟幼鱟生長、蛻殼率和增重率產(chǎn)生不同程度的影響，即隨鹽度升高，這些指標(biāo)均呈降低的趨勢。此外，許多物種均對(duì)鹽度有一定程度的適應(yīng)性，但不同物種的鹽度適應(yīng)性和最佳存活性存在明顯差異。同一物種不同蛻皮時(shí)期對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍也有很大差異，如高鹽度27‰和30‰組的克氏原螯蝦死亡率顯著高于鹽度0對(duì)照組，且隨著鹽度升高蛻殼死亡率逐漸下降，在鹽度21‰組時(shí)達(dá)最大值（劉棟梁等，2020）。本研究在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦在不同鹽度不同蛻皮時(shí)期的采食量存在明顯差異，且蛻皮后期B的采食量最大。Juneta-Nor等（2020）研究也發(fā)現(xiàn)，蛻皮后期A的平均采食量為（42±1.13）%，蛻皮后期B的平均采食量為（80.2±0.73）%，蛻皮前的平均采食量為（61.1±3.04）%，即蛻皮后期B的采食量最大，與本研究觀察的結(jié)果一致。在鹽度驟變試驗(yàn)中，鹽度對(duì)南極大磷蝦存活率的影響具有顯著作用，南極大磷蝦存活的適宜鹽度為30‰～42‰，以（34±0.4）‰為基礎(chǔ)鹽度，鹽度在特定范圍內(nèi)升高時(shí)會(huì)增強(qiáng)南極大磷蝦的蛻殼率，而隨鹽度的下降，蛻殼率逐漸降低（趙國慶等，2018）。龍曉文等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，鹽度對(duì)脊尾白蝦的蛻殼周期有一定影響，12.0‰鹽度組的平均蛻殼周期最長（9.57 d），0鹽度組的平均蛻殼周期相對(duì)較短（8.47 d）。此外，在斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）（楊其彬等，2008）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（路良允等，2012）、青蟹（Scylla serrata）（于忠利等，2010）等甲殼動(dòng)物也開展了相關(guān)的研究，雖然研究結(jié)果存在差異，但主要趨勢較一致，即不適鹽度會(huì)阻滯甲殼動(dòng)物蛻皮的過程，蛻皮周期相對(duì)延長，增重率和特定生長率下降。本研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦的蛻皮周期總體隨鹽度的升高而逐漸延長，在鹽度6.0‰條件下，蛻皮周期最長；隨著鹽度的升高，羅氏沼蝦的蛻皮增重率整體呈下降趨勢，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述研究的結(jié)論。

能量代謝酶是甲殼動(dòng)物調(diào)控能量代謝過程重要的蛋白質(zhì)物質(zhì)，其活力受鹽度的影響，在不適鹽度時(shí)其活力大大下降。糖代謝是動(dòng)物能量代謝的一個(gè)重要過程，葡萄糖首先被糖酵解為丙酮酸，為機(jī)體提供能量。PK是糖酵解過程中重要的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，也是重要的限速酶，PK活力能反映糖酵解的水平（戴超等，2013）。海水養(yǎng)殖條件下，凡納濱對(duì)蝦在蛻皮后期A和蛻皮后期B的PK活力為150.67和164.5 U/g prot，而在蛻皮間期C的活力下降，在蛻皮前期D1和D2達(dá)最高，而在淡水條件下PK活力在蛻皮后期B最高（丁森，2010）。本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽度（0.2‰、3.0‰、6.0‰）組肝胰腺、鰓絲和肌肉的PK活力在蛻皮后不斷升高，在蛻皮后期A或B時(shí)，其PK活力最高，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述研究的結(jié)論。可見，在低鹽度的情況下，糖酵解受到低鹽度刺激后速率加快，進(jìn)而促進(jìn)了ATP生成和NAD＋再生，而在高鹽度情況下，PK活力下降，糖酵解受到抑制。隨鹽度的驟降和脅迫時(shí)間的延長，云紋石斑魚鰓絲的SDH活力在低鹽度組均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第7 d SDH活力隨鹽度的降低而降低（施兆鴻等，2017）。鹽度升高使加州扁鳥蛤的SDH活力呈下降趨勢（聶鴻濤等，2018）。本研究結(jié)果顯示，羅氏沼蝦肝胰腺的SDH活力隨著鹽度的升高呈先升高后降低的趨勢，不適鹽度抑制了其肝胰腺的SDH活力，與上述研究結(jié)果相似。而周小愿等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦肌肉SDH活力在鹽度33‰、63‰、93‰條件下，隨著蛻皮時(shí)間增加而先下降后上升的趨勢，說明肌肉的三羧酸循環(huán)作用不斷加強(qiáng)，彌補(bǔ)了在蛻皮后期時(shí)糖酵解速率的加大而導(dǎo)致能量不足的原因。表明羅氏沼蝦肌肉SDH活力符合變溫動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)償機(jī)制，當(dāng)外界環(huán)境變化時(shí)，動(dòng)物體通過調(diào)整有氧代謝來適應(yīng)環(huán)境變化。

由于孫海峰（2017）研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦蛻皮相關(guān)基因在肝胰腺和鰓絲中皆有表達(dá)，因此本研究選取肝胰腺和鰓絲組織作為采樣對(duì)象。MIH是X器官-竇腺復(fù)合體分泌的神經(jīng)肽類激素家族中的一種，EcR在MIH基因上游啟動(dòng)子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)，說明MIH基因的表達(dá)水平受蛻皮激素的影響（Lu et al.，2000）。雖然本研究發(fā)現(xiàn)MIH基因在肝胰腺中的相對(duì)表達(dá)量隨著蛻皮后時(shí)間的延長而降低，但各鹽度組之間無顯著差異，說明鹽度因子不會(huì)影響MIH基因在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)，且EcR基因的相對(duì)表達(dá)量在蛻皮前期較高，說明了蛻皮激素受體反向影響了MIH基因的表達(dá)水平。在生長阻滯蝦EcR基因的相對(duì)表達(dá)量低于正常蝦，生長阻滯蝦MIH基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常蝦（孫海峰，2017），與本研究結(jié)論相符。JHEH和RXR對(duì)甲殼動(dòng)物的生長發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用（Bainbrideg，1984）。本研究發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦肝胰腺RXR基因的相對(duì)表達(dá)量在蛻皮間期C最高，鰓絲JHEH基因的相對(duì)表達(dá)量在蛻皮后期最高，說明羅氏沼蝦在蛻皮后及蛻皮間期是生長最快的階段，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述研究的結(jié)論。此外，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)水體鹽度不斷升高時(shí)，對(duì)羅氏沼蝦的蛻皮生理生化指標(biāo)、能量代謝酶活力及蛻皮相關(guān)基因表達(dá)量均有較大影響，且均趨于對(duì)蛻皮不利的結(jié)果，當(dāng)水體鹽度在12.0‰以上時(shí)會(huì)造成蝦體蛻皮困難，最終導(dǎo)致死亡的情況。

4 結(jié)論

低鹽度（0.2‰～9.0‰）對(duì)羅氏沼蝦的生長蛻皮有較大影響，導(dǎo)致蛻皮增重率下降，蛻皮周期變長，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐產(chǎn)生負(fù)面影響，還可使羅氏沼蝦肌肉和肝胰腺中的PK和SDH活力升高，從而促使肝胰腺和肌肉中的糖酵解速率加快，三羧酸循環(huán)作用加強(qiáng)，但在高鹽度（12.0‰）條件下受到抑制。鹽度脅迫下，MIH基因上調(diào)表達(dá)、EcR基因下調(diào)表達(dá)會(huì)引發(fā)蛻皮前期D時(shí)間延遲，蛻皮困難，致使JHEH和RXR基因表達(dá)下調(diào)，是導(dǎo)致羅氏沼蝦生長緩慢的主要原因。羅氏沼蝦養(yǎng)殖適宜的水體鹽度為0.2‰～3.0‰。