馬氏珠母貝TLRP基因克隆及其功能研究

張美珍，王志新，吳羽媛，梁海鷹

（廣東海洋大學水產學院，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類重要的模式識別受體，在炎癥發生、促免疫分子表達、免疫細胞成熟、配體識別、調節免疫應答及抗病毒感染等方面發揮重要作用（唐深和冷靜，2004；唐沙等，2021）。TLRP（Toll-like receptor protein）屬于TLRs家族成員之一，但其序列特征和功能尚未清楚。因此，克隆TLRP基因cDNA序列并進行表達特征分析，可為后續研究TLRP基因功能提供理論依據。【前人研究進展】TLRs家族種類較多，按細胞定位可分為細胞表面TLRs和細胞內TLRs。其中，細胞表面TLRs包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要識別脂多糖、脂蛋白等微生物膜 成 分；細 胞 內TLRs包 括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，主要識別細菌和病毒 的 核酸（Manavalan et al.，2011；Kawasaki and Kawai，2014）。除上述TLRs外，近年來在魚類中還鑒定出特有的TLR27（Wang et al.，2015）。TLRs主要由三大部分組成，包括富含亮氨酸重復序列（Leucine rich repeats，LRRs）的胞外區、跨膜結構域（Transmembrane region，TM）及含有與白介素-1受體高度同源的TIR結構域（Toll/I L-1receptor domain）的胞內區（唐雪穎，2018），其中，LRRs的數量和序列特征決定了TLRs特異性識別病原的模式識別受體（Pattern-recognition receptors，PAMPs），TIR結構域可招募MyD88和TRIF等接頭蛋白，激活下游信號通路，從而啟動免疫反應（Narayanan and Park，2015；尹淑園，2020）。已有研究發現，鰻弧菌感染短蛸后，其肝臟中的TLR13基因表達量升高且在感染后24 h達最大值，暗示該基因參與鰻弧菌病變過程（周建波等，2019）；大彈涂魚感染鰻弧菌后TLR5基因在其肝臟和脾臟中的表達量均呈先增加后減少的變化趨勢，說明TLR5基因在細菌刺激下能產生一定的應激反應（劉坪等，2020）；細粒棘球蚴感染小鼠肝臟組織后，TLR2基因表達量增加且出現明顯的炎癥癥狀（王金龍，2020）。可見，TLRs在不同物種的免疫防御反應中扮演著重要角色。【本研究切入點】馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國海水珍珠養殖的主要貝類之一，具有極高的經濟價值。近年來，因海水水質日益惡化導致馬氏珠母貝各種病害頻繁發生，產珠能力及珍珠質量呈現下降趨勢（何軍軍等，2019）；在馬氏珠母貝植核過程中通常會帶入大量病原體引起受體貝的強烈免疫應答，而導致吐核甚至死亡（Wang et al.，2017）。在細菌感染或植核后，馬氏珠母貝部分免疫相關基因和蛋白會發生顯著變化，其中TLRs發揮著重要作用（Wang et al.，2017，2019）。本課題組前期已完成馬氏珠母貝基因組測序、組裝和注釋（Du et al.，2017），在基因組中發現多個TLRs基因，鑒定出TLR2（師尚麗等，2014）、TLR3（汪歡，2012）、TLR4（Wu et al.，2017）、TLR6（吳羽媛等，2017）和TLR13（吳羽媛等，2018），并進行初步分析，但仍有部分TLRs基因尚未得到鑒定。【擬解決的關鍵問題】通過RACE克隆馬氏珠母貝TLRP基因（PmTLRP）cDNA序列，并運用實時熒光定量PCR檢測PmTLRP在馬氏珠母貝各組織中的表達情況和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）刺激、植核及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后的表達模式，為進一步研究TLRs在馬氏珠母貝中的免疫機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2齡馬氏珠母貝取自廣東省湛江市徐聞養殖場，在實驗室海水中暫養7 d后挑選活性強、規格相近的馬氏珠母貝進行后續試驗。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司；rTaqDNA聚合酶、反轉錄試劑盒、pMD19-T載體及Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）等購自Ta-KaRa公司；純化回收試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司；SYBR?Select Master Mix和TRIzol購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 cDNA合成

采用TRIzol法提取馬氏珠母貝肝胰腺等6個組織總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度及純度；然后參照RACE試劑盒說明制備3′-RACE和5′-RACE模板，同時按照RNase H說明合成cDNA模板。

1.3 PmTLRP基因cDNA序列克隆

從本課題組前期構建的馬氏珠母貝珍珠囊轉錄組文庫中篩選出注釋為TLR的Unigenes序列，并設計特異性引物（表1）。運用巢式PCR擴增5′和3′末端，普通PCR擴增中間片段。擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后回收目的基因進行純化，連接至pMD19-T載體，再轉化Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞，以LA固體培養基（含Amp+）進行過夜培養。挑取陽性單克隆菌落，接種至LB液體培養基中培養6 h后進行菌落PCR鑒定，將陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司廣州測序部測序。

1.4 生物信息學分析

測序結果和Unigenes序列采用DNAMAN進行比對分析，而拼接得到PmTLRP基因cDNA序列，以ORF Finder在線預測其氨基酸序列；采用ExPASy的ProtParam和ProtScale預測PmTLRP蛋白分子量、理論等電點（pI）及其親/疏水性；利用SignalP 4.0和TMHMM v.2.0分別預測其信號肽及跨膜結構域；運用SMART、SoftBerry Psite和SOPMA預測PmTLRP蛋白的結構域、序列功能位點及其二級結構；經TLRs氨基酸多序列比對分析后，以MEGA X的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1.5 PmTLRP基因組織表達分析

選取10只活性強、規格一致的馬氏珠母貝，采集其血淋巴、外套膜、性腺、肝胰腺、閉殼肌和鰓組織，分別提取總RNA并反轉錄合成cDNA，以GAPDH基因為內參基因進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系10.0μL：cDNA模板0.5μL，SYBR?Select Master Mix 5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，滅菌ddH2O 3.7μL。擴增程序：95℃預變性5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃15 s，進行45個循環；添加1個熔解曲線（95℃10 s，60℃60 s，95℃1 s）；37℃延伸30 s。每個樣品設3個重復，每個組織進行3次生物學重復。

1.6 哈維氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表達情況

復蘇保存的哈維氏弧菌菌株，取20 mL菌液加入至800 mL的TSB培養基中振蕩培養至對數生長期，菌株以PBS洗滌3次后重懸于PBS。選取健康的馬氏珠母貝140只，分成哈維氏弧菌刺激組和PBS對照組，每組70只。采用閉殼肌注射法向哈維氏弧菌刺激組馬氏珠母貝注射哈維氏弧菌（1×107個/mL）進行誘導，100μL/只，對照組注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、6、8、12、16和24 h各處理組隨機選取10只馬氏珠母貝，抽取其血淋巴，4℃下3500 r/min離心5 min，收集血細胞，提取RNA并反轉錄合成cDNA。通過實時熒光定量PCR對Pm-TLRP基因進行定量分析，每個樣品重復3次。同時，對暫養1周的80只馬氏珠母進行植核試驗，分別抽取植核前（0 h）及植核后5、10、15、20和30 d的血淋巴，4℃下3500 r/min離心5 min，收集血細胞，提取總RNA并反轉錄合成cDNA，以實時熒光定量PCR對PmTLRP基因進行定量分析。

1.7 LPS刺激后PmTLRP基因在血細胞和肝胰腺中的表達情況

選取200只健康的馬氏珠母貝，分成LPS刺激組和PBS對照組，每組100只。采用從閉殼肌注射法向LPS刺激組馬氏珠母貝注射10μg/mL的LPS，100 μL/只，對照組注射等量PBS。于注射刺激前（0 h）及刺激后2、3、4、6、8、12、16、24和48 h各處理組隨機選取10只馬氏珠母貝，分別抽取血淋巴和采集肝胰腺，提取總RNA并反轉錄合成cDNA后，以實時熒光定量PCR對PmTLRP基因進行定量分析。

1.8 統計分析

以GAPDH基因的表達量為校對基準，采用2-ΔΔCt法換算PmTLRP基因相對表達量，并以SPSS 19.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 PmTLRP基因序列特征分析結果

測序結果和Unigenes序列經DNAMAN比對分析后拼接出PmTLRP基因cDNA序列全長為2214 bp，開放閱讀框（ORF）共編碼681個氨基酸殘基（圖1）；其5′非編碼區（5′-UTR）為33 bp，3′非編碼區（3′-UTR）為135 bp，且3′-UTR包含有27 bp的poly（A）尾巴和加尾信號序列AATAA。

2.2 PmTLRP蛋白理化性質分析結果

PmTLRP蛋白分子量為79.78 kD，理論等電點（pI）為5.66，不穩定系數為44.56，屬于不穩定蛋白。ProtScale預測發現，在第383位氨基酸達最大親水性，親水性系數為-2.956；在第440～441位氨基酸達最大疏水性，親水性系數為4.156；總平均親水性系數為-0.313，故確定為親水性蛋白（圖2）。PmTLRP蛋白在第12～34位和第423～445位氨基酸處存在跨膜結構域，且在N-末端存在信號肽序列；TMHMM v.2.0預測結果（圖3）表明，PmTLRP蛋白含有LRRs重復序列、跨膜結構域和TIR結構域。SoftBerry Psite功能位點預測發現，PmTLRP蛋白包含2個酪氨酸激酶磷酸化位點和CAAX box、3個cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶磷酸化位點與N-豆蔻酰化位點、7個N-糖基化位點、10個蛋白激酶C磷酸化位點、12個微體C-末端定位信號序列及13個酪蛋白激酶II磷酸化位點。SOPMA預測結果顯示，PmTLRP蛋白二級結構中的α-螺旋、β-轉角、延伸鏈、無規則卷曲分別占39.21%、4.70%、19.68%和36.42%；采用SWISS-MODEL預測得知PmTLRP蛋白三維結構與美洲牡蠣（Crassostrea virginica）TLP蛋白相似（圖4）。

2.3 多序列比對分析及系統發育進化樹構建

運用DNAMAN對PmTLRP氨基酸序列與歐洲扇貝（Pecten maximus）Tollo氨基酸序列（XP_03375 4674.1）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）Tollo氨基酸序列（XP_021374025.1）、美洲牡蠣TLP氨基酸序列（XP_022322147.1）、福壽螺（Pomacea canaliculata）TLR2氨基酸序列（XP_025114565.1）和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）TLR1氨基酸序列（DI511 60.1）進行多序列比對分析，結果（圖5）顯示，PmTLRP氨基酸序列與其他物種的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中與美洲牡蠣TLP氨基酸序列的相似度較高，為48.75%。基于TLRs氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹（圖6）也顯示，馬氏珠母貝與美洲牡蠣聚為一支，二者的親緣關系較近。

2.4 PmTLRP基因組織表達特征分析結果

實時熒光定量PCR檢測結果（圖7）發現，Pm-TLRP基因在馬氏珠母貝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鰓、性腺和閉殼肌中均有表達，以在外套膜、肝胰腺和血淋巴中的相對表達量較高，尤其是在肝胰腺中的相對表達量最高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P＜0.05，下同）。

2.5 哈維氏弧菌刺激及植核后PmTLRP基因在血淋巴中的表達情況

運用實時熒光定量PCR檢測PmTLRP基因在哈維氏弧菌刺激及植核后不同時期血淋巴中的表達情況，結果發現，在哈維氏弧菌刺激下，PmTLRP基因相對表達量在注射刺激后12 h開始上調，至注射刺激后16 h達最大值，約是注射刺激前（0 h）的19.0倍，其差異達極顯著水平（P＜0.01），但在注射刺激后24 h逐漸恢復至原有水平（圖8-A）。經植核刺激后，PmTLRP基因相對表達量在植核后5～20 d呈逐漸上升趨勢（圖8-B），但差異不顯著（P＞0.05），于植核后30 d達最大值，約是植核前（0 h）的6.4倍，二者差異顯著。

2.6 LPS刺激后PmTLRP基因在血淋巴和肝胰腺的表達情況

運用實時熒光定量PCR檢測PmTLRP基因在LPS刺激后不同時期血淋巴和肝胰腺中的表達情況，結果發現，經LPS刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母血淋巴中的相對表達量先上升后下降，至注射刺激后3 h達最大值，約是對照組的5.0倍（圖9-A），二者差異顯著；PmTLRP基因在馬氏珠母肝胰腺中的相對表達量呈升高→降低→升高→降低→升高的波動變化趨勢（圖9-B），至注射刺激后24 h相對表達量上調至最大值，約是對照組（0 h）的6.0倍。

3 討論

TLRs是病原微生物感染入侵后識別免疫系統PAMPs的關鍵分子，也是識別細胞損傷或死亡所產生內源性損傷相關分子模式的重要分子，更是連接先天性免疫與適應性免疫的重要橋梁（Lu et al.，2016；尹淑園，2020）。本研究成功克隆獲得PmTLRP基因cDNA序列并進行生物信息學分析，結果顯示，PmTLRP基 因cDNA序 列 全 長 為2214 bp，共 編 碼681個氨基酸殘基；PmTLRP蛋白分子量為79.78 kD，pI為5.66，屬于不穩定蛋白，含有信號肽、LRRs重復序列、跨膜結構域和TIR結構域，符合TLRs家族所具有的特征。PmTLRP氨基酸序列與其他物種的TLRs氨基酸序列存在一定相似性，其中與美洲牡蠣TLP氨基酸序列的相似度較高。

了解基因在不同組織器官中的表達模式是研究基因功能的基本手段之一（Cui et al.，2010）。本研究的實時熒光定量PCR檢測結果顯示，PmTLRP基因在馬氏珠母貝肝胰腺、鰓和血淋巴中高表達，與其他物種的表達模式類似，如青蛤TLR4和TLR13基因在血細胞中的相對表達量最高（Ren et al.，2016），厚殼貽貝新型TLRs在肝胰腺中的相對表達量高于在鰓組織中的相對表達量（Xu et al.，2018），厚殼貽貝McTLR2基因在血細胞中的表達量最高且顯著高于其他組織（Li et al.，2019）。在軟體動物中，肝胰腺、鰓和血細胞均是極其重要的免疫器官，其中，肝胰腺參與代謝和消化吸收，鰓可過濾水中的細菌和有害物質及抵御細菌和毒性物質（王志新等，2013）。PmTLRP基因在肝胰腺中高表達暗示其可能參與馬氏珠母貝免疫防御機制。

在貝類養殖過程中，微生物疾病危害可導致貝類死亡率增高，其中危害最嚴重的細菌性病原菌是弧菌（陳皓文，2005；方皓，2019；張穎雪等，2020）。哈維氏弧菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，是多種海洋魚類和無脊椎動物的病原體，主要通過包埋、侵襲宿主細胞，以及在宿主體內增殖和產生毒素等形式促使貝類發病（Zhang et al.，2020）。本研究采用實時熒光定量PCR檢測哈維氏弧菌刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達情況，結果發現Pm-TLRP基因相對表達量呈先上升后下降的變化趨勢，與鮸魚TLR5S基因（Huo et al.，2018）和海鱸TLR1基因（Li et al.，2018）經哈維氏弧菌刺激后在其肝臟中的表達趨勢基本一致，表達量上升可能是機體識別哈維氏弧菌或哈維氏弧菌在宿主細胞內大量繁殖并產生毒素所致；但也有研究發現經哈維氏弧菌刺激后TLR6基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達呈先上升后下降再上升趨勢（吳羽媛等，2017）。可見，哈維氏弧菌能激活TLRs參與應答，但表達趨勢存在差異。

LPS是在革蘭氏陰性菌細胞壁中發現的一種具有代表性的分子（Park and Lee，2013），能激活NFκB信號通路，使機體分泌相關因子而介導免疫反應。本研究通過探究LPS刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴和肝胰腺中的時序表達，結果發現PmTLRP基因在血淋巴中的相對表達量先上升后下降，而在肝胰腺中的相對表達量呈升高→降低→升高→降低→升高的波動變化趨勢，第2次上升可能是由于機體所受感染程度增加而產生更多的TLRP來抵御病害。血淋巴是通過吞噬、傷口修復等方式參與細胞免疫，以及分泌非特異性體液分子參與體液免疫，因此PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中呈先上升后下降的表達變化趨勢，與LPS刺激后TLR4基因在血淋巴中的表達趨勢（Wu et al.，2017）一致，表明LPS刺激下不同組織中PmTLRP基因表達存在差異。本研究還發現，經LPS刺激和哈維氏弧菌刺激后PmTLRP基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達趨勢相同，但前者的相對表達量在刺激后2 h開始上升，而后者在刺激后12 h才開始上升且最大值出現在刺激后16 h，說明不同刺激下PmTLRP基因在同一組織中均產生免疫效應但作用時間存在明顯差異。

植核是珍珠培育的關鍵步驟，是指向育珠貝內臟團中移植供體貝的細胞小片或珠核，通常會引起免疫排斥，嚴重時甚至導致育珠貝死亡（Wei et al.，2017），因此，檢測植核后馬氏珠母貝免疫相關基因在一段時間內的時序表達對開展移植免疫機制研究具有重要意義。本研究發現，PmTLRP基因相對表達量在植核后5 h即開始上升，可能與移植過程中切入外套膜組織造成的傷口有關（Adzigbli et al.，2020）。PmTLRP基因相對表達量在植核后5～30 d呈持續上升趨勢，且在植核后30 d達最大值。Jiao等（2019）研究表明，同種異體植核和異種植核30 d后馬氏珠母貝血淋巴中差異基因數量明顯增多，且異種植核較同種異體植核損傷程度高。故推測本研究中植核后30 d的PmTLRP基因相對表達量達最大值是傷口感染程度增加所導致。吳羽媛等（2017）研究發現，TLR6基因在馬氏珠母貝血淋巴中的表達最大值也是出現在植核后30 d，但TLR6基因表達量在植核后15 d才開始上升，說明植核能引起TLRs的免疫反應，但引起反應的時間有所差異。

4 結論

PmTLRP基因在馬氏珠母貝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鰓、性腺和閉殼肌中均有表達，但表達水平存在差異，經哈維氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明顯上調表達趨勢，說明TLRP在馬氏珠母貝的免疫防御反應中扮演重要角色。