香港牡蠣幼蟲運動、耗氧率、攝食率及趨光性研究

張興志，官俊良，何蘋萍，張立，李蔚，馬元，韋嬪媛，彭金霞

（廣西水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西南寧 530021）

0 引言

【研究意義】香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）俗稱大蠔，地方名“欽州大蠔”“北海生蠔”等，是我國牡蠣養殖的三大主導品種之一。香港牡蠣肉質鮮美，營養價值高，其中鈣含量接近牛奶，素有“海中牛奶”之美稱，“欽州大蠔”是廣西著名的原產地理標志產品。香港牡蠣目前年產量178.7萬t，占全國牡蠣總產量的32.95%，產值170多億元（農業農村部漁業漁政管理局，2021）。香港牡蠣是我國華南沿海及越南、文萊等“一帶一路”國家主要養殖經濟貝類品種，對漁民增收、脫貧致富作出了巨大的貢獻（張興志等，2019）。長期以來，香港牡蠣苗種主要來自于海區自然采苗（鐘方杰等，2014），廣西欽州灣茅尾海曾是我國最大的香港牡蠣天然采苗區（王如才，2004），苗種供應廣西、廣東及越南等東南亞國家。受場地老化、沿岸工業及城鎮化發展的影響，近十幾年來廣西傳統牡蠣采苗場苗種產量低（李堅明和劉堅紅，2008），且苗種質量良莠不齊、養殖周期長（2～3年），導致苗種長期短缺。人工孵化苗種應運而生，但苗種產量較低，遠遠不能滿足市場需求，急需開展生產過程可控且綠色高效的香港牡蠣苗種培育技術的研究與探索。因此，研究香港牡蠣幼蟲培育過程中的運動速度、耗氧率、攝食率及趨光性等關鍵參數，對牡蠣人工育苗的集約化、精準化管理具有重要的指導意義。【前人研究進展】明確幼蟲的生物學特點，實現貝類苗種高密度、集約化、高效率的苗種生產，是解決苗種緊缺的有效途徑。目前，學者們圍繞貝類幼蟲運動、攝食及趨光性等生物學特性開展了諸多研究。Wheeler等（2013）研究發現，牡蠣幼蟲傾向于向上游動，即使是在非常湍急的水流中，幼蟲也會向上游動，潛水反應次數減少。Qiu等（2015）研究了福建牡蠣（Crassostrea angulata）幼蟲的攝食行為和運動特點，并測定單個幼蟲的游泳速度、攝食率等關鍵參數，以此，構建了牡蠣苗種循環水高密度養殖設施。鄧正華等（2016，2018）描述了合浦珠母貝（Pinctada fucata）和珠母貝（Pinctada margaritifera）幼蟲的運動行為及攝食行為，并顯著提高了育苗效率。Wheeler等（2017）、Meyer等（2018）研究發現，在流水的環境中，光照會顯著影響東部牡蠣（Crassostrea virginica）幼蟲的游泳速度和游泳方向，同時會改變其螺旋游泳時的角度，且隨著其幼蟲年齡的增長，幼蟲游泳能力降低，傾向于留在水體底部。Zhang等（2021a）研究發現，長牡蠣（Crassostrea gigas）和熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）雜交幼蟲對特定光強和波長具有趨光性，這種能力不是眼點幼蟲所特有，在未發育出眼點的牡蠣幼蟲中也存在。【本研究切入點】香港牡蠣幼蟲特性及人工育苗技術的研究較少，有學者從鹽度及培育密度等方面開展了人工育苗的研究（官俊良，2015），但缺少幼蟲培育時期的基礎數據，如幼蟲的運動、耗氧率、攝食率及光選擇性等，在育苗生產實踐中，無法實現精準的餌料投喂、溶氧調控及環境調節，導致人工育苗產量始終較低。因此，目前鮮見有關香港牡蠣幼蟲運動、耗氧率、攝食率及趨光性的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過開展香港牡蠣幼蟲運動速度、面盤大小、耗氧率、攝食率及趨光性等方面的研究，將香港牡蠣幼蟲運動、耗氧率及攝食率等特征與生長特性建立數量化關系，實現對單個幼蟲行為的定量化描述，對香港牡蠣人工育苗中幼蟲的精準化培育管理、確定幼蟲最優餌料投喂量具有指導意義，同時為設施化高密度育苗設施構建提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 幼蟲獲得及培育

2021年8月，挑選廣西北海廉州灣牡蠣養殖區性腺發育成熟的香港牡蠣雌雄親貝各5只，通過解剖獲得精卵后進行人工授精，受精后在500 L養殖槽中孵化以備實驗使用，孵化密度10～15 ind/mL，鹽度30‰，水溫28±1℃，孵化24 h后獲得幼蟲，即開始投喂餌料。試驗所用水為經過2級過濾的砂濾海水，每隔2 d更換一次。金藻最適于牡蠣幼蟲的營養需求（Acarli and Lok，2011），因此，在培育期間，幼蟲飼喂球等鞭金藻（Isochrysis galbana）（細胞直徑4.42±0.60μm，n=30），每天投喂2次餌料，投餌量視幼蟲攝食情況而定。人工授精方法、卵的孵化、幼蟲收集及幼蟲培育參考張興志等（2019）的描述。

1.2 測定方法

1.2.1 運動速度測定隨機選取不同發育時期的幼蟲（D形幼蟲、前期殼頂幼蟲、中期殼頂幼蟲、后期殼頂幼蟲和眼點幼蟲）各30個。在幼蟲投喂2 h后，根據不同的規格，選擇相應網目的篩絹網，收集幼蟲，用吸管將幼蟲置于直徑為45 mm表面皿中，靜置5 min待幼蟲適應后，使用萊卡顯微鏡（DM750）和顯微數碼測量分析系統記錄幼蟲運動軌跡。使用視頻處理軟件逐幀播放，保存幼蟲瞬時運動照片，利用圖像處理軟件Photoshop CC測量幼蟲的大小和運動距離，計算運動速度（v）。

1.2.2 面盤直徑和殼高測量隨機選取4個發育時期的幼蟲（D形幼蟲、前期殼頂幼蟲、中期殼頂幼蟲和后期殼頂幼蟲）各30個。在盛有幼蟲的表面皿中滴入3～5滴50 g/L的MgCl2（終濃度約2～3 g/L），使運動中的幼蟲（面盤突出并完全伸展）瞬間麻醉，在40倍顯微鏡下拍照并測量其面盤直徑（d）和殼高。

1.2.3 耗氧率測定使用篩網收集不同發育時期的香港牡蠣幼蟲（D形幼蟲、前期殼頂幼蟲、中期殼頂幼蟲和后期殼頂幼蟲），將幼蟲密度稀釋至50～70個/mL，置于5000 mL呼吸瓶內，設3個平行。使用YSI professional水質分析儀測定初始的溶解氧含量，用封口膜封口。呼吸瓶在室內靜置，空調保持溫度在適宜范圍（28℃）內，每隔1 h測定水中溶解氧。為保證幼蟲的正常生理活動，試驗結束時，舍棄溶氧低于4.5 mg/L的試驗組（Zhang et al.，2021b）。同時，設置1組海水對照組（不放置幼蟲），消除不可控環境因素產生的影響。單個幼蟲耗氧率計算公式：

式中，R為耗氧率（ng/h），V為試驗海水的體積（mL），L為幼蟲密度（個/mL），DO0和DOt分別為試驗開始和試驗結束時水體中溶解氧濃度（mg/L），t為試驗時間（h）。

1.2.4 攝食率測定在停飼4 h后，分別收集發育至不同時期的香港牡蠣幼蟲（D形幼蟲、前期殼頂幼蟲、中期殼頂幼蟲、后期殼頂幼蟲和眼點幼蟲），將其分別稀釋至5～10個/mL，置于1000 mL燒杯內，每種規格設3個平行。投喂球等鞭金藻為餌料，測定攝食率，投喂密度8000～10000 cells/mL，每隔1 h取樣，使用血球計數板計數餌料密度。試驗過程中微量充氣。同時，設置1組海水對照組（投放餌料但不放置幼蟲），消除餌料沉降產生的影響。幼蟲攝食率計算公式：

式中，F為攝食率（cells/h），V為試驗海水的體積（mL），L為幼蟲密度（個/mL），C0和Ct分別為試驗開始和試驗結束時水體中餌料密度（cells/mL），t為實驗時間（h）。

1.2.5 光色對香港牡蠣幼蟲的誘集效果測定使用自主設計組裝的LED光源和彩色紙板作為幼蟲誘集光源（圖1），光色設置白、紅、黃、藍、紫和綠色等6種，每個色塊設置3個重復。光照強度50 Lx（Zhang et al.，2021），將幼蟲放置在直徑為15 cm的培養皿中，通過不同光色誘集30 min后，用移液槍豎直在不同光色塊的中央位置各吸取水樣1 mL，計數幼蟲數量，然后將幼蟲放回培養皿中，旋轉培養皿并攪動水體，30 min后再次計數，重復3次取平均值。統計不同光色誘集幼蟲的數量，并計算幼蟲數量所占比例，以此判斷幼蟲的趨向性。試驗測定了D型幼蟲（殼高66.75±4.49μm）、殼頂幼蟲（殼高195.43±20.25 μm）和眼點幼蟲（殼高302.39±22.38μm）3個時期香港牡蠣幼蟲的驅光效應，試驗設置幼蟲密度約20個/mL。為去除光線干擾，光色試驗在20：00后進行。

1.3 統計分析

用Photoshop CC處理圖像并繪制幼蟲運動軌跡示意圖。采用SPSS 19.0對試驗數據進行單因素方差分析及相關分析，用Excel 2016作圖。

2 結果與分析

2.1 香港牡蠣幼蟲的運動速度測量及其與殼高的相關分析結果

不同發育時期香港牡蠣幼蟲如圖2所示。幼蟲運動軌跡如圖3所示。幼蟲游泳時，雙殼張開，面盤凸出殼外，呈橢圓形或近圓形，面盤外周由纖毛組成，形成纖毛環，纖毛不斷擺動帶動面盤及幼蟲運動（圖3-A和圖3-B）。幼蟲運動俯視圖如圖3-C。通過幼蟲運動軌跡發現，在水平方向上，幼蟲朝著一定半徑的圓形進行順時針游動（圖3-D）。對不同發育時期的幼蟲運動視頻分析結果顯示，香港牡蠣幼蟲的運動速度為550～7500μm/s，對應的殼高為68～318μm，幼蟲運動速度隨殼高增高而增加，但接近變態時，幼蟲的平均運動速度則下降。游泳速度（y）和幼蟲殼高（x）的相關方程為y=-0.0043x2+27.992x-1002.6，R2=0.9892（圖4）。

2.2 香港牡蠣幼蟲的面盤直徑測量及其與殼高的相關分析結果

不同發育時期香港牡蠣幼蟲的面盤大小如圖3-A和圖3-B。D形幼蟲面盤直徑最小，為64.34±2.15μm，后期殼頂幼蟲面盤直徑最大，為276.85±24.42μm。幼蟲面盤直徑與殼高呈正相關，殼高和面盤直徑之間的相關系數為0.98（P＜0.01）（表1），表明二者存在良好的線性關系。幼蟲面盤直徑（y）和殼高（x）的線性關系為y=0.7867x-11.412，R2=0.9519（圖5）。

表1 幼蟲殼高與面盤直徑的相關系數Table 1 Correlation coefficient between shell height and velum diameter of oyster larva

2.3 香港牡蠣幼蟲的耗氧率測定及其與殼高的相關分析結果

不同殼高的香港牡蠣幼蟲耗氧率如圖6所示。隨著幼蟲的生長，其個體的耗氧率明顯增加，初孵D形幼蟲的耗氧率為0.67 ng/h，在即將變態時，單個幼蟲耗氧率6.45 ng/h，不同殼高的幼蟲耗氧率存在顯著差異（P＜0.05）。幼蟲耗氧率（y）與殼高（x）的相關方程為y=0.0297x-1.7967，R2=0.9833。

2.4 香港牡蠣幼蟲的攝食率測定及其與殼高的相關分析結果

不同殼高的香港牡蠣幼蟲的攝食率如圖7所示。香港牡蠣幼蟲的攝食率隨著生長呈先上升后下降的變化趨勢。初孵的D形幼蟲攝食率最小，為35 cells/h，在進入變態期前，隨著幼蟲生長，攝食率升高，在平均殼高288μm時，攝食率最大，為660 cells/h。在即將變態時，香港牡蠣幼蟲攝食率呈現下降趨勢。幼蟲攝食率速度（y）與殼高（x）的相關方程為y=-0.0002x3+0.0831x2-10.376x+407.23，R2=0.9933。

2.5 光色對香港牡蠣幼蟲的誘集效果

白、紅、黃、綠、藍和紫色等不同光色對香港牡蠣幼蟲的誘集結果如表2和圖8。不同發育時期幼蟲對光色的趨向性不同。白光對D形幼蟲的誘集數量最多，即誘集效果最好，其次是藍光和紫光（表2）。D形幼蟲對不同色光趨向性依次為白光［（29.47±5.75）%］＞藍光［（20.24±7.21）%］＞紫光［（19.94±3.90）%］＞紅光（12.65±2.39%）＞綠光［（11.90±2.77）%］＞黃光［（5.80±1.63）%］（圖8）。白光、綠光和藍光對殼頂幼蟲誘集數量較多，誘集效果最好（表2），殼頂幼蟲對不同光色的趨向性依次為白光［（24.88±7.54）%］＞綠光［（24.10±8.31）%］＞藍光［（22.05±4.26）%］＞黃光［（10.42±3.25）%］＞紫光［（10.18±1.87）%］＞紅光［（8.43±0.74）%］（圖8）。藍光對眼點幼蟲的誘集效果數量最多，即誘集效果最好，其次為白光和綠光（表2），眼點幼蟲對不同色光的趨向性依次為藍光［（37.80±4.59）%］＞白光［（19.95±5.33）%］＞綠光［（15.85±2.17）%］＞紫光［（9.93±3.32）%］＞黃光［（9.38±1.25）%］＞紅光［（6.92±1.09）%］（圖8）。

表2 不同光色誘集不同發育時期牡蠣幼蟲的數量Table 2 Number of oyster larva trapped by different light colors

3 討論

面盤是由擔輪幼蟲口前纖毛環向外發展，形成具有長纖毛的2個半圓形器官，是雙殼貝類幼蟲特有的器官（Qiu et al.，2015）。面盤呈近圓形，且可從殼內凸出，其外邊緣有纖毛包被（Kraeuter and Castagna，2001）。Blake和Otto（1996）研究發現，福建牡蠣（C.angulata）面盤外周纖毛擺動與鐘形蟲（Vorticella）類似，纖毛周期性地向同一方向擺動，在帶動面盤運動的同時也產生一定方向旋轉力，使幼蟲沿順時針方向游動。Le等（2017）研究發現，幼蟲通過面盤外周纖毛不斷擺動從而形成水流，單胞藻隨水流方向運動到幼蟲口溝處，在口溝纖毛擺動下部分被捕獲。因此，面盤是貝類幼蟲重要的運動和攝食器官（Blake and Otto，1996；Qiu et al.，2015）。本研究發現，初孵的香港牡蠣幼蟲面盤直徑最小，平均值為44.11μm，隨著幼蟲生長，面盤直徑逐漸增加，其范圍為44.11～261.11μm，面盤直徑與殼高呈正相關關系，與Qiu等（2015）對福建牡蠣幼蟲的研究結果相似。面盤等功能器官的快速發育保證了個體早期攝食和運動能力的完善，從而使幼蟲獲得最適和最大生長效能（賈瑞錦等，2014；高小強等，2018）。

本研究發現，香港牡蠣幼蟲通過調節纖毛擺動頻率，實現不同的運動形態，包括邊攝食邊游動、只攝食不游動或快速游動，與珠母貝（鄧正華等，2018）的運動形態相似。在本研究中，香港牡蠣幼蟲運動速度為550～7500μm/s，且隨著幼蟲生長，其平均游泳速度逐漸增加，至變態前期有所下降。鄧正華等（2018）研究發現，珠母貝幼蟲的運動速度為250～3600μm/s。與香港牡蠣幼蟲相比，珠母貝幼蟲的運動速度更慢，其原因可能是二者幼蟲攝食狀態不同，雙殼貝類幼蟲運動狀態受攝食的影響（Blanco and Kamermans，2015；Qiu et al.，2015；鄧正華等，2018）。幼蟲攝食不飽滿時，主動游動并攝食，消化腺飽滿后，會進行短時間休息，駐留在水底不游動，殼口閉合（Qiu et al.，2015；鄧正華等，2018）。Qiu等（2015）研究認為，在測定牡蠣幼蟲運動速度時，選擇投喂后1～2 h進行測量，此時幼蟲既非饑餓狀態，也非飽食狀態，便于觀察。

貝類的耗氧率與其代謝活動相關，直接反映機體的生活和生理狀況。因此，測定香港牡蠣的耗氧率，對其人工育苗及養殖具有重要的應用價值。目前有關香港牡蠣耗氧率的研究主要集中在成貝（廖文崇等，2011；林麗華等，2012），關于其幼蟲的耗氧率尚未見報道。本研究發現，隨著香港牡蠣幼蟲的生長，其耗氧率逐漸增加，單個幼蟲的耗氧率從0.67 ng/h增長到即將變態時的6.45 ng/h，表明在空氣充氧的條件下，完全能夠保證牡蠣幼蟲對溶解氧的需求，溶解氧不構成幼蟲培育的限制因素。以接近變態時期的幼蟲（殼高300μm）耗氧量計算，集約化養殖密度為10～20個/mL時，溶解氧從5.5 mg/L降低至5.0 mg/L需要3～4 h。該結論為香港牡蠣人工育苗時設置停氣自動預警閾值提供數據支持，也為突發斷電斷氣事故援救提供時間參考。

對于雙殼貝類幼蟲的攝食行為，前人研究大多是針對養殖水體中餌料濃度或餌料種類（黎輝和金啟增，1997；閆喜武等，2010；趙越等，2011；周銀環等，2012），從個體角度開展貝類幼蟲攝食行為的研究較少。以個體為單位，開展牡蠣幼蟲的攝食行為研究，能夠更加直觀、深入地了解幼蟲的攝食速率，將有助于人工育苗時餌料精準投喂，同時為貝類幼蟲高密度培育設施設計提供參考（Qiu et al.，2015）。本研究發現，香港牡蠣幼蟲的攝食速度呈現先增加后降低的趨勢，在接近變態時，幼蟲攝食率下降。這可能與幼蟲的器官發育相關，幼蟲在前期發育過程中，面盤以及外周纖毛不斷發育完善，促使面盤濾水速度增加，從而增加了幼蟲攝食速率（鄧正華等，2018）。幼蟲發育至后期接近變態時，器官結構發生改變，面盤和纖毛逐漸退化，逐步形成斧足和鰓，幼蟲由浮游狀態轉變為匍匐于底部的爬行狀態。因此，在面盤完全退化消失前幼蟲攝食率和運動速率會降低（Qiu et al.，2015；鄧正華等，2018）。本研究發現，香港牡蠣幼蟲攝食率的變化范圍為從D形幼蟲時期的35 cells/h到接近變態前期的660 cells/h。該數據將有效應用于牡蠣的人工育苗，以剛孵化完成的D形幼蟲為例，若培育密度為10個/mL，每8 h投喂一次，則每次投喂需保證培育池內金藻密度達2800 cells/mL。

光是一種直接或間接影響生物生長和代謝的能量信號。在生物進化的過程中，許多動物逐漸形成了對光的節律性變化的生物鐘，這種節律性變化在很大程度上是由光敏器官的發生所介導（Naylor，2001；Gaston et al.，2017；Hobbs et al.，2021）。一般來說，浮游動物會在白天遷移到深海，以避免被捕食的威脅，并在夜間浮出水面進食（Hobbs et al.，2021）。因此，大多數浮游動物適應低光照環境，而不能忍受高強度的光。據報道，長牡蠣眼點幼蟲可有效吸收波長為500～650 nm的光，特別是在色素區域（Kim et al.，2021）。水環境對可見光的折射產生了一個普遍的現象，即水生生物可感知并適應穿透性的較強的藍光和綠光，對紅光反應很少甚至沒有反應（Fortunato et al.，2016），本研究得到相似的結果，香港牡蠣不同發育階段的幼蟲趨向于白光、藍光和綠光，趨向紅光的比例最低。Zhang等（2021a）對雜交牡蠣幼蟲的研究中也發現，綠光和藍光聚集的眼點幼蟲和無眼點的幼蟲數量最多，明顯高于其他顏色的光，推測紅色對眼點幼蟲具有沉降誘導的作用。Kim等（2021）在對長牡蠣的研究中也提出用紅光促進眼點幼蟲沉降的方法。眾所周知，自然海區及人工育苗中，牡蠣采苗效果不穩定，很大程度上取決于環境因素（鐘方杰等，2014）。很多研究在試圖提高牡蠣的采苗效果（方琦等，2001；祁劍飛等，2013；范瑞良等，2020）。本研究結果表明，紅光具有誘導香港牡蠣幼蟲沉降的作用，白光、藍光和綠光則對幼蟲有一定的吸引作用，這對牡蠣的幼蟲培育和采苗具有重要的指導意義。

4 結論

香港牡蠣幼蟲的運動速度、耗氧率、攝食率與生長性狀存在不同程度的相關性，白光、藍光和綠光光對香港牡蠣幼蟲有一定的吸引作用，紅光具有誘導香港牡蠣幼蟲沉降的作用，為香港牡蠣人工育苗過程中幼蟲的精準化培育管理、確定幼蟲最優餌料投喂量等提供依據，也為設施化高密度育苗設施構建提供參考。