改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的條件優化及其體外模擬消化穩定性研究

高慧穎，賴恭梯，官雪芳，鄭亞鳳，李舒婷，王琦*

（1福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建福州 350003；2福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002）

0 引言

【研究意義】茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶葉所含有的重要活性成分，具有清除機體內自由基、延緩機體衰老、預防心血管疾病、防癌等生物活性功能（Khan et al.，2017）。近年來，研究發現茶多酚可經消化道達到結腸，并通過調節人體腸道菌群結構與功效，從而保護腸道健康及用于防治以代謝綜合征為代表的各類慢性疾病（Hong et al.，2021；Li et al.，2021）。然而，茶多酚在經過人體胃腸道消化環境時易被破壞、降解或代謝，造成其生物利用率低。因此，進行提高茶多酚穩定性的研究，對于茶多酚在結腸功能性食品（Colonic functional food）上的應用具有重要意義。【前人研究進展】近年來，利用天然大分子與茶多酚吸附結合形成復合物以提高茶多酚的生物穩定性已成為功能性食品研發的熱點之一。吳培龍等（2010）通過酶水解方法制備玉米多孔淀粉，測得其對茶多酚的吸附性能較原淀粉提高2.1倍，有利于茶多酚的緩慢釋放。Wu等（2011）研究表明，燕麥β-葡聚糖通過氫鍵作用在溶液中與茶多酚結合形成復合物，并顯著改變其體內和體外的抗氧化活性。不被人體所消化的膳食纖維與茶多酚結合后，不僅可減少茶多酚在人體消化道內受到破壞，實現對多酚的結腸靶向運輸（Tang et al.，2020），還能在腸道微生物的分解作用下將攜帶的茶多酚釋放出來，共同被腸道微生物吸收利用（Padayachee et al.，2012；González-Aguilar et al.，2017；Maurer et al.，2019）。然而，天然膳食纖維粒徑大且口感粗糙，不利于直接作為茶多酚的吸附載體應用于功能性食品開發。改性處理是提高膳食纖維理化性質和生理功能的關鍵技術手段，通過改性讓纖維中的糖苷鍵斷裂，可減小膳食纖維的粒徑，提高其吸附能力，并減少對食品品質的不利影響（楊明華等，2016）。膳食纖維的改性方法包括物理法（Liu et al.，2016）、化學法（Feng et al.，2017）和生物法（Wen et al.，2017）。其中，動態高壓微射流技術（Dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一項新興的物理改性方法，在強烈剪切、高速撞擊、壓力瞬時釋放、高頻振蕩、膨爆和氣穴等作用力下，對膳食纖維起到顯著的超微化改性作用（Wan et al.，2007）。經DHPM處理后，膳食纖維中粒度顯著降低，對食品中蛋白質、油脂和多酚等物質的吸附能力提高，復合物穩定性增強。同時，纖維粒徑大小與多酚的穩定性和生物利用度密切相關，纖維粒徑越小對多酚的吸附和保護作用越強（Zhao et al.，2018）。【本研究切入點】目前研究大多集中在茶多酚與天然大分子之間的相互作用，而對于改性膳食纖維與茶多酚相互結合作用的研究較少。桔皮是一種優質膳食纖維的原料（高慧穎等，2019），經DHPM改性處理的桔皮膳食纖維在吸附茶多酚上具有良好的應用潛力，需進一步優化二者結合作用條件，并分析其復合物在消化環境中的穩定性。【擬解決的關鍵問題】以經DHPM改性處理的桔皮膳食纖維為載體，分析在不同的溫度、時間、茶多酚濃度和pH條件下，改性桔皮膳食纖維對茶多酚吸附和結合性能的變化趨勢；通過響應面法優化復合物的制備條件，并在模擬人工消化模型中比較分析茶多酚和復合物的穩定性差異，為茶多酚和膳食纖維在結腸功能性食品中的高效應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮建陽桔柚由福建省南平市建陽區桔柚專業合作社提供，取果皮在50℃下熱風干燥至恒重，粉碎后過100目篩，制得桔皮粉末樣品，密封干燥保存。茶多酚（純度97%）購自上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（P7000，來源于豬胃粘膜）、胰蛋白酶（T4799，來源于豬胰腺）和牛膽酸鈉（S0900000）購自Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；福林酚、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸及其他藥品試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器設備：BSA電子分析天平（德國賽多利斯集團）、DGG-9140BD電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）、DF-101S磁力攪拌集熱式水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司）、ZWY-2102C恒溫振蕩搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）、L550臺式大容量離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）和Lambda 35紫外可見分光光度計（美國珀金埃爾默公司）。

1.2 桔皮膳食纖維制備與改性處理

桔皮膳食纖維的制備和DHPM改性處理參照江文韜等（2020）的方法進行。將干燥桔皮粉末（20 g）與5% NaOH溶液按1∶20（g/mL）比例混合，在50℃下靜置反應4 h后，將溶液離心（4000 r/min）10 min取下層沉淀，再將沉淀分散于0.5 mol/L NaCl溶液中（1∶25，g/mL），調pH至11.0，在40℃下持續攪拌3 h脫去蛋白；再次離心后，將沉淀按1∶20（g/mL）加入10% H2O2，在45℃下攪拌12 h以脫色；最后將沉淀用蒸餾水沖洗至pH為中性，50℃熱風干燥后即得桔皮膳食纖維（CDF）。稱取1 g CDF，攪拌分散在水中（1.5∶100，g/mL），在壓力110 MPa下進行DHPM改性處理5次，所得樣品熱風干燥后，得到DHPM改性的桔皮膳食纖維（D-CDF）。

1.3 茶多酚含量測定

茶多酚含量的測定基于稍作修改的福林酚法（Hu and Du，2019）。分別配制濃度為10～60μg/mL的茶多酚溶液，繪制茶多酚標準曲線。將0.1 mL樣品溶液轉移至5 mL離心管中，加入1.0 mL稀釋10倍的福林酚試劑并混勻，靜置5 min后加入1.0 mL 7.5%（w/v）Na2CO3，室溫避光保存60 min，用紫外—可見分光光度計在765 nm處測定吸光值，重復3次。根據茶多酚的標準曲線進行定量計算。

1.4 改性桔皮膳食纖維對茶多酚吸附性能研究

將50 mL離心管包上鋁箔，稱取0.5 g D-CDF粉末，與20 mL不同濃度和pH的茶多酚水溶液在離心管中混合，置于恒溫振蕩搖床中，在不同溫度條件下100 r/min持續振蕩。經不同吸附反應時間后，取出單只離心管，8000 r/min離心10 min，吸取上層清液，用紫外—可見分光光度計在765 nm處測定吸光值，根據茶多酚標準曲線計算上清液中游離茶多酚濃度。D-CDF對茶多酚的吸附量根據公式（1）計算：

式中，C0為初始溶液中茶多酚濃度（μg/mL），Ct為t時刻上清液中茶多酚濃度（μg/mL），V為反應時溶液總體積（mL），W為樣品D-CDF質量（mg）。

初始條件設為茶多酚濃度1.0 mg/mL，吸附反應溫度25℃，反應時間60 min，溶液pH 7.0。將不同溫度設為5、15、25、35、45和55℃，時間設為15、30、60、120、180和240 min，茶多酚濃度設為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mg/mL，pH設為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。

1.5 改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚條件的響應面法優化

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，設計溫度、時間、茶多酚濃度和pH為響應因素，茶多酚吸附量為響應值的4因素3水平響應面分析試驗（表1）。優化后條件制備的改性桔皮膳食纖維與茶多酚的復合物溶液，經凍干后得到復合物粉末（DFTP），低溫干燥保存，用于后續分析。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計因素與水平Table 1 Level and factor of Box-Behnken response surface design

1.6 復合物體外模擬消化的穩定性分析

參照王謝祎等（2016）的方法構建模擬消化模型，以純茶多酚粉末為對照，研究復合物DFTP在體外模擬胃消化和腸道消化環境中的穩定性。人工模擬胃液采用0.1 mol/L HCl溶液配制4 mg/mL胃蛋白酶溶液，人工模擬腸液由0.1 mol/L NaHCO3溶液與2 mg/mL胰蛋白酶和12 mg/mL牛膽酸鈉配制而成。

取100 mL具塞錐形瓶，分別加入25.0 mL生理鹽水和4.0 mL人工胃液（4 mg/mL），混勻后，以0.1 mol/L HCl溶液調pH至2.0～2.5。在試驗組中加入15 mg復合物DFTP，而對照組添加的茶多酚粉末重量根據茶多酚吸附量進行換算，以保證2組間具有相同的初始茶多酚含量。在37℃水浴中100 r/min振蕩，模擬胃消化1 h后，將此消化液置于冰浴中鈍化酶活。2組分別取樣品溶液根據福林酚法測定茶多酚濃度。

在上述消化1 h的人工胃液中加入1.0 mol/L NaHCO3溶液調節pH至6.5～7.0，于37℃水浴振蕩（100 r/min）45 min，加入1.8 mL模擬人工腸液，調節pH至7.0～7.5，繼續于37℃水浴振蕩2 h，轉移至冰浴中鈍化酶活。取樣品溶液根據福林酚法測定茶多酚濃度。

在體外模擬消化的條件下，茶多酚保留率根據公式（2）計算：

式中，Qt為t時刻溶液中茶多酚濃度（mg/mL），Qs為消化初始階段溶液中茶多酚濃度（mg/mL）。

1.7 統計分析

所有試驗均為3次重復，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0對試驗數據進行差異顯著性分析，以Excel 2019制圖，使用Design-Expert V8.0.6對響應面試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 溫度對改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的影響

如圖1所示，改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附量隨溫度的升高而減少。當反應溫度為5℃時，茶多酚吸附量最高，達47.68±1.97 mg/g；而當溫度升至55℃時，茶多酚吸附量顯著降至21.36±1.22 mg/g（P＜0.05，下同）。研究表明，纖維與多酚之間的結合主要是通過氫鍵介導的非共價作用，當多酚與纖維表面的結合位點進行接觸，形成的氫鍵使得二者結合更加緊密（Renard et al.，2001）。溫度升高引起茶多酚分子運動加劇，從而減弱氫鍵結合作用，導致茶多酚吸附量的減少。

2.2 時間對改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的影響

改性桔皮膳食纖維分散于茶多酚溶液后，隨著吸附反應時間的延長，二者的吸附結合經歷自發快速的初始階段與平穩且緩慢的擴展階段。如圖2所示，在15～60 min，由于纖維表面的結合位點數量充足，改性桔皮膳食纖維與茶多酚自發快速地結合（Liu et al.，2018），茶多酚吸附量隨著時間的延長而顯著提高；吸附60 min時，茶多酚吸附量達38.64±1.26 mg/g。當吸附反應時間超60 min后，改性桔皮膳食纖維與茶多酚的結合趨于飽和，表現為結合速率明顯放緩，吸附量基本保持不變，在反應時間為240 min時，茶多酚吸附量為39.59±1.66 mg/g。這可能是由于纖維表面的結合位點逐漸飽和，少量游離茶多酚只能通過多酚分子間締合堆疊進行吸附結合，導致結合速率快速下降。

2.3 茶多酚濃度對改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的影響

由圖3可知，隨著茶多酚濃度的增大，改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附量逐漸提高；當茶多酚濃度大于3.0 mg/mL時，其吸附量趨于飽和。結果表明，纖維與茶多酚的結合受到溶液中游離酚濃度的影響。由于溶液中的結合酚與游離酚存在動態平衡，因此增加茶多酚溶液中游離酚含量在一定濃度范圍內可使得纖維對茶多酚吸附能力提高。

2.4 pH對改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的影響

溶液pH是影響茶多酚吸附的重要因素之一，因此需對其進行優化以實現茶多酚的高效吸附（陽雁等，2015）。如圖4所示，茶多酚吸附量隨著溶液pH的增加而提高，當pH為7.0時，茶多酚吸附量達最大值（40.49±1.44 mg/g），之后逐漸下降。因此，不論是酸性或堿性環境均不利于茶多酚與膳食纖維的吸附結合作用。

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面試驗結果及方差分析采用Design-Expert V8.0.6對表2的試驗數據進行二次響應面回歸擬合分析，得到以溫度（A）、時間（B）、茶多酚濃度（C）和pH（D）為自變量，茶多酚吸附量（Y）為因變量的二次多項式回歸方程：Y=45.79-7.97A+3.77B+2.47C-0.19D-0.50AB+0.56AC-0.28AD+0.22BC+0.085BD-0.065CD+0.092A2-3.50B2-2.61C2-4.15D2。模型的P＜0.01，說明該回歸模型極顯著，失擬項（P=0.9969）不顯著（P＞0.05，下同）（表3），表明該模型的擬合程度好，試驗誤差小，可較好地反映茶多酚吸附量與溫度、時間、茶多酚濃度和pH之間的關系，較準確地預測改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附作用。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，一次項A、B、C對茶多酚吸附量的影響均達極顯著水平（P＜0.01），4個因素對茶多酚吸附量的影響程度排序為A＞B＞C＞D，即溫度＞時間＞茶多酚濃度＞pH。交互項AB和AC對茶多酚吸附量的影響達顯著水平，表明溫度與時間、溫度與茶多酚濃度的交互作用對茶多酚吸附量有顯著影響。

表3 回歸方程系數顯著性分析結果Table 3 Regression equation coefficient significance analysis results

2.5.2 各因素間交互作用分析響應面交互作用的結果如圖5所示。圖5-a和圖5-b顯示，茶多酚吸附量隨著溫度的升高而快速下降，隨著時間的延長和茶多酚濃度的增加先升高后趨于穩定，等高線稀疏均勻，表明溫度與時間之間、溫度與茶多酚濃度之間均具有顯著的交互作用，能顯著影響改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附量；等高線圖中時間曲線與茶多酚濃度曲線較溫度曲線平緩，說明時間和茶多酚濃度2個因素對茶多酚的吸附量影響不如溫度。圖5-c顯示，等高線呈不規則曲面，表明溫度與pH的交互作用不顯著。圖5-d～圖5-f顯示，響應面的坡度較平緩，等高線呈近圓形，表明時間與茶多酚濃度、時間與pH、茶多酚濃度與pH的交互作用不顯著，pH與其他各因素間無顯著交互作用，不能顯著影響改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附量。以上各因素交互作用與方差分析結果一致。

2.5.3 驗證試驗結果利用上述模型，以茶多酚吸附量為最大值，預測改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚最優條件為：溫度4.83℃，時間60.77 min，茶多酚濃度3.89 mg/mL，pH 6.85，此時茶多酚吸附量為54.46 mg/g。考慮到實際操作，將優化后的參數調整為：溫度5℃，時間61 min，茶多酚濃度3.9 mg/mL，pH 7.0。采用上述調整后的工藝條件進行驗證試驗，在此條件下進行3次平行驗證，茶多酚吸附量平均值為54.26 mg/g，與理論預測值誤差小于1%，說明采用響應面法優化得到的工藝條件可靠，利用該模型預測改性桔皮膳食纖維對茶多酚吸附結合作用可行。

2.6 復合物在體外模擬消化環境中的穩定性

體外模擬消化試驗結果（圖6）表明，茶多酚在模擬胃腸消化環境中含量顯著降低。茶多酚經胃消化后的保留率為84.17%，再經腸道消化后保留率僅為47.29%。當茶多酚與改性桔皮膳食纖維通過吸附結合形成復合物后，在膳食纖維的保護下可降低胃腸消化環境對茶多酚的破壞作用，顯著提升茶多酚在消化環境中的穩定性，經模擬胃和腸道消化后的茶多酚保留率分別為92.07%和69.73%。

3 討論

植物膳食纖維主要來源于植物細胞壁，包括纖維素、木質素、半纖維素和果膠等。隨著生活水平的提高，我國居民的日常飲食結構發生變化，膳食纖維攝入量呈下降趨勢，在食品中補充膳食纖維對于預防多種慢性疾病具有重要意義（扈曉杰等，2011）。近年來，膳食纖維對多酚的吸附和保護作用也逐漸受到重視，被廣泛認為是膳食纖維的重要生理功能之一。研究表明，膳食纖維主要通過非共價鍵作用力與多酚形成穩定的復合物，從而提高多酚在不同環境中的生物穩定性和生物活性（王麗穎等，2017）。

茶多酚是茶葉所含有的重要活性成分，具有清除機體內自由基、延緩機體衰老、預防心血管疾病、防癌等生物活性功能。利用膳食纖維與多酚結合形成的復合物可保護多酚達到結腸，被腸道菌群分解與代謝，進而協同發揮其對人體的健康功效。本研究將桔皮膳食纖維經DHPM改性處理后，測定分析4個因素（時間、溫度、茶多酚濃度和pH）對茶多酚吸附量的影響。結果表明，隨著時間的變化，改性桔皮膳食纖維對茶多酚的吸附可分為自發快速的初始階段（15～60 min）與平穩且緩慢的擴展階段（＞60 min）。在初始階段，茶多酚分子可迅速通過非共價鍵作用與膳食纖維表面的結合位點結合；進入擴展階段后，由于缺乏新的結合位點，未結合的多酚以極緩慢的速率在結合物表面發生締合堆疊。溫度是影響酚類物質與膳食纖維結合的另一個關鍵因素。當溫度為5℃時，茶多酚吸附量為47.68±1.97 mg/g，并隨著溫度的升高而逐漸下降。反應溶液溫度的升高會導致酚類物質與膳食纖維結合力下降，這是由于溫度升高減弱二者的非共價相互作用，主要影響氫鍵作用，不利于結合（Phan et al.，2015）。茶多酚濃度越高，溶液中的游離茶多酚分子越多，與膳食纖維的吸附結合速率就越快。在相同的吸附反應時間內，吸附量在茶多酚濃度為3.0 mg/mL時趨于飽和。不同溶液pH對茶多酚吸附量有明顯影響，溶液pH為7.0時，茶多酚吸附量達最大值。響應面法結果表明，各因素對茶多酚吸附量的影響程度由高到低依次為溫度、時間、茶多酚濃度和pH，且溫度與時間、溫度與茶多酚濃度的交互作用對茶多酚吸附量有顯著影響。進而將改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚條件優化為：溫度5℃，時間61 min，茶多酚濃度3.9 mg/mL，pH 7.0。在該優化條件下得到茶多酚吸附量為54.26 mg/g，優于駱慧敏等（2015）報道多孔淀粉對茶多酚的吸附量（25.72 mg/g），與吳培龍等（2010）報道玉米多孔淀粉的茶多酚吸附量（68.65 mg/g）相近。

桔皮膳食纖維作為茶多酚的保護和結腸靶向遞送載體具有以下幾個優勢：（1）膳食纖維與多酚分子之間具有很強的相互結合作用力；（2）膳食纖維具有良好的結腸黏膜黏連能力；（3）膳食纖維可與多酚發揮協同益生元效應（Tang et al.，2020）。體外模擬消化試驗結果表明，茶多酚在經模擬胃消化（1 h）和腸道消化（2 h）后，保留率分別為84.17%和47.29%，與李玉壬等（2021）的研究結果（88.00%和63.90%）相近。茶多酚在胃腸不同的酸堿環境、消化酶等共同作用下，發生氧化、聚合、降解等反應，導致其含量顯著降低。相對于胃部環境，腸道中的弱堿性化學條件和酶的共同作用對茶多酚的穩定性造成更顯著影響（Tenore et al.，2015）。茶多酚與桔皮膳食纖維通過吸附結合形成穩定的復合物，并經相同的模擬胃腸消化環境后，茶多酚保留率分別達92.07%和69.73%，顯著高于未經保護的純茶多酚。本研究開展DHPM改性桔皮膳食纖維吸附茶多酚的條件優化及其體外模擬消化穩定性研究，結果證明改性桔皮膳食纖維通過吸附茶多酚可顯著提升其生物穩定性，有利于實現茶多酚的結腸靶向遞送。然而，由于技術手段的局限性，以及茶多酚與改性桔皮膳食纖維分子間相互作用的復雜性，使得二者之間相互作用的影響因素和作用機制研究不夠深入和全面，結合位點及連接與釋放方式仍需進一步研究。

4 結論

DHPM改性桔皮膳食纖維可作為吸附茶多酚的高效天然載體，通過條件的優化，可顯著提高茶多酚在胃腸道中的穩定性，有利于遞送茶多酚進入結腸中發揮其健康功效。