可可毛色二孢拮抗菌的鑒定及發酵條件優化

劉雙龍，楊德潔，牛曉慶，楊福孫，覃偉權*

（1中國熱帶農業科學院椰子研究所/海南省院士創新平臺/海南省檳榔產業工程研究中心，海南文昌 571339；2海南大學熱帶作物學院，海南海口 570228）

0 引言

【研究意義】可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區，是具有多型性、多寄主的土傳真菌，可在500多種植物上寄生，且表現出不同的癥狀（Yildiz et al.，2014）。謝紅輝等（2016a，2016b）發現可可毛色二孢菌可感染桑樹根部引起桑樹根腐病。任亞峰等（2019）研究表明可可毛色二孢可引起茶樹葉斑病。唐中發等（2021）發現可可毛色二孢可引起菠蘿葉斑病。本研究中的目標菌株可可毛色二孢菌分離自檳榔根部，是引起檳榔根腐病的病原之一，此類病害目前已成為影響海南陵水、萬寧和崖城等檳榔主產區檳榔生產的主要障礙之一，可導致檳榔植株葉片黃化、枯死，10～20樹齡的結果樹因發生此類病害而大量死亡（李增平等，2006）。生物防治具有綠色、安全、有效等優點，因此，篩選對可可毛色二孢菌及其他檳榔根腐病菌具有拮抗作用的菌株，對檳榔抗病研究及檳榔產業的可持續發展均具有重要意義。【前人研究進展】目前對可可毛色二孢菌的防治研究多集中于化學藥劑的篩選。戴利銘等（2018）通過菌絲生長速率法測定了多菌靈、丙環唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環唑和異菌脲等10種殺菌劑對可可毛色二孢菌的毒力，發現多菌靈對可可毛色二孢菌的防治效果最好。歐陽林海（2020）通過試驗得出在檳榔根腐病發病初期用15%食鹽水施于檳榔樹基部，或用70%甲基托布津1000倍液每隔15 d從基部施用1次，連續2～3次后對檳榔根腐病有較好的防治效果。石金巧等（2021）采用菌絲生長速率法測定了0.3%四霉素AS、5%己唑·四霉素ME、29%吡萘·嘧菌酯SC和36%喹啉·戊唑醇SC等11種藥劑對可可毛色二孢菌的抑菌活性，發現29%吡萘·嘧菌酯SC和36%喹啉·戊唑醇SC對可可毛色二孢菌的抑制效果最強。雖然化學藥劑對病害具有很好的防治效果，但極易使致病菌產生抗藥性；同時，過度使用化學農藥迫使土壤中的有益微生物數量驟減，削弱了土壤自身的修復能力，實施生物防治是解決這些問題的主要選擇（馬成濤等，2007）。關于可可毛色二孢菌的生物防治有學者進行了相關探索。謝紅輝等（2015，2016a，2016b）通過平板對峙法、孢子萌發法和田間小區試驗，發現解淀粉芽孢桿菌對可可毛色二孢菌的抑菌率達73.3%，病原菌孢子在解淀粉芽孢桿菌培養液中不能萌發，生防菌田間防治效果為67.94%；采用生長速率法和載玻片孢子萌發法測定H.11648劍麻葉汁對可可毛色二孢菌的抑制作用，發現H.11648劍麻葉汁能顯著抑制桑根腐病病菌可可毛色二孢菌的菌絲生長和孢子萌發。鄒東霞等（2018）通過菌絲生長速率法測定了不同培養條件下白僵菌S1-7發酵液對可可毛色二孢菌的抑制作用，發現白僵菌S1-7在溫度為28℃，培養時間20 d，pH 7.0～8.0，培養基中葡萄糖、蛋白胨和酵母粉含量分別為40、20、20 g/L時對可可毛色二孢菌的生長抑制最強。包興濤（2019）采用菌絲生長速率法測定了含1，3，4-噁二唑的砜類化合物對可可毛色二孢菌的抑制活性，發現化合物1（甲磺酰菌唑）的抑菌活性最好。目前，關于檳榔內生菌的分離研究較少。韓丹丹等（2017）分離得到1株檳榔內生細菌BLG1，發現其抑菌譜較廣，對水稻紋枯病的盆栽試驗防效達67.05%。宋薇薇等（2017）通過組織塊分離法從檳榔樹的根、葉和花中共分離得到47株內生真菌，分屬于8個屬。【本研究切入點】生物防治具有諸多優點，是病害防治研究的熱點之一。目前關于可可毛色二孢菌的拮抗菌株報道較少，且大多處于實驗室階段，有效生防菌株匱乏。【擬解決的關鍵問題】以發病檳榔園健康檳榔根組織及根際土壤為材料，采用組織勻漿法和平板稀釋梯度培養法分別分離檳榔根組織內生細菌和根際土壤中的細菌，運用平板對峙法對可可毛色二孢菌的生防菌株進行篩選，并測定生防菌株菌液對檳榔根部病害病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制作用；通過盆栽防效試驗驗證生防菌株的防治效果；采用單因素變化試驗對生防菌株的培養條件進行優化，以期得到對可可毛色二孢菌等檳榔常見根部病害病原菌具有顯著防治效果的生防菌株，以進一步豐富檳榔根腐病生物防治的菌種資源，為檳榔根部病害生防菌劑的開發提供菌種及指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料供試樣本為健康檳榔植株根部組織和根際土壤，采自海南保亭、瓊海、萬寧3地發病檳榔園，每園區隨機選取3株健康檳榔樹，每棵樹采集3個不同方位的根樣及土樣，并立即用無菌聚乙烯密封袋密封，放入冰盒帶回實驗室進行處理。供試檳榔根部病原真菌：可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）由中國熱帶農業科學院椰子研究所植物保護中心分離保存。試驗所用檳榔苗熱研1號由中國熱帶農業科學院椰子研究所基地提供。

1.1.2 供試培養基PDA、NYBD、LB、NA和豆芽汁培養基按常規方法配制（楊亞男等，2017；何明川等，2021）。細菌生理生化測定試劑購自青島海博生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（50T）及PCR相關試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 樣品細菌的分離純化采用組織勻漿法（劉波等，2011）和平板稀釋梯度培養法（邢鵬飛，2017）分別分離根組織內生細菌及根際土壤中的細菌。用自來水將根清洗干凈后用去離子水沖洗3遍，在無菌條件下，用75%酒精表面消毒30 s，去離子水沖洗3次，用無菌濾紙吸干水分，后用2.6%次氯酸鈉表面消毒90 s；再用去離子水清洗3～4次，用無菌濾紙吸干水分，將最后一次清洗組織塊的無菌水用移液槍吸取少量滴入NA培養基觀察有無菌落長出（易天鳳等，2019），將消毒后的根組織進行研磨；最后將根際土壤和根研磨液分別稀釋10-1～10-5等5個梯度懸液，每個濃度吸取50μL涂布在NA培養基上進行分離，挑取單菌落采用平板劃線法進行純化，將純化后的菌株用甘油冷凍保藏法進行保存。

1.2.2 可可毛色二孢菌拮抗細菌的篩選采用平板對峙法進行拮抗細菌篩選。以可可毛色二孢菌為供試靶標菌，用直徑5 mm的打孔器分別在培養1 d的細菌平板和培養5 d的病原真菌平板上打孔，獲得同質等量的菌塊。將病原真菌菌塊置于直徑為90 mm的PDA培養基中心，同時在距平皿中心22.5 mm處的圓周上均勻放置3塊細菌菌塊，設置不放置細菌菌塊的平板為對照，各設3個重復，于28℃培養2 d后測量細菌及病原菌兩接種點連線上病原菌的菌落半徑，計算抑制率（朱海云等，2021）。選取拮抗效果最好的菌株進行后續試驗。

1.2.3 拮抗菌種子液制備及菌液對檳榔根部3種病原真菌的抑制作用挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL LB液體培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床28℃下180 r/min振蕩培養24 h作為種子液備用。

采用濾紙片抑菌法進行菌液抑菌作用測定：在超凈工作臺中將無菌濾紙片在拮抗菌種子液中浸泡30 s，用無菌鑷子夾取濾紙片，置于直徑為90 mm的PDA培養基中心，其余操作方法同1.2.2。

1.3 拮抗細菌鑒定

1.3.1 形態學觀察將拮抗菌株接種至NA培養基上，32℃培養24 h，觀察菌落的形態、大小、邊緣、透明度等特征，并在光學顯微鏡下觀察拮抗菌株形態。1.3.2生理生化特征采用細菌生理生化試劑進行拮抗菌株的生理生化特性檢測，檢測方法嚴格按照說明書進行，參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對菌株進行鑒定。

1.3.3 拮抗菌株種屬鑒定采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，以拮抗菌株的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F：5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-CTACGGCTACCT TGTTACGA-3′進行PCR擴增。PCR反應體系50.0μL：2×TaqPCR Mix 25.0μL，上、下游引物各1.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 21.0μL；擴增程序：95℃預變性5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進行35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI進行序列比對。利用MEGA 7.0采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1.4 拮抗菌發酵條件優化

1.4.1 拮抗菌最佳培養基組分篩選最佳碳源、氮源及無機鹽的篩選參照楊亞男（2017）和何明川等（2021）的方法，以豆芽汁為基礎培養基，分別加入2%的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉進行最佳碳源篩選；分別加入1%的氯化銨、酵母浸粉、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨進行最佳氮源篩選；分別加入0.3%的MgSO4·7H2O、CaCO3、K2HPO4和KH2PO4進行最佳無機鹽篩選。每處理3次重復。根據碳源、氮源及無機鹽單因素試驗結果，設置3因素3水平正交試驗，對其最佳用量進行優化，以確定最佳培養基組分配方。

1.4.2 拮抗菌培養條件優化參照何明川等（2021）的方法，按照1.4.1優化結果配制培養基，通過單因素試驗進行培養條件優化。轉速設120、150、180、210和240 r/min；培養溫度設24、28、32和36℃；培養曲線測定分別在0～12 h內每隔2 h測量1次，12～24 h每隔4 h測量1次，此外在36、48、60和72 h分別測量1次；pH設4、6、7、8和10；初始接種量分別加入2%、4%、6%、8%和10%種子液進行測定。振蕩培養，測量菌液在600 nm波長時的OD值，確定拮抗菌濃度，進而得到最佳培養條件。每組試驗設3次重復。

1.5 室內防效試驗

1.5.1 拮抗菌株懸浮液制備挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL NYBD液體培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫搖床28℃下180 r/min振蕩培養24 h后得到拮抗菌菌懸液，采用平板菌落計數法調節菌懸液濃度至109CFU/mL。

1.5.2 盆栽防效試驗選取長勢基本一致的熱研1號檳榔苗移栽至裝有滅菌土∶蛭石＝1∶1的花盆中，緩苗15 d左右，采用傷根灌注法（劉斯晗等，2021）向試驗組和對照組每盆分別接種孢子濃度為107CFU/mL的可可毛色二孢菌孢子液200 mL，接種病原菌10 d后，用濃度為109CFU/mL的拮抗菌菌懸液對檳榔苗進行灌根處理，每株苗接種拮抗菌液200 mL，同時對照組每株淋入無菌NYBD培養基200 mL。每組5次重復。定期觀察檳榔幼苗感病與生長情況，計算幼苗發病率（趙曉霞等，2019）。

1.6 統計分析

試驗數據采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，使用Duncan’s新復極差法進行顯著性檢驗，使用GraphPad prim 8.0.2作圖。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選結果

從采集的檳榔根組織和根際土壤樣本中共分離到248株細菌。通過平板對峙法篩選，得到5株對可可毛色二孢菌具有拮抗作用的菌株，且5株拮抗菌的抑菌率均在60.00%以上，其中菌株wrj-2-5的抑制率最高，為74.07%，抑菌帶寬度達8.50 mm，表明菌株wrj-2-5對可可毛色二孢菌具有較好的抑制作用（圖1和表1）。選取菌株wrj-2-5進行后續試驗。

表1 5株拮抗菌株對可可毛色二孢菌的抑制作用Table 1 Bacteriostasis of 5 antagonistic bacterial strains on L.theobromae

2.2 拮抗菌wrj-2-5菌液對3種檳榔根部病原菌的抑制作用

菌株wrj-2-5菌液對3種檳榔根部病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均有較好的抑制作用，抑制率均在70.00%以上（表2）。

表2 拮抗菌wrj-2-5菌液對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制作用Table 2 Bacteriostasis of antagonistic bacteria solution wrj-2-5 on L.theobromae，F.oxysporum and T.paradoxa

2.3 拮抗菌株鑒定

2.3.1 菌株wrj-2-5形態學及生理生化特征將菌株wrj-2-5接種至NA培養基上，32℃培養24 h后生長良好，菌落形態近圓形，邊緣較整齊，為淡黃色，表面突起，平滑，干燥；菌體呈短桿狀，大小約0.8～1.0 μm×1.0～1.5μm。為革蘭氏陰性菌，能水解明膠，但不能水解淀粉，不能利用甘露醇、硫化氫，V-P反應為陰性等，對照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001），初步將菌株wrj-2-5歸為假單胞菌屬（Pseudomonas）（圖2、表3）。

表3 拮抗菌株wrj-2-5的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacterial strain wrj-2-5

2.3.2 菌株wrj-2-5 16S rDNA序列分析結果由16S rDNA測序結果得出擴增后的菌株wrj-2-5序列長度為1439 bp，將測序結果通過BLAST程序與GenBank中序列進行比對分析，選取13個同源性較高的菌株序列，并以Azorhizophilus paspail（LN874287.1）為外群，用MEGA 7.0的NJ法構建菌株wrj-2-5系統發育進化樹。由圖3可知，菌株wrj-2-5的16S rDNA序列與銅綠假單胞菌（P.aeruginosaHF572851.1）處于同一分支，遺傳距離最近，相似性達98%。結合菌株形態學觀察和生理生化檢測結果，將菌株wrj-2-5鑒定為銅綠假單胞菌。

2.4 菌株wrj-2-5發酵條件優化結果

2.4.1 不同碳源對菌株wrj-2-5生長的影響由圖4可知，菌株wrj-2-5在5種碳源中均可生長，但當以葡萄糖為碳源時生長最佳，菌液OD600達3.47，顯著高于其他碳源處理（P＜0.05，下同）。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳碳源為葡萄糖。

2.4.2 不同氮源對菌株wrj-2-5生長的影響由圖5可知，菌株wrj-2-5在5種氮源中均可生長，但當以酵母浸粉為氮源時生長最佳，菌液OD600達2.82，其次為牛肉膏和蛋白胨處理，三者間菌液OD600差異不顯著（P＞0.05，下同）。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳氮源為酵母浸粉。

2.4.3 不同無機鹽對菌株wrj-2-5生長的影響由圖6可知，菌株wrj-2-5在4種無機鹽中均可較好地生長，且不同無機鹽處理的菌液OD600差異不顯著，其中以MgSO4·7H2O為無機鹽時菌株wrj-2-5生長最佳，菌液OD600達2.03。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳無機鹽為MgSO4·7H2O。

2.4.4 菌株wrj-2-5培養基組分正交試驗結果以葡萄糖、酵母浸粉和MgSO4·7H2O為因素的正交試驗結果（表4）顯示，RC＞RB＞RA，根據表中K值大小，得出最佳培養基組合為1.5%葡萄糖、1.5%酵母浸粉、0.2%MgSO4·7H2O，即優化培養基配方為葡萄糖1.5 g、酵母浸粉1.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、水100 mL。

表4 葡萄糖、酵母浸粉和MgSO4·7H2O正交試驗結果Table 4 Orthogonal test results of glucose，yeast extract and MgSO4·7H2O

2.4.5 不同培養條件對菌株wrj-2-5生長的影響以優化的培養基配方為基礎培養基，通過單因素試驗進行最佳培養條件篩選，依次研究不同轉速、溫度、時間、pH、接種量對菌株wrj-2-5生長的影響。結果顯示，菌株wrj-2-5的最適轉速240 r/min（圖7-A）、最適溫度28℃（圖7-B）、最適種子液接種量8%（圖7-C）、最適初始pH 6（圖7-D）、最適培養時間36 h（圖7-E）。

2.5 盆栽試驗驗證

盆栽試驗觀察發現，對照組有3株植株葉片葉尖首先發黃隨后干枯，主根維管束變黑腐爛，長勢普遍較弱，最后整株枯死，發病率為60.00%；試驗組幼苗整體長勢較好（圖8）。由于檳榔根腐病未進行過分級，不能得出其防治效果，因此本研究用對照組和試驗組的發病率來表示生防菌對病害的防效。由對照組和試驗組的根腐病發病率得出菌株wrj-2-5對由可可毛色二孢菌引起的根腐病具有較好的防治效果。

3 討論

本研究篩選到的生防菌株wrj-2-5為檳榔根內生菌。內生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內部以及細胞間隙的微生物。植物內生菌長期與植物共生在一起，已形成多種防病作用機制，不同內生菌的防病機制可能有所不同，大體分為產生次生代謝物、誘導宿主植物產生抗性、與病原菌競爭3種作用機制，且3種作用機制可以相互轉化（宋薇薇等，2018；韋俊宏等，2019；蔣晶晶等，2020）。研究表明，從大豆內生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TF28中分離得到1種分子量為1057 u的抗菌肽伊枯草菌素A，不僅能抑制水稻惡苗病菌（F.nwnilifornu）的菌絲生長及孢子萌發，還能抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和尖孢鐮刀菌等其他病原菌的生長（Zhang et al.，2012）。組織分離法（宋薇薇等，2017）和組織勻漿法（劉波等，2011）是內生菌傳統分離的主要方法，是篩選有益菌株如拮抗菌的最佳選擇（張晨智，2018）。前期研究發現，檳榔根內生細菌分離更適合采用組織勻漿法。內生菌作為潛在生防資源和外援基因載體在農業生產中具有廣闊的應用前景，已成為農業專家研究的焦點（胡桂萍等，2010）。檳榔根腐病是檳榔極易發生的病害，主要以葉尖變黃、根莖腐爛變色為主，是由多種病原引起的真菌性病害（李增平等，2006）。本研究對其中一種病原可可毛色二孢菌進行拮抗菌篩選，得到1株拮抗效果好的菌株wrj-2-5，并發現菌株wrj-2-5對檳榔其他根腐病病原也有較好的抑制作用，該菌株經鑒定為銅綠假單胞菌，在拮抗菌生理生化測定中硝酸鹽還原和檸檬酸鹽利用與黃妙容等（2017）測定的結果存在差異，可能是由于菌株生長的環境、分離的部位及菌株的進化等原因造成，但本研究結果基本符合《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）中假單胞菌屬的特性。

銅綠假單胞菌作為生防菌株的研究時間較短（蔣海霞等，2015），目前發現其產生的吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-酰胺、藤黃綠膿菌素、3,4-二羥基-N-甲基-4-苯并二氫吡喃酮-丁酰胺、L-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸和鼠李糖脂等一系列次生代謝物質均有較強的抑菌作用（Bano and Musarrat，2003；Sulochana et al.，2014）。銅綠假單胞菌除具有抗病作用外，還有一定的促生作用：代謝產生鐵載體，通過特異的轉運系統將鐵元素轉移至體內，供植物生長（蔣海霞等，2015）。已有報道銅綠假單胞菌菌液對煙草青枯病的防治效果為60%，且優于農用鏈霉素的防效（胡軍華等，2009），對番茄枯萎病防效達81%（郝曉娟等，2011）；鐘小燕等（2009）報道假單胞菌次生代謝物質對香蕉枯萎病有較好的抑制作用。本研究從健康檳榔根中分離篩選到的銅綠假單胞菌菌株wrj-2-5對3種檳榔根部病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制率達70.00%以上，通過盆栽試驗發現菌株wrj-2-5對根腐病有較好的防治效果，研究結果為可可毛色二孢菌的生物防治提供了參考依據。

銅綠假單胞菌在生長過程中能產生多種抑菌物質，在外界營養和發酵均適宜的條件下，其產生的抑菌物質通常更豐富（葉云峰等，2011）。對培養基和發酵條件進行優化能提高生物農藥制劑的抑菌效果，節約生產成本（力治剛，2016）。因此，本研究采用單因素變化試驗等進行了菌株wrj-2-5的最佳發酵培養基配方篩選與發酵條件優化。本研究菌株wrj-2-5的最佳發酵條件與韓志雪等（2019）對銅綠假單胞菌MEW079的優化結果相比，在單因素試驗確定最佳碳源和發酵的最佳轉速時，菌株wrj-2-5生長的最佳碳源是葡萄糖，而菌株MEW079生長的最佳碳源是蔗糖，菌株wrj-2-5發酵時的最佳轉速是240 r/min，而菌株MEW079發酵時的最佳轉速為150 r/min，其他發酵條件則基本相似，2株銅綠假單胞菌最佳發酵條件存在差異的原因可能是由于菌株來源、生境、用途等不同所造成，后續應再次驗證。本研究結果為銅綠假單胞菌的生物防治提供了更多的參考及依據，下一步將加強菌株wrj-2-5次生代謝產物分離等方面的研究。

4 結論

經鑒定菌株wrj-2-5為銅綠假單胞菌，其對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均有較好的抑制作用，對由可可毛色二孢菌引起的檳榔根腐病有較好的防治效果，可作為研制檳榔根腐病生防菌劑的候選菌株資源。