1株桉大毛蟲病原真菌的分離鑒定及其寄主范圍測定

樊春麗，羅來鳳，溫文照，韋文飛，韋繼光*

（1廣西大學農學院，廣西南寧 530004；2廣西國有欽廉林場，廣西欽州 535099；3廣西國有維都林場，廣西來賓 546100）

0 引言

【研究意義】近年來，農林害蟲的發生程度日益加劇，發生范圍不斷擴大，嚴重影響我國農業和林業的發展（劉冬等，2014）。目前對于害蟲的防治以化學防治為主，但化學防治存在諸如引起昆蟲體內產生抗性、昆蟲再猖獗以及農藥殘留從而污染環境等問題，化學農藥的不當使用導致害蟲快速產生抗藥性，而害蟲再猖獗通常相伴抗藥性而生，且抗藥性越嚴重農藥殘留越多，給環境帶來巨大壓力。要解決這些問題，化學農藥的使用必須合理得當；此外，利用生物殺蟲劑對害蟲進行防治也是緩解化學農藥對環境破壞的一項有力舉措。生物殺蟲劑來源于真菌、細菌、病毒及其活性代謝物（Bode，2009；Lacey et al.，2015）。其中蟲生真菌（Entomophagous fungus）是一種重要的生物殺蟲劑，其能侵入昆蟲體內寄生從而使昆蟲發病致死。從目前的形勢來看，蟲生真菌因具有生產方便、成本低廉、寄主范圍廣、害蟲不產生抗藥性和保護環境等優點在未來對害蟲的防治中具有廣闊的應用前景（耿敬可等，2020）。【前人研究進展】被昆蟲病原真菌感染是致使自然界中昆蟲死亡的原因之一。隨著時間的推移，蟲生真菌不斷地被人們發現，種類也越來越多。據不完全統計，世界上被記載的蟲生真菌有100屬1000多種（王記祥和馬良進，2009；劉春來，2017）。19世紀60年代以來開發了大量的真菌殺蟲劑和殺螨劑，至少有12種真菌被用作真菌殺蟲劑和殺螨劑的活性劑，其中最常見的有白僵菌（Beauveria bassiana）、綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）和布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）（Faria and Wraight，2007）。棒束孢屬蟲生真菌逐漸被人們發現并被運用于生物防治中，其中，常見的棒束孢屬有粉棒束（I.farinosa）、玫煙色棒束孢（I.fumosorosea）、細腳棒束孢（I.tenuipes）和環鏈棒束孢（I.cateniannulata）等。爪哇棒束孢（I.javanica）是棒束孢屬中一種重要的昆蟲病原真菌，但目前關于該菌的報道還相對較少，且其已明確的寄主范圍相對較小。展茂魁等（2012）將一株從茶小綠葉蟬上分離得到的爪哇棒束孢接種茶小綠葉蟬，其毒力相較于從其他葉蟬上分離得到的活性較高的2株球孢白僵菌而言分別高2.33～7.26倍和6.08～27.62倍；陳名等（2014）將一株分離自小綠葉蟬的爪哇棒束孢菌株用0.1%吐溫-80水溶液配成1×108個孢子/mL，采用Potter噴霧塔噴霧接種假眼小綠葉蟬若蟲，12 d后假眼小綠葉蟬若蟲死亡率達100%；鄧嘉茹等（2020）從一頭自然感病的埃及吹綿蚧中分離得到1株爪哇棒束孢IJID003，當分生孢子濃度為1×108個/mL時對埃及吹綿蚧2齡若蟲、3齡若蟲和雌成蟲的半數致死時間（LT50）分別為1.89、2.29和2.31 d；斜紋夜蛾［Spodoptera litura（Fabricius）］幼蟲取食經1.00×107孢子/mL爪哇棒束孢浸泡處理的甘藍葉片48 h后死亡率達86.96%（蘇湘寧等，2021）；張志春等（2020）將爪哇棒束孢孢子液均勻噴霧于帶有非洲菊煙粉虱的黃瓜葉片正反面，7 d后非洲菊煙粉虱成蟲的死亡率達100%；爪哇棒束孢對水稻害蟲褐飛虱有很高的致病力（Zhao et al.，2020）。有研究表明，爪哇棒束孢在對害蟲產生致病力的同時，還可抑制植物病害的發生（Kang et al.，2018；Lee et al.，2019；Lee and Kim，2019）。【本研究切入點】當前農林害蟲頻繁發生，以菌治蟲是對害蟲進行防治的重要手段，但目前高毒力且寄主范圍廣的蟲生真菌種類較少。【擬解決的關鍵問題】采用常規組織分離法從自然感染死亡的桉大毛蟲上分離病原菌，經致病性測定后，通過菌株形態學特征觀察和rDNA-ITS、EF1-α、β-tublin基因測序相結合對病原菌進行鑒定，并在此基礎上進一步測定病原菌的生物學特性、寄主范圍、對4齡東亞飛蝗若蟲、紅火蟻和4齡馬尾松毛蟲幼蟲的毒力及對桉樹林害蟲的防治效果，以期為該病原菌在害蟲生物防治上的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病樣從廣西國有欽廉林場桉樹上采集被真菌感染的桉大毛蟲僵蟲典型樣品，將其保存于試管并帶回實驗室進行拍照后保存，備用。

1.1.2 培養基PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1000 mL；查氏培養基：蔗糖30.00 g、NaNO33.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20.00 g、蒸餾水1000 mL。

1.1.3 供試害蟲桉大毛蟲［Suana divisa（Moore）］幼蟲采集于廣西國有維都林場；東亞飛蝗［Locusta migratoria manilensis（Meyen）］蟲卵來源于云南楚雄，在養蟲室內以玉米葉片喂養，飼養至所需蟲態；紅火蟻［Solenopsis invicta（Buren）］于廣西南寧市邕江邊捕捉，捕獲后挑出大小一致、活性較強的蟲體進行試驗；馬尾松毛蟲［Dendrolimus punctatus（Walker）］由廣西林業科學研究院提供。用于病原菌寄主范圍測定的4目16種害蟲：桉蝙蛾［Endoclita signifer（Walker）］、馬尾松毛蟲、草地貪夜蛾［Spodoptera frugiperda（Smith）］、綠刺蛾（Parasasp.）、綠黃枯葉蛾［Trabala vishnou（Lefebure）］、桉袋蛾［Acanthopsyche subferalbata（Hampson）］、油桐尺蛾［Buzura suppressatia（Guenee）］、橙帶藍尺蛾［Milionia basalis（Walker）］、小用克尺蛾［Jankowskia fuscaria（Leech）］、綠脈錦斑蛾［Chalcosia pictinicornis auxo（Linnaeus）］、樟巢螟［Orthaga achatina（Butler）］、紅火蟻、家白蟻［Coptotermes formosanus（Shiraki）］、東亞飛蝗、螽斯屬（Tettigoniasp.）和榕透翅毒蛾［Perina nuda（Fabricius）］，其中，桉蝙蛾、綠刺蛾、綠黃枯葉蛾、桉袋蛾、油桐尺蛾、小用克尺蛾和螽斯采集于廣西國有維都林場，馬尾松毛蟲由廣西林業科學研究院提供，草地貪夜蛾和榕透翅毒蛾由廣西大學農學院應用昆蟲研究所提供，橙帶藍尺蛾采集于廣西拉浪林場，綠脈錦斑蛾和樟巢螟采集于廣西欽廉林場，紅火蟻捕捉于廣西南寧市邕江邊，家白蟻由廣西南寧天鷹有害生物防治公司提供，東亞飛蝗蟲卵來源于云南楚雄。

1.2 病原菌分離

在超凈臺中將死蟲放入盛有75%酒精的燒杯中浸泡消毒30 s，再轉移至5%次氯酸鈉中浸泡消毒3 min，將蟲體取出依次放入3瓶無菌水中沖洗后置于滅菌濾紙上晾干表面水分，把蟲體解剖成小塊，然后將組織塊放置在含有50μg/mL鏈霉素的PDA培養基上，每皿放5塊，置于25℃下培養，待其長出菌絲后用挑針挑取菌絲到PDA培養基上進行純化培養。純化培養重復3次，單孢分離選出長勢較好的菌株并接種于PDA斜面培養基，置于4℃冰箱保存備用。

1.3 病原菌致病性測定

將病原菌接于PDA培養基上培養，待其產孢后用0.05%吐溫-80配制成1×108孢子/mL接種桉大毛蟲，對照組用0.05%吐溫-80處理，置于26 °C培養箱中光、暗各12 h培養，喂以新鮮的桉樹葉片。定期觀察桉大毛蟲感染死亡情況。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態學鑒定挑取純化培養的菌株菌落邊緣菌絲轉接至PDA培養基中央，于26℃恒溫培養箱中培養，觀察菌落形態、顏色、菌絲疏密程度等形態特征，并挑取菌絲制成玻片，置于光學顯微鏡和蔡司顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子形態。

1.4.2 分子鑒定根據NuClean Plant Genomic DNA Kit試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）說明書進行病原菌DNA提取，以提取的DNA為模板，選擇目的基因核糖體轉錄間隔序列（ITS）、延伸因子-α（EF1-α）和β-微管蛋白基因（β-tubulin）進行擴增與測序。擴增體系25.000μL：10×PCR Buffer 2.500μL，Taq酶0.125μL，dNTP 0.500μL，上、下游引物各1.000μL，DNA模板1.000μL，ddH2O 18.875 μL。ITS、β-tubulin的PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃30 s、52℃30 s、72℃1 min，進行35個循環；72℃延伸10 min。EF1-α的PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃30 s、55℃45 s、72℃90 s，進行35個循環；72 °C延伸7 min。擴增完成后，樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。用Bioedit v7.0.9和DNAman v6對獲得的測序結果進行處理，并在GenBank數據庫進行BLAST比對，下載可信度高的相關序列，利用MEGA 7.0采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育進化樹。構建發育樹時進行自舉檢驗，重復抽樣1000次。

1.5 病原菌生物學特性測定

1.5.1 不同光照條件對病原菌菌絲生長和產孢的影響在超凈工作臺上，用直徑為6 mm的打孔器沿著在PDA培養皿上活化培養6 d的病原菌菌落邊緣打孔，用鑷子將菌絲塊菌面朝下放置于新的PDA培養皿中央，用封口膜封口后分別置于全光照（24 L∶0 D）、光暗交替（12 L∶12 D）和全黑暗（0 L∶24 D）3種光周期培養箱中培養，培養溫度為25 °C。每處理3個重復。于第9 d采用十字交叉法測量菌落直徑，并用0.05%吐溫-80將孢子洗下，搖勻后用血球計數板測定產孢量。

1.5.2 不同溫度對病原菌菌絲生長和產孢的影響在PDA培養基中心移入直徑為6 mm的病原菌活化菌落邊緣的菌絲塊，封口后分別置于5、10、15、20、24、26、28、30和35℃的培養箱中培養。每處理3個重復。菌落直徑和產孢量測定同1.5.1。

1.5.3 不同pH對病原菌菌絲生長和產孢的影響將新鮮的PDA培養基高壓滅菌后用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液在無菌條件下將培養基的pH調節至4、5、6、7、8、9、10和11共8個酸堿度，倒好PDA培養基后將直徑為6 mm的菌塊接種于不同pH的PDA培養基中央，封口后置于25℃培養箱中培養。每個酸堿度為一個處理，每處理3個重復。菌落直徑和產孢量測定同1.5.1。

1.5.4 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長和產孢的影響采用查氏培養基為基礎培養基，以蔗糖為碳源，測定酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、尿素、甘氨酸對菌絲生長和產孢的影響；以NaNO3為氮源，測定葡萄糖、果糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、淀粉對菌絲生長和產孢的影響。以不加氮源及不加碳源為對照，每處理3次重復。于第14 d采用十字交叉法測量菌落直徑，并用0.05%吐溫-80將孢子洗下來，搖勻后用血球計數板測定產孢量。

1.6 病原菌寄主范圍測定

用0.05%吐溫-80將病原菌孢子配制成1×108孢子/mL孢子懸浮液接種4目16種害蟲，每種蟲設3個重復，每個重復蟲口數不少于10頭。對照噴灑0.05%吐溫-80溶液。接種后置于25 °C培養箱中光暗各12 h培養，并喂以相應的食物，觀察感染情況。對于被感染死亡的昆蟲，及時進行分離，觀察分離到的菌株與原接種菌株的菌落形態、分生孢子形態是否一致。

1.7 病原菌對東亞飛蝗、紅火蟻和松毛蟲的毒力測定

用0.05%吐溫-80把在PDA培養基上活化培養14 d的病原菌孢子洗脫，得到孢子母液，將母液配成1×105、1×106、1×107和1×108孢子/mL共4個濃度梯度的孢子懸浮液，每個濃度為一個處理，每處理3個重復，每重復15頭東亞飛蝗4齡若蟲和30頭紅火蟻，采用噴灑法將每個濃度的孢子懸浮液噴至東亞飛蝗和紅火蟻上，而后將東亞飛蝗和紅火蟻放入養蟲皿中，東亞飛蝗以新鮮玉米葉喂養，紅火蟻以新鮮玉米粒喂養，置于25 °C培養箱內光暗各12 h培養，對照組的東亞飛蝗和紅火蟻噴灑0.05%吐溫-80水溶液。馬尾松毛蟲則采用浸泡法，將4齡馬尾松毛蟲幼蟲用1×106、1×107和1×108孢子/mL的孢子懸浮液浸泡5 s，將浸泡接種后的馬尾松毛蟲放入培養皿中，以新鮮松針喂養，置于25 °C培養箱內光暗各12 h培養，每處理3個重復，每重復15頭松毛蟲，對照組的松毛蟲則用0.05%吐溫-80水溶液浸泡5 s。每天定時觀察、記錄3種昆蟲的死亡情況，發現死蟲則將其挑出，放至帶有滅菌濾紙的玻璃培養皿中加無菌水保濕培養，觀察其是否長出菌絲。

試驗數據利用SPSS 19.0進行統計分析，運用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

1.8 大田防治試驗

2020年在廣西國有維都林場開展桉樹林害蟲防治試驗，面積約133.33 ha，每公頃用病原菌生產的菌粉15 kg，7月25日—8月2日噴菌粉，其中設13.33 ha的對照區，8月16—17日進行防治效果調查。2021年在廣西國有維都林場平塘分場開展防治試驗，面積40.00 ha，每公頃用菌粉15 kg，10月12—13日噴粉，其中設6.67 ha的對照區，10月22日進行防治效果調查。供試桉樹林均為一年生桉樹，在每個防治區和對照區隨機調查30株以上，主要調查桉樹鱗翅目害蟲、蝗蟲、螽斯、角蟬和廣翅蠟蟬等肉眼可見的害蟲。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定結果

從罹病桉大毛蟲上分離到1株真菌，命名為DMC01，將純化后得到的菌株配制成1×108孢子/mL孢子液接種桉大毛蟲，4 d后處理組桉大毛蟲開始出現死亡并且蟲體上長出白色菌絲，對照組的桉大毛蟲無感染死亡情況發生。從感染死亡的僵蟲分離得到的分離株與原接種菌株的菌落形態、分生孢子形態完全一致，證明分離獲得的菌株是罹病桉大毛蟲的致病菌。

2.2 病原菌形態學觀察結果

從圖1可看出，菌株DMC01在PDA培養基上菌落為絨毛狀圓形，可形成溝壑狀的同心輪紋，待其產孢后孢子層為淺紫灰色，菌落背面為淡黃色。菌絲無色透明，分生孢子梗上產生輪生狀瓶梗，瓶梗基部橢圓形膨大，向上逐漸變細；分生孢子在瓶梗上生長形成孢子鏈，分生孢子呈透明光滑的長橢圓形，大小為3.2～6.5μm×1.3～2.0μm（n=50）。參考相關文獻（代永東等，2016），菌株DMC01與棒束孢屬的形態特征相符，且分生孢子大小與爪哇棒束孢基本一致，初步鑒定該菌株屬于爪哇棒束孢。

2.3 病原菌分子鑒定結果

利用真菌ITS引物ITS1和ITS4、EF1-α引物EF1-526F和EF1-1567R、TUB引物Bt2a和Bt2b對病原菌DMC01的ITS、EF1-α和β-tubulin進行擴增，擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，登錄NCBI對測得的序列分別進行BLAST比對，結果顯示 菌 株DMC01的rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin（GenBank登錄號分別為OM131696、OM177062和OM177063）與I.javanicaCHE-CNRCB 305和I.javanicaCBS 134.22的相似性均達99%以上，基于rDNA-ITS、EF1-α和β-tubulin序列聯合構建的系統發育進化樹（圖2）也顯示，菌株DMC01與I.javanicaCHE-CNRCB 305和I.javanicaCBS 134.22在同一分支，其中I.javanicaCBS 134.22是爪哇棒束孢的模式菌株。結合菌株DMC01形態和分子鑒定結果，可確定菌株DMC01為爪哇棒束孢（I.javanic）。

2.4 菌株DMC01的生物學特性測定結果

2.4.1 不同光照條件對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響從表1可看出，全光照和光暗交替培養條件下菌株DMC01菌絲生長較好，菌落直徑差異不顯著（P＞0.05，下同），且二者菌落直徑均顯著高于全黑暗處理（P＜0.05，下同）；全光照條件下產孢量最多，達1.82×109個/皿，比全黑暗條件下的產孢量高6.5倍，顯著高于光暗交替和全黑暗條件下培養的產孢量。

表1 不同光照條件對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響Table 1 Effects of different light conditions on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.2 不同溫度對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響菌株DMC01在15～30℃條件下均可生長及產孢，但菌落直徑和產孢量隨著溫度的改變而有所差異（表2）。綜合菌落直徑和產孢量，26℃條件下最有利于菌株DMC01菌絲生長和產孢，菌絲直徑為4.10 cm，產孢量為1.42×109個/皿，顯著高于其他溫度條件下的產孢量；24和28 °C條件下菌落直徑分別為3.93和3.80 cm，產孢量分別為0.97×109和0.99×109個/皿，二者間菌落直徑和產孢量差異均不顯著；35℃條件下菌株不生長，5和10℃條件下菌絲生長極慢且不產孢。

表2 不同溫度對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響Table 2 Effects of different temperatures on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.3 不同pH對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響由表3可知，菌株DMC01在pH 4～10條件下均可生長及產孢，其中，pH 7和pH 8時菌絲生長最快，菌落直徑分別為4.58和4.65 cm，兩者間菌落直徑差異不顯著且顯著大于其他pH處理；pH 6和pH 7時產孢量最多，產孢量分別達2.15×109和2.03×109個/皿，兩者間產孢量差異不顯著且顯著大于其他pH處理；pH 11時菌株不生長，菌落直徑和產孢量均為0。因此，pH 7時既有利于菌絲生長，又有利于孢子的產生。

表3 不同pH對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響Table 3 Effects of different pH values on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.4.4 不同碳、氮源對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響由表4可知，菌株DMC01以淀粉為碳源時最有利于菌絲生長，培養第14 d時菌落直徑達5.67 cm，其次是蔗糖和甘露醇，菌落直徑分別為5.60和5.53 cm；最有利于菌株產孢的碳源是蔗糖，產孢量為0.54×109個/皿，顯著高于其他碳源的產孢量；不加碳源的對照菌絲稀少而透明，不產孢。由表5可知，以酵母浸粉和牛肉膏為氮源時最有利于菌株DMC01菌絲生長和產孢，且二者間無顯著差異，菌株的菌落直徑分別為6.07和5.93 cm，產孢量分別為3.71×109和4.01×109個/皿；供試所有氮源均適宜菌株DMC01菌絲生長，但產孢量存在較大差異，其中以牛肉膏作為氮源的產孢量是以甘氨酸作為氮源的產孢量的6.68倍；不加氮源的對照菌絲稀少而透明，不產孢。

表4 不同碳源對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響Table 4 Effects of different carbon sources on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

表5 不同氮源對菌株DMC01菌絲生長和產孢的影響Table 5 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and sporulation of strain DMC01

2.5 菌株DMC01寄主范圍測定結果

用1×108孢子/mL孢子懸浮液對4目16種害蟲進行接種試驗，結果（圖3）顯示，鱗翅目的馬尾松毛蟲、草地貪夜蛾、綠刺蛾、綠黃枯葉蛾、桉袋蛾、油桐尺蛾、橙帶藍尺蛾、小用克尺蛾、綠脈錦斑蛾和樟巢螟，膜翅目的紅火蟻，等翅目的家白蟻及直翅目的東亞飛蝗和螽斯共4目14種害蟲出現感染死亡情況，并均能從僵蟲中分離到與菌株DMC01菌落形態和分生孢子形態一致的病原菌；被感染的昆蟲體表布滿白色菌絲，隨后產生大量孢子。供試16種害蟲中僅鱗翅目的桉蝙蛾和榕透翅毒蛾未被感染。

2.6 菌株DMC01對東亞飛蝗、紅火蟻和馬尾松毛蟲的毒力測定結果

由表6和表7可知，菌株DMC01對4齡東亞飛蝗、紅火蟻和4齡馬尾松毛蟲均具有高致病力，隨著菌株DMC01孢子濃度的升高及處理時間的推移，東亞飛蝗、紅火蟻和馬尾松毛蟲的校正死亡率均逐漸升高。在處理后第4 d，1×105和1×106孢子/mL處理下的東亞飛蝗和紅火蟻校正死亡率均較低，在1×108孢子/mL處理下第6 d東亞飛蝗和紅火蟻的校正死亡率均達100.00%；處理8 d后，1×105和1×106孢子/mL處理的東亞飛蝗校正死亡率分別為69.05%和95.24%，其余處理均達100.00%；高濃度孢子液處理下，紅火蟻在第4 d的校正死亡率開始升高，1×107孢子/mL處理下第8 d校正死亡率達100.00%。1×106孢子/mL處理15 d后的馬尾松毛蟲的校正死亡率依然較低，僅為27.91%，但在1×108孢子/mL濃度處理下第10 d的校正死亡率達100.00%。

表6 菌株DMC01對東亞飛蝗4齡若蟲和紅火蟻的毒力Table 6 Virulence of strain DMC01 to the 4th instar larvae of L.migratoria manilensis（Meyen）and S.invicta（Buren）

表7 菌株DMC01對馬尾松毛蟲4齡幼蟲的毒力Table 7 Virulence of strain DMC01 to the 4th instar larvae of D.punctatus（Walker）

2.7 大田防治試驗結果

大田防治結果（表8）顯示，2020年菌株DMC01菌粉對桉樹林間所有害蟲的平均防效為51.9%，對桉樹鱗翅目害蟲的平均防效達60.9%；2021年對桉樹林間害蟲的平均防效為79.1%，對桉樹林間鱗翅目害蟲的平均防效達81.4%。從防治效果看，2021年的防效優于2020年；同時，大田防治后從白蛾蠟蟬（同翅目）死蟲中分離到與菌株DMC01形態一致的菌株，證明菌株DMC01孢子粉也能感染白蛾蠟蟬。

表8 菌株DMC01對桉樹害蟲的防治效果（%）Table 8 Control effect of strain DMC01 on eucalyptus pests（%）

3 討論

棒束孢屬曾在1974年被Samson并入擬青霉屬（Sampson，1975），直至2005年才被Hodge等（2005）提議重新恢復為棒束孢屬。在菌絲端部或短側枝上輪生瓶狀或近球形的分生孢子梗、分生孢子為單孢鏈狀等是棒束孢屬的主要特征（黃勃等，2008）。本研究中的菌株DMC01，從形態學上觀察，其符合棒束孢屬爪哇棒束孢的特征，但由于棒束孢屬中存在許多形態相似的種，為保證鑒定結果的準確性，本研究對該菌株的ITS、β-tubulin和EF1-α序列進行測定，采用3種序列聯合構建系統發育進化樹，結果進一步證實菌株DMC01為爪哇棒束孢。

生物學特性是當前對蟲生真菌的研究方向之一（蘆俊佳等，2018；雷研圓等，2020），只有在了解其生物學特性后，才能在培養過程中達到最佳產孢量。在棒束孢屬中，有學者測定了粉棒束孢和玫煙色棒束孢的生物學特性（雷妍圓等，2010；劉飛，2018），但目前尚未發現關于爪哇棒束孢生物學特性測定的報道。不同的蟲生真菌種類其生物學特性會有一定差異，而大多數蟲生真菌的最佳生長和產孢溫度為25和26℃，pH在7左右，與本研究中爪哇棒束孢菌株DMC01的最佳生長和產孢溫度及pH基本一致。菌株DMC01最佳生長和產孢的光照條件為全光照條件，與黃鵬等（2018）及趙鵬飛等（2019）對金龜子綠僵菌和曲霉的研究結果存在差異，而與張仙紅等（2006）對玫煙色擬青霉的研究結果一致。最有利于菌株DMC01生長的碳、氮源分別為淀粉和酵母浸粉，最有利于產孢的碳、氮源分別為蔗糖和牛肉膏，與張仙紅等（2006）對玫煙色擬青霉及張亞波等（2015）對綠僵菌的研究結果有所差異。可見，不同的蟲生真菌的生物學特性存在差異。本研究對爪哇棒束孢菌株DMC01進行生物學特性測定，有利于進一步加深對爪哇棒束孢的認識，從而為篩選最佳培養條件和大規模生產孢子粉提供理論基礎。

有關爪哇棒束孢寄主的報道相對較少，且大部分是在鱗翅目昆蟲上記載（Shimazu and Takatsuka，2010）。目前已報道的爪哇棒束孢寄主有鱗翅目的舞毒蛾（Shimazu and Takatsuka，2010）、美國白蛾（Wang et al.，2020）、斜紋夜蛾（蘇湘寧等，2021），同翅目的假眼小綠葉蟬（陳名等，2014）、埃及吹綿蚧（鄧嘉茹等，2020；鄧嘉茹等，2021）、扶桑綿粉蚧（鄧嘉茹等，2021）、柑橘木虱（Qasim et al.，2018），纓翅目的薊馬（Thrips）（范詠梅等，2021），半翅目的蚜蟲（Lee et al.，2019；Bocco et al.，2021）、煙粉虱（張志春等，2020）、褐飛虱（Zhao et al.，2020），鞘翅目的黃曲條跳甲（陳緯等，2021）等。本研究用爪哇棒束孢菌株DMC01的孢子液室內接種多種害蟲，結合大田防治試驗發現其能感染馬尾松毛蟲、草地貪夜蛾、綠刺蛾、綠黃枯葉蛾、橙帶藍尺蛾、小用克尺蛾、油桐尺蛾、桉袋蛾、綠脈錦斑蛾、樟巢螟、白蛾蠟蟬、東亞飛蝗、螽斯、紅火蟻、家白蟻等5目15種害蟲，且均能從被感染后的蟲體上分離到與菌株DMC01菌落和分生孢子形態一致的病原菌。目前尚未見爪哇棒束孢對上述害蟲寄生的相關報道，因此，本研究在前人研究基礎上加深了對爪哇棒束孢寄主范圍的認識，不僅增加了寄生鱗翅目和同翅目害蟲種類，同時還增加了直翅目、膜翅目和等翅目的寄主，這為爪哇棒束孢的利用提供了更廣闊的前景。同種蟲生真菌其來源不同，寄主范圍也可能存在差異，未來在繼續對菌株DMC01進行寄主范圍測定的同時，還可用其對前人已測定過的寄主進行驗證。

較早被人們發現并運用于生物防治上的重要蟲生真菌資源有白僵菌和綠僵菌等，目前包括東亞飛蝗、紅火蟻和馬尾松毛蟲在內的許多害蟲其主要病原真菌以白僵菌和綠僵菌為主。侯穎等（2015）從一頭黑蚱蟬僵蟲中分離得到1株綠僵菌菌株Ma121，將該菌株以1×107～1×108孢子/mL處理東亞飛蝗，其校正死亡率均在90%以上；王義勛等（2016）從不同僵蟲上分離獲得20株白僵菌菌株后均以1×107孢子/mL濃度處理馬尾松毛蟲，其中，接種B-2、B-14和B-19菌株11 d后校正死亡率達100%；吳志鵬和童應華（2020）將11株球孢白僵菌和9株金龜子綠僵菌均以1×107孢子/mL濃度處理紅火蟻，10 d后白僵菌和綠僵菌處理對其校正死亡率分別為（6.47±0.98）%～（67.14±0.22）%和（35.13±1.25）%～（81.93±0.94）%。本研究中以1×108孢子/mL濃度的菌株DMC01孢子接種4齡東亞飛蝗、紅火蟻和4齡馬尾松毛蟲，其校正死亡率在接種6～10 d后均達100.00%，證明爪哇棒束孢菌株DMC01具有高毒力，因此可作為優良菌株對東亞飛蝗、紅火蟻和馬尾松毛蟲等害蟲進行防治，今后還可進一步開展菌株DMC01對其他害蟲的毒力測定，為其他害蟲的防治提供理論基礎。

廣西桉樹種植面積達200萬ha，是我國桉樹種植面積最大的省份。廣西桉樹林害蟲以鱗翅目害蟲如桉小卷蛾、油桐尺蠖、桉袋蛾和小用克尺蛾等為主（劉秀媚和閃瑤，2020），目前對桉樹害蟲防治主要以化學防治為主，利用生物菌粉對桉樹害蟲進行防治的相關報道較少。鄭凌生（2010）用白僵菌粉炮（15、30和60個/ha）對桉樹油桐尺蛾進行防治，對應的校正蟲口減退率分別為68.38%、71.18%和67.50%。本研究將生產得到的爪哇棒束孢菌株DMC01菌粉初步應用于桉樹林害蟲進行野外防治試驗，2020年平均防效為51.9%，2021年平均防效為79.1%，在取得較好防治效果的同時不污染環境，不易使害蟲產生抗性，且能達到控制有害生物的效果，爪哇棒束孢具有廣闊的應用前景。

爪哇棒束孢菌株DMC01是一株極具生物防治潛力的蟲生真菌，其寄主范圍還有待進一步拓展。真菌制劑除要求產孢量大外，常溫貨架期應達12～18個月（Sanyang et al.，2000），同時滿足這2個條件才能更有效地開展野外防治試驗，因此，下一步的研究可圍繞菌粉的貨架期進行。此外，還可開展爪哇棒束孢菌株DMC01的致病機理研究，以豐富其致病性的理論基礎和實踐應用。

4 結論

從自然感染死亡的桉大毛蟲上分離獲得1株爪哇棒束孢菌株DMC01，該菌株對4齡東亞飛蝗若蟲、紅火蟻和4齡馬尾松毛蟲幼蟲均具有高致病力，且其寄主范圍較廣，對桉樹林害蟲有較好的防治效果，具有作為生防菌劑的潛力。