紫花苜蓿根腐病生防菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉博，蒲樂(lè)瑩，陶科，金洪，侯太平

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610064）

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（Medicago sativa）為多年生豆科牧草，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)能力強(qiáng)、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”，是我國(guó)種植面積最大的牧草品種（黃煒和文亦芾，2018）。研究表明，紫花苜蓿在水土保持、土壤改良、植物修復(fù)以及他感作用等生態(tài)功能方面發(fā)揮著一定作用（吳開(kāi)賢和羅富成，2008）。然而，根腐病的發(fā)生成為限制紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一（王梓，2020）。紫花苜蓿根腐病是一種危害嚴(yán)重的土傳性根部病害，其病原種類復(fù)雜，不同地區(qū)存在差異，但多與鐮刀菌（Fusariumspp.）有關(guān)，如尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、變紅鐮刀菌（F.incarnatum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）等（方香玲等，2019；張園園等，2021）。根腐病可在土壤中快速蔓延，使苜蓿根部腐爛直至中空，側(cè)根死亡，分枝減少，固氮和養(yǎng)分吸收能力均受到影響，從而導(dǎo)致牧草產(chǎn)量和質(zhì)量下降，草地利用年限縮短（潘龍其等，2015；支旭欣，2020）。目前苜蓿根腐病在我國(guó)西北、華北和東北的主要苜蓿種植區(qū)大面積發(fā)生，對(duì)我國(guó)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成重大影響（田慧，2021），篩選抗病品種是當(dāng)前防治該病害的最有效途徑，但需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能發(fā)揮效果（楊劍鋒，2021）。生物防治具有安全、綠色、高效的優(yōu)點(diǎn)（Gouli et al.，2021）。青藏高原地理位置和生態(tài)環(huán)境特殊，可能生活著在基因、代謝等方面產(chǎn)生特有生物學(xué)機(jī)制的微生物。因此，從青藏高原環(huán)境中篩選易培養(yǎng)、效果好、適應(yīng)性強(qiáng)的拮抗菌為紫花苜蓿根腐病的生物防治提供了新方向，對(duì)苜蓿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)苜蓿根腐病的控制方法主要有化學(xué)農(nóng)藥防治和篩選抗病品種（李國(guó)良等，2019；楊劍鋒等，2020；張園園等，2021）。然而，化學(xué)農(nóng)藥防治存在易殘留、病原菌易產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題，而篩選抗病品種費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此學(xué)者將目光投向了生物防治。針對(duì)苜蓿根腐病拮抗菌的研究已有報(bào)道。劉莎莎等（2015）從紫花苜蓿根際土壤中篩選出2株對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌具有抑制活性的菌株，經(jīng)鑒定分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CYY-6和短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）CYY-42。張丹（2016）從采集自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)的苜蓿植株中分離出綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）等6株內(nèi)生菌，均對(duì)苜蓿根腐病病原菌具有良好的抑制效果。胡進(jìn)玲等（2017）從紫花苜蓿根部分離出2株內(nèi)生拮抗菌，分別為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）LYZ0069和卡那霉素鏈霉菌（Streptomyces kanamyceticus）LYZ0133，2株拮抗菌對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌及葉片病害病原菌均具有良好的抑制效果。曾亮等（2019）從紫花苜蓿根際土壤中分離篩選出2株拮抗菌，鑒定為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和康寧木霉（T.koningii），對(duì)峙法測(cè)定結(jié)果2株拮抗菌對(duì)4種鐮刀菌的抑制率在54.9%～75.3%。駱丹等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉（T.viride）對(duì)苜蓿根腐病病原菌有較好的抑制效果。劉彥超等（2021）從紫花苜蓿莖部和根部分離出80株內(nèi)生細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法從中篩選出9株對(duì)苜蓿根腐病菌抑制率高于61.00%的細(xì)菌，其中1株類芽胞桿菌屬（Paenibacillus）菌株MS-43對(duì)根腐病菌的抑制率達(dá)63.96%。Li等（2021）從紫花苜蓿根際土壤中分離篩選出1株蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）細(xì)菌菌株I-5，研究發(fā)現(xiàn)菌株I-5的發(fā)酵濾液對(duì)三線鐮刀菌（F.tricinctum）孢子產(chǎn)生、萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均具有抑制作用，抑制率分別達(dá)76.67%、78.93%和55.77%。青藏高原平均海拔在4000 m以上，紫外輻射強(qiáng)、日照時(shí)間長(zhǎng)，特殊的生境孕育著特殊環(huán)境適應(yīng)性和特殊生物學(xué)機(jī)制的微生物資源。鄭有坤（2015）對(duì)青藏高原采集的土壤進(jìn)行了放線菌物種多樣性分析，并從中篩選出11株對(duì)三七根腐病病原菌具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌菌株；賈丹丹（2019）從青藏高原環(huán)境中篩選出46株生防芽胞桿菌，這些菌株在抑菌、促生和抗逆方面具有較高的活性。【本研究切入點(diǎn)】生物防治對(duì)環(huán)境友好，研發(fā)周期相對(duì)較短，是苜蓿根腐病防治研究熱點(diǎn)之一。生活在青藏高原的微生物可能在抑菌活性和抗逆性等方面具有特殊的性質(zhì)，為篩選更多高效、易培養(yǎng)的苜蓿根腐病拮抗菌提供了新方向，但目前針對(duì)苜蓿根腐病生防菌的相關(guān)研究較少，且大部分研究?jī)H針對(duì)單一病原菌。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以青藏高原的健康紫花苜蓿根際土壤為研究對(duì)象，以紫花苜蓿根腐病5種病原菌為靶標(biāo)，采用稀釋涂布法、平板對(duì)峙法和菌絲生長(zhǎng)速率法從中分離篩選拮抗菌株，繼而對(duì)篩選出的拮抗菌株進(jìn)行分類鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化，以確定拮抗菌株的分類地位并提高其抑菌效果，旨在為高抑菌菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品采集地紫花苜蓿根際土壤采集地位于四川省阿壩州紅原縣四川省草原科學(xué)研究院試驗(yàn)地內(nèi)（北緯32°47′，東經(jīng)102°32′），海拔3500 m。

1.1.2 供試病原菌紫花苜蓿根腐病病原真菌：木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、織球殼枯萎菌（Plectosphaerella cucumerina）和尖孢鐮刀菌，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

1.1.4 試劑與儀器主要試劑：革蘭氏染色液、芽胞染色液和細(xì)菌生理生化鑒定管，均由青島海博生物技術(shù)有限公司提供。主要儀器：DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BS-1E恒溫震蕩培養(yǎng)箱（金城海瀾儀器設(shè)備廠）；SWCJ-1FD超凈工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma生物科技有限公司）；SPH-250恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫花苜蓿根際土壤采集于2021年8月進(jìn)行土壤樣品采集。在長(zhǎng)勢(shì)良好的健康紫花苜蓿植株附近，采用五點(diǎn)取樣法和抖土法（唐濤等，2022）采集紫花苜蓿根際土壤。首先去掉0～5 cm的表層土壤，將根際土壤抖落后，用毛刷輕輕將根表面的土壤刷下；將土壤樣品中的殘根等雜物去除后混勻，用四分法留取土樣，裝入無(wú)菌塑封袋并放入冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.2 拮抗菌株的分離與純化利用稀釋涂布法分離紫花苜蓿根際土壤細(xì)菌（周德慶和徐德強(qiáng)，2013）。將土壤樣品配制成10-1～10-6濃度的懸液，分別取上述濃度的土壤稀釋液100μL均勻涂布于NA培養(yǎng)基表面，30℃條件下恒溫培養(yǎng)。挑取形態(tài)、大小和顏色有明顯差異的菌落進(jìn)行純化。采用平板劃線法將菌落純化3～4次（周德慶和徐德強(qiáng)，2013），直至觀察到有單菌落出現(xiàn)，將單菌落轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基試管中，置于冰箱4℃冷藏備用。

1.2.3 拮抗菌株篩選利用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌株（李樞妍等，2021）。將活化好的病原真菌用直徑6 mm打孔器打成菌餅，置于PDA培養(yǎng)基中央，將菌絲的一面朝下，再將分離純化獲得的細(xì)菌以十字交叉法接種在距離菌餅2.5 cm處，28℃條件下培養(yǎng)4～7 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑后計(jì)算抑制率。試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100。

1.2.4 拮抗菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性測(cè)定發(fā)酵濾液的制備參考Mu等（2020）的方法并略有改動(dòng)。將活化好的拮抗菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中，30℃下180 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液；將3 mL種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃下180 r/min培養(yǎng)48 h后，4℃下10000 r/min離心20 min，取上清液；用0.22μm過(guò)濾器反復(fù)過(guò)濾后備用。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定發(fā)酵濾液的活性（Dong et al.，2021）。將發(fā)酵濾液以20%的含量加入PDA培養(yǎng)基中，制成帶毒培養(yǎng)基，并加入50μL/mL的硫酸鏈霉素；將病原真菌接種在帶毒PDA培養(yǎng)基中央，28℃下培養(yǎng)4～7 d后，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率（%）=（對(duì)照組直徑-處理組直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-6 mm）×100。

1.2.5 拮抗菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定平板劃線后，觀察拮抗菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)拮抗菌株進(jìn)行生理生化鑒定（布坎南和吉本斯，1984；東秀珠和蔡妙英，2001）。將拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽胞染色后，置于油鏡下觀察。將拮抗菌株接種到NB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h左右，離心，收集菌株，加入2.5%戊二醛固定（孫明明等，2020），將樣品送至成都里來(lái)生物科技有限公司進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.6 拮抗菌株16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（成都擎科生物科技有限公司）提取拮抗菌株的DNA。PCR擴(kuò)增引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3′）。PCR反應(yīng)體系50μL：1×TSE101金牌Mix 45μL，正、反向引物（10μmol/L）各2μL，DNA模板1μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性3 min；98℃10 s，55℃15 s，72℃15 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將所得序列上傳至NCBI，通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 7.0采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，得到相應(yīng)的登錄號(hào)（Kumar et al.，2016）。

1.2.7 拮抗菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化拮抗菌株發(fā)酵濾液制備及發(fā)酵濾液活性測(cè)定同1.2.4。以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標(biāo)，先采用單因素試驗(yàn)對(duì)碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，每處理3次重復(fù)，初步選出最佳因子。碳源：葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油；氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、酵母浸粉；無(wú)機(jī)鹽：NaCl、KH2PO4、CaCO3、MgSO4。選取抑菌活性最好的單因素的最佳濃度及上下2個(gè)濃度，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方（曲遠(yuǎn)航等，2022）。

1.2.8 拮抗菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化拮抗菌株的發(fā)酵濾液制備及發(fā)酵濾液活性測(cè)定同1.2.4。以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標(biāo)，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上優(yōu)化其發(fā)酵條件，每處理3次重復(fù)。初始pH：將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5；接種量：分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量接入菌種；培養(yǎng)溫度：將培養(yǎng)基分別置于20、25、30、35和40℃下培養(yǎng)；裝液量：在250 mL錐形瓶中分別設(shè)置60、80、100、120和140 mL的裝液量；培養(yǎng)時(shí)間：分別培養(yǎng)12、24、36、48和60 h；搖床轉(zhuǎn)速：設(shè)置120、150、180、210和240 r/min的轉(zhuǎn)速（張穎等，2021）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2019和SPSS 16.0進(jìn)行分析，并用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株篩選結(jié)果

從采集自青藏高原的紫花苜蓿根際土壤中共分離純化出92株細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法測(cè)定92株細(xì)菌對(duì)5種紫花苜蓿根腐病病原菌的拮抗效果，結(jié)果（表1）顯示，92株細(xì)菌中有16株細(xì)菌對(duì)不同病原菌具有抑制作用，其中，菌株L-1、LJ3-1、Z-21、Z-22和Z-23具有較廣譜的抑菌活性。菌株LJ3-1對(duì)5種供試病原菌的抑制率均在60.0%以上，其中對(duì)燕麥鐮刀菌和織球殼枯萎菌的抑制率分別為72.4%和70.2%，綜合各拮抗菌株的抑菌廣譜性和抑菌能力，選擇菌株LJ3-1作為目標(biāo)拮抗菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。菌株LJ3-1對(duì)5種病原真菌的平板對(duì)峙結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 拮抗菌株對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of antagonistic strains against root rot pathogens of alfalfa

2.2 菌株LJ3-1發(fā)酵濾液抑菌活性測(cè)定結(jié)果

采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)菌株LJ3-1發(fā)酵濾液的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（表2）顯示，菌株LJ3-1發(fā)酵濾液對(duì)引起紫花苜蓿根腐病的5種病原菌表現(xiàn)出不同的抑制活性，其中，發(fā)酵濾液對(duì)燕麥鐮刀菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)77.4%；對(duì)織球殼枯萎菌也有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率為75.7%；對(duì)其他幾種紫花苜蓿根腐病病原菌也均產(chǎn)生相應(yīng)的抑制效果。因此，后續(xù)進(jìn)行菌株LJ3-1的抑菌活性測(cè)定時(shí)以燕麥鐮刀菌作為活性追蹤指示菌。

表2 菌株LJ3-1發(fā)酵濾液對(duì)紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of strain LJ3-1 fermentation filtrate against root rot pathogens of alfalfa

2.3 菌株LJ3-1鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株LJ3-1的形態(tài)觀察及生理生化鑒定菌株LJ3-1在NA培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)24 h后觀察，菌落呈近圓形，邊緣不規(guī)則，粗糙，有褶皺（圖2-A）。在光學(xué)顯微鏡下觀察到革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽胞存在（圖2-C和圖2-D）。形態(tài)觀察顯示菌株LJ3-1具有明顯的芽胞桿菌特征。掃描電鏡觀察菌體形態(tài)，可觀察到其細(xì)胞呈桿狀，有的呈鏈狀排列，細(xì)胞長(zhǎng)、寬分別為1.0～2.0μm和0.3～0.6μm（圖2-B）。

菌株LJ3-1的生理生化鑒定結(jié)果（表3）顯示，該菌能液化明膠，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，可利用甘露醇和木糖發(fā)酵，不能利用阿拉伯糖發(fā)酵，不能利用丙酸鹽，接觸酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，V-P反應(yīng)陽(yáng)性，能水解淀粉，能在3% NaCl和7% NaCl胰胨水中生長(zhǎng)。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001），初步鑒定菌株LJ3-1為枯草芽胞桿菌（B.subtilis）。

表3 菌株LJ3-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LJ3-1

2.3.2 菌株16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建以菌株LJ3-1的總DNA為模板對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物公司完成測(cè)序，發(fā)現(xiàn)菌株LJ3-1的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1450 bp。將菌株LJ3-1的16S rDNA序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得登錄號(hào)為OL757697.1。將菌株LJ3-1的16S rDNA序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，并下載相似序列，用MEGA 7.0的NJ法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。從圖3可看出，菌株LJ3-1與枯草芽胞桿菌（B.subtilis）多個(gè)菌株相似性達(dá)99%以上，故將其鑒定為枯草芽胞桿菌。

2.4 菌株LJ3-1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 菌株LJ3-1發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)基組分結(jié)果如圖4所示，當(dāng)碳源為2%葡萄糖（圖4-A）、氮源為2%酵母浸粉（圖4-B）、無(wú)機(jī)鹽為0.5% NaCl時(shí)（圖4-C）菌株LJ3-1的抑菌活性最強(qiáng)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及其最佳濃度，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果（表4）顯示，RC＞RA＞RB，說(shuō)明無(wú)機(jī)鹽組分對(duì)菌株LJ3-1發(fā)酵濾液抑菌活性影響最大，其余依次為葡萄糖和酵母浸粉，其最佳組合為A3B1C2，即菌株LJ3-1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為3%葡萄糖、1%酵母浸粉、0.5% NaCl。

表4 菌株LJ3-1發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of fermentation medium for strain LJ3-1

2.4.2 菌株LJ3-1的發(fā)酵條件優(yōu)化由圖5可看出，當(dāng)發(fā)酵濾液的初始pH為5.0～6.5時(shí)，菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢(shì)，在pH 6.5時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，其后隨著pH增大抑菌活性減弱，因此，發(fā)酵濾液的初始pH應(yīng)控制在6.5～7.0（圖5-A）；當(dāng)接種量為3%時(shí)，菌株LJ3-1的抑菌活性最強(qiáng)，因此，選擇3%的接種量進(jìn)行種子液的接種（圖5-B）；當(dāng)發(fā)酵溫度為35℃時(shí)菌株LJ3-1的抑菌活性最強(qiáng)，因此，選擇35℃作為發(fā)酵溫度（圖5-C）；在250 mL錐形瓶中，裝液量為80 mL時(shí)菌株LJ3-1的抑菌活性最強(qiáng)，因此，在250 mL錐形瓶中裝液量為80 mL最佳（圖5-D）；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在12～36 h時(shí)菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢(shì)，36 h時(shí)達(dá)最大值，隨后開(kāi)始下降，因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為36 h（圖5-E）；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120～180 r/min時(shí)菌株LJ3-1的抑菌活性呈上升趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，隨后開(kāi)始下降，因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min（圖5-F）。

為比較基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基與優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基的抑菌活性，以燕麥鐮刀菌為指示菌，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定2種發(fā)酵液的抑制率，結(jié)果（圖6）顯示，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下菌株LJ3-1對(duì)燕麥鐮刀菌的抑制率達(dá)89.3%，相較于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的抑制率（76.5%）顯著增加12.8%（絕對(duì)值）（P＜0.05，下同），說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

3 討論

近年來(lái)，隨著紫花苜蓿種植面積的擴(kuò)大，根腐病危害也隨之上升，由于農(nóng)牧業(yè)自身的生產(chǎn)特點(diǎn)、環(huán)境保護(hù)和食品安全等方面的要求，化學(xué)農(nóng)藥的使用受到制約（Zhao et al.，2021），人們迫切需要安全、綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的生物防治資源，如生防菌。芽胞桿菌是被廣泛應(yīng)用在植物病害防治上的生防菌，并已被開(kāi)發(fā)成多種生物菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（Hyakumachi et al.，2013；O’Brien，2017）。枯草芽胞桿菌是被研究和開(kāi)發(fā)最廣的生防芽胞桿菌，有研究表明，枯草芽胞桿菌對(duì)灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）和香蕉枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cubense）均有良好的抑制作用（Touréet al.，2004；Furuya et al.，2011；鄭臻，2016）。芽胞桿菌在牧草病害上的應(yīng)用也有報(bào)道，張丹（2016）分離篩選出2株紫花苜蓿內(nèi)生菌Y1和Y5，經(jīng)鑒定均為枯草芽胞桿菌，2株菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的平板對(duì)峙抑制率分別為54.05%和52.70%；梁艷瓊等（2020）篩選出1株解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens），該菌株對(duì)柱花草炭疽病具有良好的抑制效果。本研究從青藏高原的紫花苜蓿根際土壤中分離出92株細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出1株對(duì)紫花苜蓿根腐病多種病原菌具有抑制作用的細(xì)菌LJ3-1，平板對(duì)峙結(jié)果顯示，菌株LJ3-1對(duì)5種供試紫花苜蓿根腐病病原菌的抑制率均在60.0%以上，對(duì)燕麥鐮刀菌和織球殼枯萎菌的抑制率分別為72.4%和70.2%；通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法驗(yàn)證了其發(fā)酵濾液的抑菌活性，結(jié)果顯示，發(fā)酵濾液對(duì)燕麥鐮刀菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)77.4%，對(duì)織球殼枯萎菌也有較強(qiáng)的抑制效果，抑制率為75.7%；通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法綜合鑒定，確定其為枯草芽胞桿菌。

生防菌株會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物從而抑制病原菌的生長(zhǎng)，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化可提高其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量（Zhong et al.，2014）。劉揚(yáng)科等（2021）對(duì)枯草芽胞桿菌YT168-6的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米漿18.2 g/L、K2HPO45 g/L、MgSO410 g/L，優(yōu)化后的發(fā)酵條件使其抗菌肽sublancin產(chǎn)量提高2.09倍。因此，發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)生防菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要作用。本研究以發(fā)酵濾液抑菌活性為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽胞桿菌菌株LJ3-1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，結(jié)果表明，最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：3%葡萄糖、1%酵母浸粉和0.5% NaCl。本研究結(jié)果與劉揚(yáng)科等（2021）的研究存在一定差異，原因可能是不同菌株對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的喜好不完全相同，菌株LJ3-1產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可能不是抗菌肽sublancin。本研究?jī)H在搖床條件下對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，今后尚需在發(fā)酵罐中進(jìn)一步驗(yàn)證，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的成本控制也需進(jìn)一步探究。

本研究在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行了菌株LJ3-1的發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果顯示，最適pH為6.5～7.0，說(shuō)明該菌株更適宜在偏酸的環(huán)境中生長(zhǎng)代謝。本研究的土壤采集地位于紅原縣，張雪蓮（2015）在對(duì)紅原人工草地的土壤理化性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)大部分土壤偏酸性；馬麗（2021）在對(duì)紅原高寒草地土壤的理化性質(zhì)研究中也得到相同結(jié)論。推測(cè)菌株LJ3-1更適宜在偏酸的環(huán)境中生長(zhǎng)代謝可能與其生存的土壤環(huán)境有關(guān)。菌株LJ3-1在發(fā)酵溫度35℃時(shí)生長(zhǎng)良好、最佳接種量為3%、搖床轉(zhuǎn)速以180 r/min為宜、最佳裝液量為80 mL、發(fā)酵時(shí)間在36 h時(shí)抑制率最高，隨后開(kāi)始下降，抑制率下降的原因可能是菌株生長(zhǎng)進(jìn)入后期，而發(fā)酵培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分消耗殆盡，導(dǎo)致活性物質(zhì)產(chǎn)量下降。基于優(yōu)化的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，菌株LJ3-1發(fā)酵濾液的抑菌活性達(dá)89.3%，顯著高于優(yōu)化前的培養(yǎng)基。本研究從青藏高原紫花苜蓿根際土壤中篩選出的菌株LJ3-1具有較好的生防菌開(kāi)發(fā)潛力，關(guān)于菌株LJ3-1的抑菌機(jī)理等相關(guān)問(wèn)題是下一步研究的方向。

4 結(jié)論

以青藏高原采集的紫花苜蓿根際土壤為研究對(duì)象，用平板對(duì)峙法和菌絲生長(zhǎng)速率法篩選出1株對(duì)紫花苜蓿根腐病5種病原菌均具有抑制效果的拮抗菌株LJ3-1；對(duì)篩選出的菌株LJ3-1進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，提高了其抑菌活性。菌株LJ3-1具有較強(qiáng)的抑菌效果，可作為研制苜蓿根腐病生物防治菌劑的候選菌株資源。