厚鱗柯葉水提物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌機理

羅澤萍，潘立衛，姚東梅

（河池學院化學與生物工程學院，廣西河池 546300）

0 引言

【研究意義】奶牛乳房炎是一種主要由病原微生物感染乳腺組織引起的炎癥反應，不僅影響奶牛產奶量而對奶牛養殖場造成直接的經濟損失，還影響乳品質量，對人體健康和公共衛生安全造成極大威脅（陳云等，2021）。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引發奶牛乳房炎最普遍、最主要的病原菌之一（孟丹等，2017；趙艷坤等，2018），而長期使用抗生素治療奶牛乳房炎極易產生致病性強、多重耐藥的金黃色葡萄球菌，其中就包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）。MRSA是青霉素結合蛋白（Penicillin binding protein，PBP）改變且對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌，其耐藥是由于獲得編碼PBP2a的mecA基因，而與金黃色葡萄球菌通常產生的PBP不同。PBP2a表現出異常低的β-內酰胺親和力，且在正常致死的β-內酰胺濃度下仍具有活性，可進行細胞壁合成（陳云等，2019；李澤坤等，2021）。MRSA可引起不同類型的感染，除了與家畜相關的感染外，還會引起醫院獲得性和社區獲得性的MRSA感染，如肺炎、蜂窩織炎、骨髓炎、心內膜炎及腦膜炎等（王俁棋等，2021）。因此，開展MRSA耐藥機制研究及其藥物篩選對科學防控奶牛乳房炎和保障公共衛生安全均具有重要意義。【前人研究進展】目前，MRSA感染的治療方法主要采用抗生素療法和抗生素替代療法。抗生素治療可選擇萬古霉素、替考拉寧、利奈咗烷、特拉萬星和特地唑胺等（王宗朝等，2022）；抗生素替代療法包括中藥、微生態制劑（Jayashree et al.，2018）、溶菌酶（Li et al.，2019）、噬菌體（蘇子龍等，2020）、疫苗免疫（Miller et al.，2020）、生物表面活性劑（Nataraj et al.，2021）、細菌素（Walsh et al.，2021）及抗菌肽（Atipairin et al.，2022）等。中藥活性成分具有抗菌消炎、活血化瘀、調節免疫機能等功效，且毒副作用小，不易產生耐藥性，在抗MRSA感染方面具有明顯優勢（楊健等，2016）。張鐵煥等（2020）對19種中藥乙醇提取物進行體外抗菌試驗，結果發現地錦草、四塊瓦、三顆針等14種中藥對MRSA有顯著的抗菌作用。此外，中藥治療MRSA感染與中醫描述的熱毒證十分吻合，已有研究證實魚腥草注射液（黃慶紅等，2017）、參附注射液（李勁松等，2017）、參麥注射液（賈曉佳，2019）及痰熱清注射液（姜童童，2019）對MRSA感染的控制和治療具有極大優越性。可見，中藥在抗MRSA感染方面具有良好的開發應用前景。【本研究切入點】厚鱗柯（Lithocarpus pachylepisA.Camus）是殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）的一種植物，分布在我國云南和廣西等地，其果實壁厚7～10 mm，種仁具有補腎壯陽的功效，民間多用于治療腎虛疾病（陳先榮等，2017）。已知同科植物中的浙尖栲（Castanopsis acuminatissima）、沒食子樹（Quercus infectoria）、冬青櫟（Q.ilex）、歐洲栗（Castanea sativa）、甜茶（L.celebicus）等均具有抑菌作用（周磊等，2012；田甜和文金華，2020），但關于厚鱗柯葉水提物（Aqueous extract ofLithocarpus pachylepisleaf，AELL）的藥用價值研究鮮見報道，針對AELL抑菌作用機制的研究國內外尚無文獻報道。【擬解決的關鍵問題】通過觀察AELL對MRSA生物被膜、纖維蛋白原黏附率、呼吸代謝能力、菌體蛋白/DNA、細胞凋亡比例、活性氧（ROS）水平、細胞周期分布及菌體形態結構的影響，明確AELL的抑菌效果及其作用機制，以期為開發安全高效、低毒環保、無殘留的抗MRSA藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥材及預處理將厚鱗柯葉切成碎塊，稱取25 kg分別用8倍和10倍的蒸餾水煎煮2 h，過濾，合并濾液，以95%乙醇沉淀并靜置24 h，過濾，濾液濃縮成浸膏即獲得AELL，5℃冰箱保存備用。

1.1.2 供試菌株MRSA菌株ATCC33591購自美國典型菌種保藏中心。

1.2.3 主要試劑與儀器設備LB肉湯培養基購自北京陸橋技術股份有限公司；刃天青購自南京都萊生物技術有限公司；活性氧檢測試劑盒、碘化丙啶（PI）和結晶紫染色液購自上海碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、預染彩色蛋白分子量Marker、核糖核酸酶A及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、碘硝基氯化四氮唑藍（INT）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液、Tris-HCl緩沖液、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；DNA檢測試劑盒（二苯胺比色法）購自上海藍季科技發展有限公司。儀器設備主要有：WD-9413A凝膠成像分析系統（北京六一生物科技有限公司）、BSA124S電子天平（德國賽多利斯公司）、BXM-100M全自動滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、C06超凈工作臺（廣東達菲爾凈化設備實業有限公司），LRH-1000F生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、DSF-60掃描電鏡［迪賽福智能科技（廣東）有限公司］、DL-7000C低速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、Accuri?C6Plus流式細胞儀（美國BD公司）和1550酶標儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 AELL對MRSA生長的影響以刃天青為指示劑，采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），并以平板菌落計數法測定最小殺菌濃度（MBC）。通過比濁法測定AELL對MRSA生長的影響，具體操作：取MRSA懸液（OD600=0.1）加入AELL（0.16 mg/mL），以不添加AELL為空白對照組。置于37℃下振蕩培養并分別測定不同時間段菌懸液的OD600。

1.2.2 AELL對MRSA生物被膜的影響采用結晶紫染色法和菌落計數法測定不同濃度AELL處理24和72 h對MRSA生物被膜的清除作用（Kang et al.，2018；王莉，2021）。

1.2.3 AELL對MRSA纖維蛋白原黏附率的影響取MRSA懸液（OD600=0.1）加入不同濃度的AELL，置于37℃下振蕩培養至OD600=0.6時取出，5000 r/min離心10 min收集菌體，并以PBS重懸至OD600為1.0（嚴一舟等，2020）。向96孔板加入100μL濃度為20μg/mL的纖維蛋白原包被24 h，無菌PBS洗滌后加入5% BSA并封閉2 h，PBS洗滌再加入上述菌懸液，37℃下培育2 h；PBS洗滌，用25%甲醇固定30 min；PBS洗滌后加入結晶紫染料染色20 min；PBS洗滌，50℃下烘箱干燥，酶標儀測定OD570。相對黏附率（%）=（加藥組OD570/對照組OD570）×100。

1.2.4 AELL對MRSA呼吸代謝的影響通過INT和TTC分別測定AELL處理后MASA的呼吸代謝活力及呼吸鏈脫氫酶活性（李遠頌等，2022）。

1.2.5 AELL對MRSA細胞周期和細胞凋亡的影響取MRSA懸液（OD600=0.1）加入不同濃度的AELL，置于37℃下振蕩培養。取連續培養6 h的各組菌懸液，5000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌后采用流式細胞儀測定各組MRSA的細胞周期分布和細胞凋亡情況。

1.2.6 AELL對MRSA胞內ROS水平的影響按照1.2.5的方法處理培養10 h，然后按活性氧檢查試劑盒說明測定各組MRSA懸液的ROS水平。

1.2.7 AELL對MRSA蛋白含量的影響MRSA處理方法同1.2.5。取連續培養8 h的各組MRSA懸液，5000 r/min離心10 min收集菌體，加入4倍體積的無菌水，混勻，經100℃水浴煮沸10 min后5000 r/min離心10 min，收集的上清液即為可溶性蛋白。采用蛋白定量試劑盒測定各組MRSA的可溶性蛋白含量，并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.8 AELL對MRSA菌體DNA的影響MRSA處理方法同1.2.5。連續培養4 h后，取各組MRSA懸液10 mL，10000 r/min冷凍離心5 min收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并以DNA檢測試劑盒測定各組MRSA的DNA含量，同時用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（康世墨，2020）。

1.2.9 AELL對MRSA形態結構的影響MRSA處理方法同1.2.1。取連續培育8 h的MRSA懸液，5000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌，經2.5%戊二醛溶液固定、乙醇梯度脫水、干燥、噴金等處理后，通過掃描電子顯微鏡觀察菌體形態結構（張晶晶，2021）。

2 結果與分析

2.1 AELL對MRSA生長的影響

由圖1可知，空白對照組MRSA繁殖非常快速，在培養12 h后進入對數生長期；而AELL處理組的MRSA未出現對數生長期，表明AELL可能通過影響MRSA對數生長期而發揮抑制或殺滅作用。AELL能有效抑制MRSA的生長，其MIC和MBC均為0.15625 mg/mL。

2.2 AELL對MRSA生物被膜及纖維蛋白原黏附率的影響

由表1可見，隨著AELL處理濃度的增加，MRSA培養24和72 h的生物被膜含量逐漸下降，表明AELL對MRSA早期和成熟期形成的生物被膜均有一定清除作用。隨著AELL處理濃度的增加，MRSA相對黏附率也呈逐漸下降趨勢，從47.486%下降至5.440%，即AELL能減弱MASA對纖維蛋白原的黏附作用。

表1 AELL對MRSA生物被膜及纖維蛋白原黏附率的影響（n=3）Table 1 Effects of AELL on adhesion rate of MRSA biofilm and fibrinogen（n=3）

2.3 AELL對MRSA呼吸代謝的影響

由表2可知，AELL處理組MRSA的呼吸代謝活力隨著培養時間的延長而逐漸降低，空白對照組MRSA的呼吸代謝活力變化不明顯，表明經AELL處理后MRSA的呼吸代謝活力受抑制。空白對照組MRSA的呼吸鏈脫氫酶活性也隨培養時間的延長逐漸增強，而AELL處理組MRSA的呼吸鏈脫氫酶活性明顯低于空白對照組，說明AELL可能是通過抑制MRSA呼吸鏈脫氫酶活性促使菌株處于死亡甚至呈破碎狀態。

2.4 AELL對MRSA細胞周期的影響

在細菌增殖周期中，S期對細菌合成DNA、細胞增殖和細胞分裂至關重要。由圖2可看出，與空白對照組相比，0.16 mg/mL組處于S期的MRSA增加9.00%，0.32 mg/mL組處于S期的MRSA增加15.86%，0.64 mg/mL組處于S期的MRSA增加23.93%。可見，經AELL處理后MRSA的生長周期阻滯在S期，推測AELL是通過擾亂MRSA的細胞周期而實現抑菌作用。

2.5 AELL對MRSA細胞凋亡的影響

以磷脂酰絲氨酸的特異性探針Annexin V探究AELL對MRSA細胞凋亡的影響，凋亡率（%）=Q2+Q3。由圖3可見，與空白對照組相比，經AELL處理后MRSA的細胞凋亡率明顯增加，0.16 mg/mL組、0.32 mg/mL組及0.64 mg/mL組的MRSA細胞凋亡率依次增加3.45%、9.96%和14.09%，說明AELL可能具有打破MRSA內環境穩定，促進菌體凋亡的作用。

2.6 AELL對MRSA胞內ROS水平的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，0.16 mg/mL組、0.32 mg/mL組和0.64 mg/mL組的MRSA胞內ROS含量依次增加4.12%、10.16%和23.66%，表明AELL能促進MRSA胞內脂質過氧化，從而破壞菌體脂質導致死亡。

2.7 AELL對MRSA蛋白及DNA的影響

由圖5可看出，MRSA可溶性蛋白含量隨AELL濃度的增加而逐漸降低，與空白對照組相比，0.16 mg/mL組、0.32 mg/mL組和0.64 mg/mL組的MRSA可溶性蛋白含量分別下降24.13%、51.12%和74.72%；SDS-PAGE檢測結果（圖6）也顯示，經AELL處理后MRSA蛋白條帶顏色有不同程度變淺，甚至出現條帶丟失現象。說明AELL可能是通過破壞菌株蛋白或抑制其合成而對MRSA產生影響。此外，隨著AELL處理濃度的增加，MRSA胞內DNA含量依次減少（圖7），與空白對照組相比，0.16 mg/mL組、0.32 mg/mL組和0.64 mg/mL組的DNA含量分別下降29.07%、43.33%和76.23%。由圖8可看出，經AELL處理后MRSA的DNA條帶逐漸變暗，且遷移率逐漸降低，故推測AELL是通過與DNA結合而破壞菌體DNA功能，進而達到抑制MRSA生長的效果。

2.8 AELL對MRSA形態結構的影響

在掃描電鏡下可清楚觀察到空白對照組MRSA的形態結構特征，其外觀完整規則，表面平整圓滑；經AELL處理后，MRSA的形態結構不規則、萎縮、畸形，細胞塌陷，細胞間隙出現裂痕，細胞壁嚴重彎曲、變形（圖9）。

3 討論

我國蘊藏著極為豐富的傳統中藥資源，其具有價格低廉、取材天然及毒副作用小等優點，更重要的是不易產生耐藥性。中藥在抗感染性疾病中已占據重要位置，其抑菌機理主要是通過破壞細菌生物被膜、降低細菌對宿主細胞黏附力、抑制細菌蛋白和遺傳物質合成、影響細菌呼吸代謝、促進ROS積累及破壞細胞結構等多方面作用，而抑制細菌生長或殺滅細菌（李貞等，2019）。為此，本研究通過觀察AELL對MRSA生物被膜、纖維蛋白原黏附力、呼吸代謝能力、菌體蛋白/DNA、細胞凋亡比例、胞內ROS水平、細胞周期分布及菌體形態結構的影響，旨在明確AELL對MRSA的抑菌效果及其作用機制，為動物抗病原菌感染和新型抗生素開發提供理論依據

當細菌數量足夠多就會建立生物被膜的保護性群落，使得抗生素難以侵入而殺滅細菌，是病原菌引起慢性持續性感染及感染難以治愈的主要原因。MRSA可吸附在醫用器材或宿主組織而產生形成生物被膜，待生物被膜發展成熟后其致病性和傳染性迅速增強（張鵬飛等，2020）。生物被膜有利于細菌逃脫或對抗宿主的防御機制、降低抗生素殺傷力、提高細菌對低氧或低營養的耐受力，也是MRSA感染變得越來越難以治療的重要原因（Liu et al.，2018；常佳偉等，2019）。耐藥金黃色葡萄球菌生物被膜的形成是奶牛乳腺炎反復感染、治療困難的關鍵問題，但有研究表明許多中藥及其活性成分能通過抑制生物被膜的形成或破壞已形成的生物被膜而起到殺菌作用。呂婷婷等（2022）研究發現大黃酸具有破壞木糖葡萄球菌早期和成熟生物被膜的作用，本研究也發現AELL對MRSA培養24或72 h形成的生物被膜均有一定的清除作用。此外，當致病性MRSA趨向宿主并附著于宿主細胞時，會產生表面蛋白和分泌蛋白，且不同的蛋白可特異性結合于宿主纖維蛋白原，包括聚集因子A和聚集因子B，從而促使細菌克隆生長并建立感染中心點。MRSA結合宿主纖維蛋白原是其致病性的必備條件，抑制MRSA對纖維蛋白原的黏附作用，即可有效降低其致病性（尚偉龍，2019；鄒治情，2020；Chung et al.，2021）。吳富鑫（2021）研究發現，苦參堿濃度為6 mg/mL時臨床分離型菌株對乳腺上皮細胞的黏附率降低至14.6%；本研究也發現經AELL處理后MRSA的纖維蛋白原黏附率從47.486%下降至5.440%。

細胞氧化還原平衡易受環境影響，逆環境條件下ROS快速增加將對細胞的蛋白、脂質及DNA產生一定損傷，最終導致細胞死亡（趙凝秋等，2021）。本研究結果表明，經AELL處理后MRSA胞內ROS含量由0.24%增加到23.90%；翁甜等（2022）也研究發現，香葉醇通過促進柑橘酸腐菌脂質過氧化和ROS積累而影響其正常生理功能。蛋白作為生物體內最重要的生物大分子，是生命活動的最主要載體，更是生物功能的執行者。每種細胞的生理活性均離不開不同結構和功能的蛋白，蛋白的合成則離不開遺傳物質。當遺傳物質的合成或表達受到影響，細胞基因轉錄激活、蛋白翻譯、細胞周期調控、信號轉導等重要生命過程均會受到影響，因此，通過檢測細菌胞內各時期蛋白和DNA的含量及細胞周期分布情況可作為抑菌效果判斷的重要依據。路振康等（2022）通過SDS-PAGE檢測發現核桃青皮提取物可抑制大腸桿菌蛋白表達。本研究也發現，經AELL處理后MRSA可溶性蛋白呈明顯的下降趨勢，AELL還能擾亂MRSA的細胞周期分布，使其停滯在S期，同時抑制MRSA核酸合成。

呼吸作用是細菌代謝的重要組成部分，脂類和糖類在體內氧化釋放出的能量可用于核酸、蛋白等生物合成；一旦呼吸作用失調，供給生命活動的能量無法正常供給，生物體的功能及新陳代謝發生紊亂，甚至趨于死亡（周凱仁等，2021）。細菌耗氧量和某些代謝酶活性也可作為抑菌效果的判斷標準。線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，活細胞在線粒體脫氫酶作用下會生成氫離子，INT結合氫離子后生成紫紅色的INT甲臜，即INT甲臜生成數量是界定細胞呼吸代謝活力的一項重要指標。本研究結果表明，經AELL處理后MRSA呼吸代謝活力逐漸降低，呼吸代謝活動受抑制。呼吸鏈的作用是將電子從供體傳遞給受體，生成細胞新陳代謝所需的能量。TTC進入細菌胞體后，與呼吸鏈脫氫酶結合在一起，催化生成的1,3,5-三苯甲臜（TF）可用于表征細菌呼吸鏈脫氫酶的活性情況。吳金勇（2020）研究證實，經牛至和魚腥草復配精油處理可顯著抑制肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏桿菌等5種病原菌的呼吸作用。本研究也發現，AELL能抑制MRSA呼吸鏈脫氫酶活性，故推測AELL是通過抑制MRSA呼吸鏈脫氫酶活性而促使菌株處于死亡甚至呈破碎狀態。

細菌的細胞壁和細胞膜具有保持菌體內各種物質含量穩定及維持細胞正常生命活動的作用，其結構與功能遭到破壞時會造成胞內重要物質外漏，繼而導致菌體死亡。掃描電鏡可直觀觀察到細菌細胞壁或細胞膜的受損情況，是研究藥物對細菌細胞膜和細胞壁破壞作用的常用方法。劉增援（2021）通過掃描電鏡觀察發現，小葉地錦處理多重耐藥大腸桿菌后其菌株形態表現出腫脹、內凹、皺縮等特征。本研究通過掃描電鏡觀察發現，經AELL處理后MRSA的形態結構出現不規則、萎縮、畸形，細胞塌陷，細胞壁嚴重彎曲、變形等現象。可見，AELL具有開發成抗MRSA獸藥或植物殺菌劑的潛力。抑菌活性成分研究是開發新型高效、低毒獸藥或農藥的重要環節，因此AELL抑菌單體化合物的提取分離有待進一步探究。

4 結論

AELL具有開發成抗MRSA獸藥、植物殺菌劑的潛力，其抑菌機理是通過清除MRSA生物被膜，降低其對纖維蛋白原黏附力，抑制蛋白和DNA生成，阻礙呼吸代謝，延緩細胞繁殖周期及促進菌體內脂質過氧化等，從而導致菌體細胞凋亡。