紅豆樹籽油制備工藝優化及脂肪酸類成分分析*

邢奇妹，周文娟，王春梅，歐余航，傅小偉，張琳婧，倪 林,3

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350008；2.福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002；3.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

紅豆樹（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）隸屬于豆科紅豆屬植物[1]，又稱鄂西紅豆，主要分布于中國福建、陜西、云南、廣東等地區[2]，其根、莖、葉和種子的提取物中含有多種活性成分[3]，均可入藥，具有抗炎鎮痛、活血化瘀等功效，民間用于治療跌打損傷、風濕關節炎及不明原因的腫痛[4-8]，具有較高的藥用價值。紅豆樹為福建省重點推廣的經濟樹種，福建地區種植面積達400 hm2以上，植物資源豐富。課題組前期研究發現紅豆樹種子的含油率在9%以上，然而現有文獻[9]僅分析了紅豆樹種子提取物的化學成分，其籽油組成成分未見報道。為進一步探究紅豆樹種子的出油率及其籽油脂肪酸成分組成，本研究采用響應面法優化石油醚加熱回流提取紅豆樹籽油的提取工藝，并利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）分析鑒定紅豆樹籽油中的脂肪酸組成及含量，以期獲得一種高效、簡單的紅豆樹籽油的提取方法，并為紅豆樹藥用價值的開發利用提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 紅豆樹成熟種子采摘自福建省福州市晉安區北峰山區，經福建農林大學林學院鄒雙全教授鑒定為豆科（Leguminosae）紅豆屬（Ormosia）紅豆樹（Ormosia hosiei Hemsl.&E.H.Wilson）的種子。種子干燥后粉碎備用，留樣保存于福建農林大學植物保護學院制藥工程系。

1.2 試劑 正己烷（批號：20201021）、無水乙醇（批號：20200809）、石油醚（60～90 ℃）（批號：20200507）、乙醚（批號：20161109）、焦性沒食子酸（批號：20160710）、三氟化硼（批號：20200330）、甲醇（批號：20200616）、鹽酸（批號：20190419）、氫氧化鈉（批號：20200901）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器 ZL03348684型雙列六孔電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；CPA225D型電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；高速多功能粉碎機（永康市天琪盛世工貿有限公司）；HX-1050型恒溫循環器（北京博醫康實驗儀器有限公司）；N-1100型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；7890A-安捷倫氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；CD-2560毛細管色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）（北京迪馬科技有限公司）。

2 方法

2.1 紅豆樹籽油的提取 精密稱取2.000 g紅豆樹種子粉末置于250 mL圓底燒瓶中，以石油醚為提取溶劑，回流提取，提取液趁熱抽濾，含有油脂的石油醚旋轉蒸發后，稱質量。紅豆樹籽油提取率按以下公式計算：提取率=（紅豆樹籽油質量/紅豆樹種子粉末質量）×100%。

2.2 紅豆樹籽油回流提取的單因素試驗 以紅豆樹籽油提取率為評價指標，研究3個因素對紅豆樹籽油提取率的影響，每個因素設置5個水平（見表1），獲得各條件下最佳提取工藝條件。

表1 單因素試驗

2.3 響應面試驗 根據單因素試驗篩選出單因素的最佳工藝條件[10-11]，利用Design Expert 8.0.6軟件對提取時間（X1）、提取溫度（X2）和料液比（X3）設計三因素三水平的Box-Behnken試驗（見表2），以籽油提取率（Y）為響應值，確定紅豆樹籽油提取的最佳工藝條件。通過響應面分析得到回流提取紅豆樹籽油的最佳工藝條件，并按照最佳工藝條件進行3次重復試驗，以驗證響應面法所得結果的可靠性。

表2 響應面試驗因素水平

2.4 紅豆樹籽油脂肪酸成分分析

2.4.1 籽油前處理 稱取優化條件下的紅豆樹籽油約0.1 g于圓底燒瓶，加入100 mg焦性沒食子酸、2 mL 95%乙醇、10 mL 12 mol/L鹽酸溶液，混勻后于70～80 ℃水浴中水解40 min。水解結束冷卻至室溫，加入10 mL 95%乙醇，用乙醚石油醚混合液（1∶1）萃取3次，取上層醚層置于烘箱中（50 ℃）干燥至恒重。干燥提取物裝入離心管，加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，置于85 ℃水浴30 min，后加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，繼續水浴30 min。冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷振蕩萃取2 min后，靜置1 h。取100 μL上清液用正己烷定容至1 mL，經0.45 μm濾膜過濾裝入樣品瓶，待氣相色譜分析。

2.4.2 GC-MS分析條件 色譜柱為CD-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm），進樣口溫度為250 ℃；載氣流速為0.5 mL/min；分流進樣，分流比為10∶1；檢測器為FID；檢測器溫度為250 ℃。升溫程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 提取時間 隨著提取時間的延長，紅豆樹籽油提取率逐漸升高，提取時間為90 min時，提取率達到最大值為10.04%，提取時間繼續延長，紅豆樹籽油提取率呈現下降趨勢。這可能是因為提取時間延長，紅豆樹籽油溶出增加，提取率升高，達到最適提取時間后，提取時間延長導致紅豆樹籽油成分分解，提取率下降[12]。因此，最優回流提取時間為90 min。（見圖1a）

3.1.2 提取溫度 隨著提取溫度的升高，紅豆樹籽油提取率呈現先升高后下降的趨勢，提取溫度為70 ℃時，提取率達到最大值為9.98%。這可能是因為提取溫度升高，反應速率增大，分子熱運動加快，達到最適提取溫度后，溫度繼續升高，籽油成分被破壞，發生降解，導致提取率下降[13]。因此，最優回流提取溫度為70 ℃。（見圖1b）

3.1.3 液料比 隨著液料比的增加，紅豆樹籽油提取率呈現先升高后趨于平緩的趨勢，液料比為20∶1（mL∶g）時，提取率達到最大值為9.84%。這可能是因為隨著溶劑用量增加，紅豆樹籽油溶解量增加，提取率升高，達到最適溶劑用量時，籽油基本被溶解出來，再增加溶劑量提取率也不再增加[14]。因此，回流提取最優液料比為20∶1（mL∶g）。（見圖1c）

圖1 不同提取條件對提取率的影響

3.2 響應面分析

3.2.1 響應面回歸模型建立與方差分析 以提取時間（X1）、提取溫度（X2）和液料比（X3）3個因素為響應變量，以紅豆樹籽油提取率（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗結果見表3。

表3 響應面設計及試驗結果

經二次多項式回歸擬合分析，得出紅豆樹籽油提取率的預測值對X1、X2和X3的二次多項式回歸模型方程：Y=10.14+0.011X1-0.054X2+0.12X-0.00975X1X2-0.060X1X3+0.015X2X3-0.21X12-0.24X22-0.64X32。對回歸模擬進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸方程方差分析

根據表4中的分析結果可知，紅豆樹籽油提取率的模型P=0.000 6＜0.01，表現為顯著，失擬項P＞0.05，表現為不顯著，說明該模型擬合成功。表4中一次項X2顯著（P＜0.05），X1和X3不顯著（P＞0.05），說明影響紅豆樹籽油提取率各因素的主次順序為提取溫度、液料比、提取時間；二次項X12、X22和X32均為極顯著（P＜0.01）。

3.2.2 響應曲面圖分析 紅豆樹籽油提取率的響應曲面圖見圖2。由圖2可見，提取時間和液料比值交互作用的響應面曲面的坡度最大，等高線最密，說明提取時間和液料比的交互作用對紅豆樹籽油提取率的影響最為顯著。圖2（a）為提取時間和提取溫度的交互作用對紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨提取時間和提取溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，在提取時間為90 min，提取溫度為70 ℃附近出現最高籽油提取率。圖2（b）為提取時間和液料比值的交互作用對紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨液料比值和提取時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，在提取時間為90 min，液料比為20∶1（mL∶g）附近出現最高籽油提取率。圖2（c）為提取溫度和液料比值的交互作用對紅豆樹籽油提取率的影響，可以看出籽油提取率隨液料比和提取溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，在液料比20∶1（mL∶g），提取溫度為70 ℃附近出現最高籽油提取率。

圖2 各因素對提取率影響的響應曲面圖

3.2.3 驗證試驗 結合模型擬合和回歸方程進行分析，紅豆樹籽油的最佳提取條件為提取時間93.38min，提取溫度71.27 ℃，液料比為20.05∶1（mL∶g），在該條件下紅豆樹籽油預測提取率為10.007%。為進一步驗證響應面法所得結果的可靠性，同時考慮試驗條件的可操作性，采用提取時間為93 min，提取溫度為71 ℃，液料比為20∶1（mL∶g）進行3次重復試驗，得到紅豆樹籽油提取率均值為10.01%，與預測值間的相對標準偏差為0.004%，兩者無明顯差異，說明響應面法優化的工藝條件可靠。

3.3 紅豆樹籽油脂肪酸成分分析結果 采用GB 5009.168—2016中的方法，通過GC-MS檢測紅豆樹籽油中脂肪酸成分組成及各組分含量，氣相色譜分析圖見圖3。

圖3 紅豆樹籽油的氣相色譜分析圖

通過GC-MS檢測紅豆樹籽油中脂肪酸成分組成及各組分含量，其結果見表5。紅豆樹籽油的脂肪酸總檢出率為95.67%，檢出的15種脂肪酸成分中，飽和脂肪酸含量為17.80%，不飽和脂肪酸含量為77.87%。脂肪酸中含量排名前三的成分為亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞油酸含量高達48.33%，可作為良好的亞油酸來源。亞油酸是人體必需的一種n-6系列多不飽和脂肪酸[15]，已有文獻報道顯示其具有抗黑色素[16]、抗腫瘤[17]、抗真菌[18]、蚜蟲拒食作用[19]、殺螨[20]等活性。值得注意的是，紅豆樹籽油中含有0.77%的α-亞麻酸，其含量與橄欖油相當[21]；棕櫚油酸含量（0.12%）高于大豆油（0.08%）；此外，紅豆樹籽油中含有0.48%的二十五碳烯酸。據研究顯示α-亞麻酸具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗癌等生理功能[22]；棕櫚油酸具有控制體質量、改善皮膚狀況、預防動脈粥樣硬化、改善代謝綜合征與炎癥、抑制破骨細胞形成等功能[23]；二十碳五烯酸具有降血脂、降低心血管疾病風險、抗腫瘤、抗炎、抗氧化應激、穩定斑塊及穩定細胞膜等生物活性[24]，是重要的輔助治療藥物和保健品。紅豆樹籽油中高含量的不飽和脂肪酸，在日化行業、農業、醫藥業等行業具有良好的市場開發前景。

表5 紅豆樹籽油的脂肪酸組成及其含量

4 討論

以石油醚為萃取溶劑，回流提取紅豆樹籽油，通過單因素試驗和響應面分析得到回流提取紅豆樹籽油的最佳工藝條件為提取時間93.38 min，提取溫度71.27 ℃，液料比20.05∶1，在該條件下紅豆樹籽油預測提取率為10.007%，驗證試驗得到的提取率與預測值無明顯差異，響應面法優化的工藝條件可靠，可為紅豆樹資源利用及開發奠定基礎。

經GC-MS分析表明，石油醚回流提取得到的紅豆樹籽油中含有15種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量較高，為77.88%，飽和脂肪酸含量為17.80%，含量排名前三的脂肪酸為亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞油酸的含量高達48.33%。