基于分子對接及實驗驗證研究補腎健脾活血方通過Wnt信號通路防治骨質疏松癥的作用機制*

吳睿哲，吳 潔，劉 凱，葛殊瑋，伍 強，曾景奇，王 凡

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

骨質疏松癥（osteoporesis，OP）是一種以骨量丟失、骨小梁數量減少、骨密度降低導致全身骨骼強度降低為特征的原發性疾病，50歲以上女性的發病率為同齡男性的1.8倍，而絕經后女性的發病率更高。成骨-破骨平衡的改變是OP發病機制中備受關注的一種[1]，據此防治OP藥物也主要分為骨吸收抑制劑和骨合成促進劑。隨著細胞生物學的發展，激素、細胞因子、多肽等多種藥物正逐步應用于防治OP[2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的成骨、成脂分化及其功能的調控涉及多種蛋白及轉錄因子[3]，其中Wnt/β-catenin信號通路是促進BMSCs成骨分化不可或缺的重要信號通路。Dickkopf相關蛋白1（Dickkopf related protein 1，DKK-1）及硬化蛋白（sclerostin，Sost）是Wnt通路的抑制性蛋白，通過與Wnt競爭性結合細胞膜表面的相應受體，影響下游因子β-catenin在細胞基質內的含量，最終影響通路下游靶基因的轉錄和表達。

中醫學認為骨質疏松癥的發生主要與腎虛、脾虛、血瘀3個因素有關，補腎健脾活血方正是針對“多虛多瘀”的病機特點所創立。近來，補腎活血類方劑防治骨質疏松癥的研究取得了一定的成果[4]，課題組成員前期也已證實補腎健脾活血方可以促進成骨細胞骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）的表達。本研究通過網絡藥理學篩選方中核心成分，利用分子對接計算探究方中核心成分與DKK-1及Sost蛋白結合的可能性，并通過含藥血清干預過表達質粒轉染兩種抑制性蛋白的MG63細胞，深入研究補腎健脾活血方防治骨質疏松癥的具體分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 成分篩選與分子對接

1.1.1 補腎健脾活血方核心成分篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmsp-e.com/）及BATMAN數據庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中分別篩選補腎健脾活血方中10味中藥的有效化學成分。根據ADME原則選取滿足口服生物利用度（oral bioavailibility，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的化學成分，通過Uniport數據庫（https://www.uniprot.org/）進行成分靶點轉化；在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）中，以“Osteoporosis”為關鍵詞搜索疾病靶點，并進行篩選，將上述靶點分別導入Cytoscape 3.8.2中構建“成分-靶點-疾病”網絡，使用CytoNCA插件進行拓撲分析并篩選核心藥物成分。

1.1.2 分子對接 選取方中核心成分與DKK-1以及Sost進行分子對接。在RCSB PDB數據庫（https://www1.rcsb.org/）中下載DKK-1及Sost[5-6]的pdb格式結構文件；根據篩選結果在ZINC小分子數據庫（https://zinc.docking.org/）中下載核心成分的mol2格式結構文件。運用AutoDockTools1.5.6對經篩選的核心成分與DKK-1及Sost進行分子對接，并用Pymol2.4.0對對接結果進行可視化呈現。

1.2 細胞實驗

1.2.1 實驗動物 健康成年SPF級雌性未孕SD大鼠16只，6個月齡，體質量（400±20）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心統一購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009，在湖南中醫藥大學SPF級實驗室中進行實驗操作，飼養環境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食，取材時將大鼠麻醉處死。實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核批準，批準編號：LL2020070601。實驗過程中參照國家《關于善待動物的指導性意見》對大鼠進行處置，并按照4R原則給予人道關懷。

1.2.2 藥物與試劑 補腎健脾活血方，方藥組成：淫羊藿10 g，熟地黃10 g，肉蓯蓉10 g，大棗10 g，當歸10 g，菟絲子10 g，補骨脂10 g，黃芪10 g，白芍10 g，丹參10 g。上述中藥均購置于湖南中醫藥大學第二附屬醫院，并由中藥房煎制成水煮液。水煮液生藥濃度為1.43g/mL。MEM培養基（批號：5811492）、MG63細胞（批號：5202470）購自上海中喬新舟生物科技有限公司；DKK-1過表達質粒（Ad-DKK-1）（批號：0025173）、Sost過表達質粒（Ad-Sost）（批號：0138194）均購自長沙艾碧維生物科技有限公司；LIP2000（批號：2398587）購自美國英杰生命技術有限公司；Wnt3a抗體（批號：AF01156173Q）購自北京博奧森生物技術有限公司；β-catenin抗體（批號：00018600）、βactin抗體（批號：10011066）均購自美國Proteintech公司；堿性磷酸酶（ALP）測試盒（批號：20210320）購自南京建成生物工程研究所。

1.2.3 主要儀器 YT-CJ-2NB型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司）；SL02型低速離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）；DH-160I型直熱式二氧化碳培養箱（上海三騰儀器有限公司）；DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；H1650R型臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2.4 動物分組及含藥血清制備 大鼠按照體質量分層隨機分為生理鹽水組和補腎健脾活血方組，每組8只。補腎健脾活血方組大鼠灌胃給予補腎活血健脾方，4.8 g/kg，灌胃給藥容量為10 mL/kg；生理鹽水組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。2次/d，灌胃間隔約5 h，連續灌胃7 d。最后一次灌胃2 h后予腹主動脈取血后人道主義處死各組大鼠，3 000 r/min離心15 min，取血清，滅活，過濾除菌，-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.5 細胞培養及過表達質粒轉染 MG63細胞培養于10%FBS+1%雙抗的MEM專用培養基，2～3 d換一次液，細胞匯合率達80%左右，胰酶消化細胞，一分為二進行細胞傳代，取對數生長的細胞接種在6孔板中待細胞貼壁，按以下分組進行如下處理。空載對照組：細胞轉染過表達空載；過表達DKK-1組：細胞轉染Ad-DKK-1過表達質粒；過表達Sost組：細胞轉染Ad-Sost過表達質粒；過表達DKK-1+Sost組：細胞轉染Ad-DKK-1和Ad-Sost過表達質粒。各組分別使用空白血清及含藥血清干預。

1.2.6 ALP活性檢測 血清干預細胞72 h后，收集提取總蛋白，BCA法定量檢測蛋白濃度，按照ALP活性檢測試劑盒操作說明檢測細胞ALP活性。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞鈣離子濃度 用無血清培養液稀釋（1∶1 000）離子熒光探針，加入上述去除細胞培養液的細胞，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min后，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，經流式細胞儀檢測細胞鈣離子濃度。

1.2.8 Western blotting 檢測通路蛋白Wnt3a、β-catenin表達 血清干預細胞72 h后，加入200 μL RIPA裂解液，超聲破碎刮取的細胞懸液，BCA法定量檢測蛋白濃度，并調整蛋白濃度至上樣濃度，取20 μL樣品上樣進行電泳，電泳恒定電壓75 V，時間130 min，轉膜后PBST配制5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫放置60 min，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min，按比例依次加入Wnt3a、β-catenin、β-actin一抗室溫放置90 min孵育，洗滌，加入按比例稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min，暗盒內與X膠片曝光30 s，顯影沖洗條帶。

1.2.9 統計學方法 使用SPSS 23.0對實驗數據進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”表示，兩種血清干預組間采用獨立樣本t檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 7.0進行數據可視化呈現。

2 結果

2.1 補腎健脾活血方核心成分篩選 在TCMSP數據庫及BATMAN數據庫中檢索補腎健脾活血方成分，符合ADME原則進行二次篩選后，滿足OB≥30%，DL≥0.18的主要成分共98種，通過Uniport數據庫成分靶點轉化。在GeneCards數據庫中檢索“Osteoporosis”，限定來源為“Homo sapiens”，通過中位數限制Relevance score＞1.013 324 261共獲取1 107個相關疾病靶點，將補腎健脾活血方與OP靶點取交集共獲得127個交集基因，將上述靶點分別導入Cytoscape 3.8.2中構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡，使用CytoNCA插件對網絡進行拓撲分析，篩選出Dgree值排名前5的核心藥物成分。（見表1）

表1 補腎健脾活血方核心成分信息表

2.2 分子對接結果及呈現 為進一步評價方劑中核心成分與DKK-1及Sost的親和能力，使用AutodockTools對篩選出的有效成分及目標靶點進行分子對接計算，對接結果見表2。根據DENNIS G J等[7]研究報道，結合能≤-4.0 kcal/mol表明分子與靶點具有一定的結合活性，結合能≤-5.0 kcal/mol表明分子與靶點具有良好的結合活性，結合能≤-7.0 kcal/mol表明分子與靶點具有明顯結合活性，故選用結合能≤-5.0 kcal/mol作為結合有效指標。結果顯示，方劑核心成分與DKK-1結合能≤-5.0 kcal/mol的有效成分有5種；與Sost結合能≤-5.0 kcal/mol的核心成分有2種，采用Pymol2.4.0對核心成分與DKK-1及Sost對接結合能絕對值排名前3，且結合能≤-5.0 kcal/mol的結果進行可視化呈現，其中DC4進行可視化呈現時無法構建氫鍵，其余結果見圖1。

表2 有效成分與DKK-1 及Sost 分子對接結果

圖1 核心成分與靶點蛋白對接結果可視化呈現

2.3 各組MG63細胞ALP水平比較 經含藥血清干預的空載對照組MG63細胞ALP水平與經空白血清干預的空載對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；經含藥血清干預的過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組MG63細胞ALP水平均分別高于經空白血清干預的過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組（P＜0.01）。（見圖2）

圖2 各組MG63 細胞ALP 水平比較（）

2.4 各組MG63細胞鈣離子濃度比較 經含藥血清干預的空載對照組MG63細胞鈣離子濃度明顯低于經空白血清干預的空載對照組（P＜0.05）；經含藥血清干預的過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組MG63細胞鈣離子濃度均分別低于經空白血清干預的過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組MG63 細胞鈣離子濃度比較（）

2.5 各組MG63細胞Wnt3a、β-catenin蛋白相對表達量比較 經含藥血清干預的空載對照組、過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組MG63細胞β-catenin蛋白相對表達量均分別高于經空白血清干預的空載對照組、過表達Sost組、過表達DKK-1組、過表達DKK-1+Sost組（P＜0.01）；經含藥血清干預的空載對照組、過表達Sost組、過表達DKK-1組MG63細胞Wnt3a蛋白相對表達量均分別高于經空白血清干預的空載對照組、過表達Sost組、過表達DKK-1組（P＜0.01）；經含藥血清干預的過表達DKK-1+Sost組MG63細胞Wnt3a蛋白相對表達量與經空白血清干預的過表達DKK-1+Sost組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

成骨細胞與破骨細胞之間的“成骨-破骨”動態平衡變化一直是研究骨組織新生修復、維持骨量的關鍵，兩種細胞分別來自BMSC以及造血干細胞的分化[8]。Wnt信號通路在2001年被證實與骨代謝關系密切，一方面可通過影響ALP、Runt相關轉錄因子2（Runx2）、骨鈣素等多種蛋白和轉錄因子的表達調控BMSCs的成骨、成脂分化趨向[9-10]；另一方面Wnt信號通路可通過影響轉錄因子（T細胞因子/淋巴細胞增強因子）（TCF/LEF）的表達間接調控成骨細胞BMP-2的轉錄活性，同時調控BMSCs對BMP-2的結合活性，最終影響BMSCs的成骨分化[11-12]。破骨方面，經典的Wnt信號通路并未直接參與破骨細胞的分化和功能調控，而是通過促進成骨細胞中骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達調控破骨細胞的功能，影響骨吸收過程[13]。YAN D Y等[14]發現通過影響Wnt信號通路中間產物AKT/GSK3-β/β-catenin的調控軸不僅可以促進成骨細胞形成，還可以抑制破骨細胞的分化，而β-catenin的轉錄因子Catenin beta 1在絕經后骨質疏松癥患者體內BMSCs中的表達低于健康患者[15]，因此調控β-catenin是骨重建的動態平衡中重要的一環。DKK-1和Sost均可通過與Wnt競爭性結合細胞表面的LRP5/6受體調控下游β-catenin的表達，但不同的是DKK-1與該受體結合時可與LRP5/6上各有的4個螺旋結構域同時作用，Sost只與LRP5/6上的第1個螺旋結構域作用。Wnt3a誘導BMSCs成骨分化實驗顯示，DKK-1對Wnt信號通路的抑制作用強于Sost[16]，故而抑制DKK-1的表達可能更有利于防治骨質疏松癥。研究發現，體質量指數與骨密度存在正相關關系[17]，研究者認為機械性的應力刺激可增強骨重塑過程以對抗BMI的增加[18]。MORSE A等[19]通過構建脛骨壓縮負荷小鼠模型觀察骨重塑與骨量改變的研究發現，敲除DKK-1基因的小鼠骨體積和骨量均明顯增加，而Sost的表達并沒有隨著DKK-1的缺失出現代償性上升，相反出現了下降，表明機械負荷可以促進Wnt/β-catenin信號通路的表達，而DKK-1和Sost對骨量改變的作用可能是互相獨立而不是互補的。研究發現DKK-1還可以激活非經典的Wnt信號通路及Smad信號通路促進成骨分化，而Sost在抑制Wnt信號通路的同時還可以通過影響OPG和RANKL的比例，增加破骨細胞數量并促進骨吸收[20-21]。

圖4 各組MG63 細胞Wnt3a、β-catenin 蛋白相對表達量比較（）

分子對接計算顯示，補腎健脾活血方中部分核心成分可以和DKK-1以及Sost進行對接，且與DKK-1的結合活性相對較好。其中谷甾醇（Sitosterol）與DKK-1結合能≤-7.0 kcal/mol，表明這一成分很可能是補腎健脾活血方與DKK-1作用的主要成分；而Sost的對接活性相對較差，并且與谷甾醇對接后無法進行氫鍵的構建，這可能與Sost通過短肽而非通過氫鍵與LRP6進行結合有關[22]。細胞實驗中，與空白血清比較，經補腎健脾活血方含藥血清干預的MG63細胞各項指標均呈有利表達。ALP水平與成骨細胞的分化和活性水平呈正相關，除空載對照組外，其余各組經含藥血清干預的MG63細胞ALP水平均高于空白血清干預的細胞（P＜0.05）；細胞鈣離子濃度的上升可導致鈣超載及細胞凋亡的發生[23]，而細胞內鈣離子濃度檢測結果提示經含藥血清干預的細胞鈣離子濃度均明顯下降。Western blotting結果提示過表達質粒轉染后的細胞中Wnt3a及β-catenin蛋白明顯下降，經含藥血清干預后Wnt3a及β-catenin蛋白表達抑制效果明顯改善。

補腎健脾活血方可能通過提高Wnt3a蛋白的表達量，抑制DKK-1及Sost對Wnt信號通路的抑制作用，影響成骨細胞中Wnt信號通路的表達，最終提高成骨細胞的活性及分化能力，從而防治OP。