S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3在膝骨關節炎中的表達及意義

劉曉，宋曉飛，鄭小剛

（1.南陽市內鄉縣人民醫院 骨科，河南 南陽 474300；2.南陽市中心醫院 骨二科，河南 南陽 473000）

骨性關節炎作為臨床常見骨科疾病，以關節軟骨變性、半月板及韌帶退變等為主要表現，屬于慢性進行性骨關節疾病，對患者日常活動及生活質量產生極大的消極影響［1-2］。目前，現代醫學尚未完全闡明其具體病理機制，且臨床主要依賴與臨床體征變化、影像學表現評估病情嚴重程度，缺乏客觀指標，致使臨床預防及治療難度增加［3］。研究發現，活性因子在關節炎病理進展中發揮重要作用［4］。S100 鈣結合蛋白B（S100 calciumbinding protein B,S100B）作為S100 鈣結合蛋白家族成員，參與影響細胞增殖、分化等生物學過程；軟骨破壞作為骨性關節炎主要病理改變，或與膝骨關節炎的發生相關；Ⅱ型膠原羧基端端肽（Ctelopeptide of type Ⅱcollagen,CTX-Ⅱ）作為關節軟骨主要成分Ⅱ型膠原蛋白降解產物，其數值變化與骨性關節炎相關［5-6］；而NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）作為多蛋白復合物，激活后可通過活化caspase-1 對白介素細胞等細胞因子生成、分泌產生誘導，調節機體炎性反應［7］。但臨床中對S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3在膝骨關節炎中的表達情況尚不清晰，基于此，以上述內容為背景，測定血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達水平，分析其在膝骨關節炎中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年9 月至2021 年9 月南陽市內鄉縣人民醫院收治的79 例膝骨關節炎患者為研究組，其中男49例，女30 例；年齡45～61歲，平均（53.00±6.80）歲；按照Recht 標準［8］分為Ⅰ級25 例、Ⅱ級33 例、Ⅲ級21例。另選100 例同期體檢健康人員為對照組，其中男58例，女42例；年齡42～69 歲（55.50±11.48）歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經院倫理委員會批準。

納入標準：符合《骨關節炎診治指南（2007年版）》中對膝骨關節炎的相關診斷標準［9］；年齡40～70 歲；存在關節活動受限、關節疼痛等表現；X 線檢查顯示關節緣見骨贅、關節間隙變窄；對照組人員無任何相關疾病；簽署知情同意書。

排除標準：肝腎功能不全；存在糖尿病、高血壓等其他內分泌疾病史；免疫功能障礙；并發類風濕關節炎、代謝性關節病；惡性腫瘤；合并流感、感染性肺炎等其他感染性疾病；2 周內服用影響軟骨代謝藥物；近期內存在抗風濕或免疫抑制劑治療史；近期內下肢損傷或手術者；長期服用補鈣藥物。

1.2 指標觀察

1.2.1 S100B、CTX-Ⅱ水平測定 采集兩組受檢者體檢當日空腹外周靜脈血5 mL，常溫靜置，高速離心（轉速：3 000 r/min，半徑：12 cm）10 min，分離上清，采用雙抗體夾心ELISA 法測定S100B、CTX-Ⅱ水平，設置酶標板為空白孔、標準孔、待測樣品孔，每孔加入50 μL 稀釋液，后依次加入樣品稀釋液、標準品、待測樣片各50 μL，混勻，覆膜，室溫孵育2 h。棄孔內液體，甩干，清洗反應板。加入S100B、CTX-Ⅱ檢測液100 μL/孔，覆膜，常溫孵育60 min，棄孔內液體，甩干、洗滌反應板，加入100 μL/孔底物溶液，遮光顯色0.5 h，加入終止液，輕彈酶標板終止反應。酶標儀（型號iMark，Bio-RAD 公司）450 nm 處測定吸光值，由高資歷檢驗醫生嚴格遵循試劑說明書進行操作。

1.2.2 NLRP3 表達水平測定 采用RT-PCR 法測定，microRNA 提取分離試劑盒分離血清總RNA，測定所得RNA 純度、完整度。采用TaqMan microRNA 反轉錄試劑盒進行microRNA 逆轉錄，采用SYBR Premix ExTaq II kit 進行定量PCR 反應，設置反應條件：預火95℃，預變性30 min，取出降溫至90℃，變性5 s，迅速降溫至58℃，退火20 s，溫度保持60℃，延伸45 s，連續循環40次，重復實驗3次。以β-actin 為內參，采用2-△△Ct方法計算NLRP3 相對表達量。β-actin：上游引物：5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'；下游引物：5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，NLRP3：上游引物：5'-CCCCGTGAGTCCCATTA-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 統計學方法

使用 SPSS 20.0 軟件分析數據。應用Kolmogorov-Smirnov 檢驗數據是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間行樣本F檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達水平比較

相比對照組，研究組S100B、CTX-Ⅱ水平升高，NLRP3 表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達水平比較（）

表1 兩組S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達水平比較（）

2.2 不同Recht 等級患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 表達水平比較

與I 級、II 級患者比較，III 級患者S100B、CTX-Ⅱ水平較高，NLRP3 表達水平較低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同Recht 等級患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表達水平比較（）

表2 不同Recht 等級患者S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3表達水平比較（）

2.3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 與膝骨關節炎嚴重程度相關性分析

以S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 進行相關性分析，結果顯示S100B、CTX-Ⅱ與膝骨關節炎嚴重程度呈正相關；NLRP3 與膝骨關節炎嚴重程度呈負相關。見表3。

表3 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 與膝骨關節炎嚴重程度相關性分析

2.4 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相關性

膝骨關節炎患者S100B、CTX-Ⅱ呈現正相關（r=0.613,P=0.015）；S100B、NLRP3 呈現負相關（r=-0.821,P=0.005）；CTX-Ⅱ、NLRP3 呈現負相關（r=-0.765,P=0.007）。見圖1。

圖1 S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 的相關性

2.5 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3對膝骨關節炎的診斷價值

ROC 曲線分析顯示，與S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 單項診斷相比，三項聯合對膝骨關節炎的診斷價值較高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 對膝骨關節炎的診斷價值

表4 ROC 曲線圖分析S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 對膝骨關節炎的診斷價值

3 討論

臨床醫學中將關節周圍軟骨受力學、生物學等因素所致的退變統稱為骨性關節炎，為老年人多發疾病，以關節軟骨損害為主要特征，畸形、持續性疼痛、關節功能障礙為主要癥狀，對患者身心健康造成極大影響［10］。但有學者指出，力學、生物學等因素雖可影響膝骨關節炎發生及進展，但任何單一因素均無法誘發膝骨關節炎，提示膝骨關節炎的發生或是多因素共同作用所致。故及早且有效評估膝骨關節炎病情對預防及臨床方案制定具有獨特意義［11］。

研究指出，S100 家族分子與滑膜炎、骨性關節炎的發生及進展存在關聯，但臨床醫學尚未明確S100B 在骨性關節炎中的作用機制［12］。研究指出，S100B 在軟骨損傷軟骨細胞凋亡及滑膜組織炎癥中發揮獨特作用，提示S100B 可通過干預細胞增殖、分化等生物學過程，影響生物機械力學信號傳遞；另外S100B 可通過持續激活RAGE 破壞細胞內氧化還原反應，參與細胞炎性反應［13-14］。相關學者指出，膝骨關節炎患者S100B 表達水平高于健康人員，且S100B 表達與Recht 標準分級存在相關聯系，提示S100B 在膝骨關節炎發病機制中的可能作用［15］。本研究發現，膝骨關節炎患者S100B 水平顯著高于健康人員，且S100B 水平隨疾病嚴重程度分級升高而增加，證實S100B 參與膝骨關節炎發生及病理進展過程。分析其原因或為S100B 作為炎性機制參與膝骨關節炎發生，而高表達S100B 可通過增加機體炎癥損傷從而誘發軟骨病理損傷。

研究指出，由膠原、聚糖等固相成分組成的軟骨在維持膝關節結構完整過程中發揮重要作用，而膝關節結構完整性的破壞是膝骨關節炎病變的主要病變表現［16］。作為膝關節軟骨膠原中主要成分，CTX-Ⅱ可對膠原纖維代謝情況反映，從而反映軟骨病理變化［17］。研究發現，膝骨性關節炎患者CTX-Ⅱ水平異常升高，且其含量變化與半月板、軟骨組織損傷程度存在一定關聯；另外CTX-Ⅱ在軟骨損傷早期便呈現異常升高，且其升高趨勢隨軟骨損害程度增加而增加，推測其在膝骨關節炎發病機制中的可能作用［18-19］。本研究發現，膝骨關節炎患者血清中膝骨關節炎呈現出異常上升的趨勢，且隨骨損害程度增加而升高。結合上述研究猜想CTX-Ⅱ與膝骨關節炎發生及進展存在關聯，出現這種情況的原因或為CTX-Ⅱ受疾病遷延、軟骨損傷加重而被大量分泌進入循環系統，后經腎臟排出，致使血液內CTX-Ⅱ表達量增加。

炎性因子在膝骨關節炎發生及發展中發揮重要作用。NLRP3 炎性小體作為固有免疫組分可對機體炎癥反應作出調節［20］。研究發現，關節間隙脂多糖、三磷酸腺苷增加可通過NLRP3 促進膝骨關節炎發生，提示NLRP3 在膝骨關節炎中的異常與炎癥反應相關；另外由于NLRP3 在類風濕性關節炎及活動性類風濕關節炎患者外周血細胞中表達水平顯著低于健康者，推測NLRP3 在膝骨關節炎發病機制中的可能作用［21-22］。本研究發現，膝骨關節炎患者NLRP3 表達水平顯著低于健康者，且其水平變化隨疾病加重而降低，證實低表達NLRP3 與膝骨關節炎發生及病理進展相關。分析其原因或為低表達NLRP3 在膝骨關節炎中對炎癥應激過程發揮保護作用相關。

綜上所述，膝骨關節炎的發生及病理進展或與血清中S100B、CTX-Ⅱ、NLRP3 異常表達相關，可作為評估膝骨關節炎嚴重程度的潛在生物學指標。