不同脂肪酶分解甘油三脂效果對比

李博，張磊，杜京堯，李春艷，楊莉莉

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

甘油三脂（TG）的代謝分為合成及分解分為人體途徑和體外生物工程途徑。人體途徑中，脂肪組織中的甘油三酯在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，并釋放入血供其它組織利用的過程，稱為脂動員。甘油三酯分子是細胞內(nèi)和血漿中脂肪酸儲存和運輸?shù)闹饕问剑?］。甘油單脂和長鏈脂肪酸被吸收后，先在小腸細胞中重新合成甘油三酯，并和磷脂、膽固醇和蛋白質(zhì)形成乳糜微粒（chylomicron），由淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)［2］，從而被身體當(dāng)做能量儲存［3］。生物工程途徑主要是通過微生物或者工業(yè)來源的脂肪分解酶直接分解甘油三脂為甘油和脂肪酸；或者脂肪合成酶把甘油和脂肪酸合成甘油三脂［4］。微生物脂肪酶具有水解三酰基甘油的多種催化功能，具有重要的商業(yè)價值［5］。其中，來自極端微生物的脂肪酶具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景［6］。在成功用于聚合物合成的酶中，南極洲假絲酵母脂肪酶B（CAL-B）是迄今為止文獻中最著名的酶。在大多數(shù)報道的酶聚合反應(yīng)中，它被用作固定化酶是因為它具有易于分離和堅固性等優(yōu)點。Novozym 435是一種市場上可獲得的多相生物催化劑，由物理固定在大孔聚（甲基丙烯酸甲酯）樹脂內(nèi)的CAL-B組成，并由Novozymes 進行標(biāo)記。由于其體外酯交換的潛力，Novozym 435 已被廣泛應(yīng)用于合成聚酯結(jié)構(gòu)［7］。微生物脂肪酶（EC 3.1.1.3）催化長鏈甘油三酯的水解［8］。可以從細菌屬芽孢桿菌屬、無色桿菌屬、堿生菌屬、節(jié)肢桿菌屬、假單胞菌屬和真菌屬青霉菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等進行了大規(guī)模的脂肪酶生產(chǎn)篩選。脂肪酶作為一種多用途的生物催化劑，在生物柴油、食品和飲料、皮革、紡織、洗滌劑、制藥和醫(yī)療等多個行業(yè)的需求中具有廣泛應(yīng)用［9］。本文主要對比不同人血漿中血脂四項的指標(biāo)差異、5 種微生物脂肪酶效價及分解甘油三脂的效果，并綜合相關(guān)文獻報道，比較微生物脂肪酶的的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 一般資料

①購買自不同廠家的5 種脂肪酶1，脂肪酶2，脂肪酶3，脂肪酶4、脂肪酶5。②選取2019年1 月至2021 年10 月收集的高血脂樣本及正常血脂樣本共32例。

1.2 試劑與儀器

試劑：①血脂檢測：安圖（北京）生物技術(shù)有限公司血脂四項［TG，批號：10427c11；總膽固醇（TC），批號：01228E11；高密度脂蛋白（HDL），批號：10222A11；低密度脂蛋白（LDL），批號：10223A11］。②脂肪酶活性檢測：脂肪酶（LPS）活性檢測試劑盒，安圖（北京）生物技術(shù)有限公司（批號：10315A11）。配套儀器：東芝全自動生化分析儀TBA-2000FR。③溫育設(shè)備：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS-500-BS-Ⅱ。

2 結(jié)果

2.1 不同樣本中血脂四項的含量比較

選取2019 年1 月至2021 年10 月收集的高血脂樣本及正常血脂樣本共32例，使用東芝血脂四項試劑檢測。見表1。

表1 不同樣本中血脂四項的含量比較（mmol/L）

32 例樣本中篩選出23 例高甘油三脂樣本，但是這些樣本中TC、HDL 及LDL 均在正常值范圍，從這些樣本檢測結(jié)果可看出高甘油三脂樣本中的TC、HDL 及LDL 含量并不高。TG 與TC、HDL 及LDL 無顯著相關(guān)性。

2.2 不同脂肪酶效價比較

使用純化水把5 種脂肪酶均配制成脂肪酶母液，再用脂肪酶含量29.4 u/mL 的陰性血清稀釋5種（每個3 個梯度）脂肪酶，然后檢測5 種（每個3 個梯度）脂肪酶的酶濃度。見表2。

表2 不同脂肪酶效價比較

不同脂肪酶效價差別很大，比較5 種脂肪酶效價（使用活性），脂肪酶1 效果最好。

2.3 脂肪酶處理高血脂樣本效果

不同濃度脂肪酶1 加入樣本32（高血脂TG：3.18 mmol/L；TC：2.03 mmol/L；HDL：0.42 mmol/L；LDC：0.82 mmol/L）中，混勻后放置到恒溫試培養(yǎng)箱，37℃孵育30 min。脂肪酶1 處理高血脂樣本50 u/mL 與100 u/mL 無顯著差異，選擇50 u/mL 比較合適。見圖1。

圖1 脂肪酶處理高血脂樣本效果圖

3 討論

32 例樣本中篩選出23 例高甘油三脂樣本，但是這些樣本中TC、HDL 及LDL 均在正常值范圍，從這些樣本檢測結(jié)果看高甘油三脂樣本中的TC、HDL 及LDL 含量并不高。TG 與TC、HDL 及LDL無顯著相關(guān)性。不同脂肪酶效價差別很大，比較5種脂肪酶效價（使用活性），脂肪酶1 效果最好。脂肪酶1 處理高血脂樣本50 u/mL 與100 u/mL 無顯著差異，選擇50 u/mL 比較合適。

TG 作為主要的能源儲備［10］。合成及分解途徑在人體內(nèi)及體外工業(yè)化的途徑區(qū)別如下：人體內(nèi)的合成與體外工業(yè)化手段相比：①合成途徑［11］：人體合成甘油三脂需要：三種合成酶，一步步進行，并且每種合成酶均有同工酶，最初的合成起點不同，所用的合成通路也不同［12］。體外工業(yè)化的手段是使用同種效用的不同酶及代謝途徑單一。②分解途徑［8］：人體合成甘油三脂的分解需要三種酶（甘油三酯脂肪酶、甘油二酯脂肪酶和甘油單酯脂肪酶），且第一個酶最為重要，為反應(yīng)的限速酶，反應(yīng)過程受到各種調(diào)控因子的作用［13］。人體途徑的有序進行直接影響人體健康［14］。但是體外工業(yè)化的分解途徑用的酶不需要任何輔酶因子直接水解甘油三脂為甘油和脂肪酸，它是經(jīng)過酶工程修飾及改造的酶，改變其某些性質(zhì)、提高其活性，以便更好地發(fā)揮其催化功能，無論是物化性質(zhì)，還是生物活性都得到了改善［15］。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)降解過程相比，微生物具有在溫和條件下生物降解脂質(zhì)廢物的能力，有效地產(chǎn)生脂質(zhì)分解酶，從而實現(xiàn)環(huán)境可持續(xù)性［16］。酯鍵合合成塑料、農(nóng)藥、殺蟲劑和對羥基苯甲酸酯的水解是當(dāng)前形勢下的一個新興方向，也用于生物能源的生產(chǎn)和能源節(jié)約，以維持全球的危險廢物。另一個重要方面是利用與微生物脂肪酶有關(guān)的低能耗酶催化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。對于治療和診斷輔助的設(shè)計，脂肪酶已經(jīng)變得更加廣泛，并正在迅速發(fā)展為目前的主要候選人。在醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，脂肪酶被用作調(diào)節(jié)劑，如激活劑和抑制劑，特別用于處理生活方式疾病，如肥胖［17］。在目前，調(diào)節(jié)劑對治療有巨大的影響，并將在即將到來的未來進一步擴大。因此，這些脂肪酶的使用顯著地提高了許多以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品［18］。本文通過高血脂樣本的篩選，5 種不同脂肪酶的酶活測定及脂解高血脂樣本的效果，評價篩選出1 種脂肪酶可用于高血脂樣本的體外酶解，改善體外診斷試劑中高血脂樣本的干擾，提高檢測準(zhǔn)確性。