血清lncRNA DLX6-AS1 Actinin-4表達與宮頸癌術后復發及預后的關系

劉貴珍，楊瑞紅，李寶連

(1.山西省呂梁市人民醫院婦科，山西 呂梁 033000 2.山西省腫瘤醫院分子生物室，山西 太原 030000)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤。我國每年新發現病例達13萬例，死亡達5.3萬例，嚴重威脅我國女性身體健康[1]。近年來隨著宮頸脫落細胞學、HPV及陰道鏡等篩查的普及，使得許多早期宮頸癌患者得到早期診治。對于早期宮頸癌患者主要采用宮頸癌根治術治療，但部分患者術后仍會發生腫瘤復發的現象，對于術后復發的患者再次治療的療效較差，5年生存率僅13%[2]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)DLX6-AS1編碼基因位于人類7號染色體。據報道，lncRNA DLX6-AS1在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤中發揮致癌作用，其通過激活RAS/RAF信號通路，促進血管內皮生長因子A的表達，促進腫瘤血管生成及轉移[3]。輔肌動蛋白4(Actinin-4)是ACTN家族成員，其與絲狀肌動蛋白交聯，以維持細胞骨架的完整性并控制細胞運動。研究表明，Actinin-4在乳腺癌、前列腺癌多種癌癥中表達顯著升高，其表達上調能夠降低細胞之間粘附性，增強腫瘤細胞增殖和侵襲、轉移[4,5]。本研究通過研究宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達，分析兩者表達與臨床病理特征及術后復發預后的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取自2016年2月至2018年2月期間行宮頸癌根治術的120例宮頸癌患者為研究對象(宮頸癌組)。納入標準：①初次診治，既往無抗腫瘤治療；②接受宮頸癌根治術治療的ⅠA～ⅡA期宮頸癌者；③病理檢查確診為宮頸癌；④臨床病理資料及隨訪完整。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤者；②患者不能配合相關檢查及治療；③合并嚴重心肺肝腎臟器功能衰竭者，④中途失訪丟失者。年齡25～67歲，平均(44.35±5.18)歲；腫瘤直徑：≤4cm者73例，>4cm者47例；病理類型：鱗癌85例，腺癌35例；病理分級：高中分化82例，低分化38例；FIGO分期：IA～IB期78例，ⅡA期42例；間質浸潤深度：≤1/2者45例，>1/2者75例；淋巴結轉移：無97例，有23例。以同期健康體檢的50例健康人為對照組，年齡24～64歲，平均(43.98±5.20)歲。兩組年齡之間無明顯差異(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準,患者及其家屬已簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1血清lncRNA DLX6-AS1表達檢測 取宮頸癌患者及對照組查體時清晨空腹靜脈血5mL，3000rpm/min離心10min(離心半徑10cm)，保留上層血清。采用實時熒光定量PCR檢測血清lncRNA DLX6-AS1表達水平。儀器為ABI7500型熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。采用Trizol試劑提取血清中總RNA，經Narodrp1000鑒定濃度及純度，OD260/OD280=1.8～2.1之間。將總RNA反轉錄為cDNA后進行熒光定量PCR。以GAPDH為內參基因,反應條件:94℃ 5 s 、58 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、45個循環,引物購于上海生工公司。 lncRNA DLX6-AS1上游序列為5’-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3’，下游序列為5’-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3’；GAPDH上游序列為5’- GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3’，下游序列為5’-ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’。采用2-△△CT法計算lncRNA DLX6-AS1的相對表達水平。依據lncRNA DLX6-AS1的相對表達量平均數2.24將患者分為lncRNA DLX6-AS1高表達組、lncRNA DLX6-AS1低表達組。

1.2.2血清中Actinin-4表達水平檢測:采用酶聯免疫吸附實驗檢測血清Actinin-4表達水平。酶聯免疫吸附試劑盒購自上海聯邁生物公司。簡要步驟：反應板設標準品孔和樣本孔，每孔加入對應的標準品和樣本50μL，分別加入酶結合物100μL，混勻后封板膜封板，37℃恒溫箱孵育30min。加入150μL洗滌液反復洗滌5次，分別加底物A液、B液各50μL，混勻后封板膜封板，37℃恒溫箱孵育15min，每孔加終止液50μL，充分混勻。用酶標儀測定各孔OD450nm值。根據標準品濃度的OD值，對應計算每孔樣品的濃度值。根據Actinin-4表達平均數48.95pg/mL，將患者分為Actinin-4高表達組、Actinin-4低表達組。

1.2.3隨訪:以宮頸癌患者出院后開始進行隨訪，以電話或門診方式進行隨訪，連續隨訪3年，第一年每三個月隨訪一次，第2、3年每六個月進行一次隨訪,以隨訪過程中是否出現復發為終點,隨訪終點為腫瘤復發或隨訪結束。根據復發時間計算患者的無進展生存時間。依據是否復發將研究對象分為復發組(19例)和無復發組(101例)兩組。

2 結 果

2.1宮頸癌組與對照組患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達比較:宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1相對表達量、Actinin-4水平分別為(2.24±0.37)、(48.95 ± 11.65)pg/mL，對照組分別為(1.31±0.25)、(30.84 ± 7.16)pg/mL。與對照組相比，宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達顯著升高，差異均有統計學意義(t=16.278、15.844，P=0.000、0.000)。

2.2宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達的相關性分析:Pearson相關分析結果，宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1與Actinin-4的表達呈顯著正相關性(r=0.560、P=0.000)。

2.3宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達與臨床病理特征的關系:不同FIGO分期、病理分級、間質浸潤深度及淋巴結轉移患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達差異具有統計學意義(P<0.05)，而不同年齡、腫瘤直徑及病理類型之間，差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌血清lncRNA DLX6-AS1 Actinin-4表達與臨床病理特征的關系

2.4宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達對宮頸癌根治術后復發的影響:120例宮頸癌患者隨訪過程中，隨訪期間無失訪，復發19例，3年復發率為15.83%(19/120)。lncRNA DLX6-AS1高表達組3年無進展生存率為75.86%(44/58)，顯著低于低表達組91.94%(57/62)(Log-rank χ2=4.846，P=0.000)；lncRNA DLX6-AS1高表達組無進展生存時間平均為(32.75±1.29)個月，明顯短于低表達組(34.14±1.47)個月(t=5.500，P=0.000)。Actinin-4高表達組3年無進展生存率為72.88%(43/59)，顯著低于低表達組95.08%(58/61)(Log-rank χ2=5.124，P=0.000)；Actinin-4高表達組無進展生存時間平均為(32.68±1.56)個月，明顯短于低表達組(34.14±1.60)個月(t=5.056，P=0.000)，見圖1。

圖1 ROC曲線分析血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達對宮頸癌根治術后復發的影響

2.5單因素及多因素COX回歸分析影響宮頸癌根治術后復發的因素:單因素分析結果，無復發組與復發組之間在間質浸潤深度、淋巴結轉移、病理分級、FIGO分期、lncRNA DLX6-AS1及Actinin-4之間(均P<0.05)，兩組在年齡、腫瘤直徑、病理類型之間無明顯差異(均P>0.05)。見表2。以是否發生復發為因變量(t=時間，1=復發，0=無復發)，將單因素分析中有統計學意義的因素包括間質浸潤深度(賦值：1=>1/2，0=≤1/2)、淋巴結轉移(賦值：1=有，0=無)、病理分級(賦值：1=低分化，0=高中分化)、FIGO分期(賦值：1=ⅡA，0=ⅠA～ⅠB)、lncRNA DLX6-AS1(賦值：1=高表達，0=低表達)及Actinin-4(賦值：1=高表達，0=低表達)納入多因素COX比例回歸模型，結果顯示,病理分級低分化、FIGO分期ⅡA期、lncRNA DLX6-AS1高表達﹑Actinin-4高表達是影響宮頸癌根治術術后復發的獨立危險因素(均P<0.05)。見表3。

表2 單因素分析影響宮頸癌根治術后復發的因素

表3 多因素COX回歸分析影響宮頸癌根治術后復發的危險因素

3 討 論

目前對于早期宮頸癌以手術治療為主，宮頸癌根治性術是主要的術式。研究表明，對于ⅠB～ⅡA的宮頸癌患者，宮頸癌根治治術術后患者的5年生存率可達75%以上，但仍有部分患者術后出現復發[6]。影響宮頸癌根治術術后復發的因素包括腫瘤分期、分級等臨床病理因素，但臨床中發現，宮頸癌具有較大的異質性，即使相同臨床分期的患者也具有不同的復發傾向。lncRNA是一種長度超過200個核苷酸的轉錄物，可作為癌基因或抑制基因，參與人類腫瘤、炎癥及免疫等疾病的病理生理學過程。國內有學者發現，宮頸癌患者血清LncRNA SRA水平與患者的臨床預后關系密切，可作為評估宮頸癌預后的生物標志物[7]。深入研究宮頸癌發生發展的機制，尋找能夠預測術后復發的血清LncRNA腫瘤標志物，能夠輔助臨床醫師對高?；颊哂枰苑e極治療及密切隨訪，以降低術后復發率，改善患者臨床預后。

LncRNA DLX6-AS1是近年來發現的具有腫瘤促進作用的新的LncRNA分子，在膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均參與促進腫瘤細胞的惡性增殖及轉移等惡性生物學過程，可能是新的腫瘤診斷及生物治療的靶點[3]。本研究中，宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1表達明顯升高，并且其表達與FIGO分期、病理分級、間質浸潤深度及淋巴結轉移有關，提示lncRNA DLX6-AS1可能參與宮頸癌的發生發展過程。宮頸癌中表達上調的機制可能與轉錄調控有關。有學者發現，腫瘤中H3組蛋白第4位賴氨酸一甲基化能夠顯著激活lncRNA DLX6-AS1基因的轉錄及表達，進而促進腫瘤增殖及轉移，并誘導腫瘤對順鉑耐藥性形成[8]。此外，lncRNA DLX6-AS1能夠作為內源性競爭性RNA，抑制微小RNA-16-5p，導致下游環腺苷酸調節的磷酸化蛋白19過度激活，促進腫瘤的惡性增殖及轉移[9]，而在宮頸癌細胞中敲除lncRNA DLX6-AS1的表達后，其下游癌基因FUS表達顯著受到抑制，導致腫瘤細胞的增殖及侵襲能力降低[10]。因此，lncRNA DLX6-AS1表達升高參與促進宮頸癌的腫瘤進展。本研究發現，血清lncRNA DLX6-AS1高表達患者無進展生存率明顯較低，并且lncRNA DLX6-AS1高表達是影響宮頸癌患者術后復發的獨立危險因素，表明檢測血清lncRNA DLX6-AS1表達有助于判斷宮頸癌根治術后復發預后，是一種新的預后判斷的腫瘤標志物。宮頸癌術后復發與腫瘤細胞的血管及淋巴結轉移關系密切。研究表明，lncRNA DLX6-AS1的表達升高能夠通過誘導糖基轉移酶LARGE的甲基化，沉默LARGE的基因表達，促進腫瘤細胞的淋巴轉移[11]。

Actinin-4是ACTN家族成員，作為一種細胞骨架蛋白，其在N端有一個肌動蛋白結合域，能與肌動蛋白交聯，維持細胞結構及參與細胞運動調節。近年來發現，在乳腺癌中Actinin-4作為一種促癌基因，通過激活Akt/GSK3β信號通路，促進腫瘤細胞的侵襲及轉移，是新的腫瘤標志物[5]。本研究中，宮頸癌患者血清Actinin-4水平明顯高于對照組，提示Actinin-4可能參與宮頸癌的腫瘤發生。分析其機制，可能與宮頸癌中Actinin-4蛋白穩定性增加有關。研究表明，宮頸癌腫瘤細胞中Na+/H+交換調節因子1表達顯著下調，導致其對Actinin-4蛋白泛素化能力降低，Actinin-4蛋白經蛋白酶體途徑降解減少，進而激活下游Wnt通路，促進宮頸癌細胞的增殖及轉移[12]。尚有研究表明，宮頸癌中Actinin-4基因啟動子存在擴增的現象，導致Actinin-4蛋白過度表達激活，導致患者血清Actinin-4水平升高[13]。本研究中，血清Actinin-4表達與FIGO分期、病理分級、間質浸潤深度及淋巴結轉移有關，提示Actinin-4的表達升高可能參與宮頸癌的發生發展。有學者研究發現，宮頸癌腫瘤細胞中Actinin-4能夠促進癌細胞干性表型轉化，不僅促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，導致腫瘤侵襲轉移能力增強，還能通過結合ATP結合盒家族G2，促進腫瘤細胞化療耐藥性的形成[14]。本研究中，血清Actinin-4高表達患者無進展生存率明顯較低，并且血清Actinin-4高表達是影響宮頸癌患者術后復發的獨立危險因素，表明檢測血清Actinin-4水平有助于評估宮頸癌患者術后的復發風險，是一種新的預后相關血清標志物。目前臨床上宮頸癌的血清標志物包括鱗狀細胞癌抗原，糖類抗原125及癌胚抗原等。但不同臨床研究由于研究對象，分期分級等因素，難以取得一致的結果，因而目前尚無一種血清標志物用于宮頸癌術后預后的判斷。臨床上部分早期宮頸癌患者根治性手術后復發與切除區域外仍有腫瘤的微轉移有關，而目前影像學等檢查并不能早期發現，lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4作為新的血清標志物，有助于反映宮頸癌根治術后復發的風險，臨床醫生對高風險復發的患者提供個性化的輔助化療，減少術后復發的發生。

本研究發現，宮頸癌血清lncRNA DLX6-AS1與Actinin-4的表達呈顯著正相關，提示兩者可能共同參與宮頸癌腫瘤發生發展過程。目前其機制尚不清楚。研究發現，lncRNA DLX6-AS1能夠作為分子海綿結合并抑制微小RNA-142-3p的表達，促進腫瘤細胞干性表型的維持，而腫瘤中微小RNA-142-3p的表達降低導致其下游的Actinin-4表達異常升高，促進腫瘤進展[15]。但宮頸癌中是否存在lncRNA DLX6-AS1對Actinin-4的表達調控，有待今后進行實驗研究進一步探索。

綜上所述,宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達升高，兩者的表達與FIGO分期、病理分級、間質浸潤深度及淋巴結轉移有關，是影響宮頸癌術后復發的獨立危險因素,可能成為宮頸癌病情及復發預后評估的血清腫瘤標志物。本研究的不足之處在于為單中心研究，樣本量有限，有待今后設計多中心前瞻性臨床研究進一步驗證本研究結論，并對兩者的臨床應用價值進行深入探討。