結直腸癌組織中lncRNA TUSC7與miR-1270表達的相關性及臨床病理意義

姜 輝，任維聃，劉桂偉，冶浩鵬，郭慶金，耿學辰，姜國勝

(1.河北省滄州市人民醫院肛腸外科，河北 滄州 061000 2.河北省滄州市中心醫院結直腸肛門外科，河北 滄州 061000)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種多發于40歲以上中老年人的癌癥，由于飲食及生活習慣的改變，其發生率逐年上升[1]。因此，尋找與CRC相關，且可評估CRC患者預后的標志物尤為關鍵。微小RNA(microRNA,miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)均是不能編碼蛋白的RNA分子，兩者均可能參與CRC發生發展[2,3]。近期報道顯示，lncRNA腫瘤抑制候選基因7(lncRNA tumor suppressor candidate 7,lncRNA TUSC7)在CRC中呈低表達，與CRC患者預后密切相關[4]；微小RNA-1270(microRNA-1270,miR-1270)在胃癌中表達上調，高表達miR-1270與患者不良預后相關，miR-1270可能是診治胃癌的潛在靶標[5]。基于上述研究，本文檢測了miR-1270在CRC組織中的表達情況，分析其與lncRNA TUSC7、CRC預后關系，為臨床診治CRC提供新參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年6月至2019年1月本院診治的CRC患者130例進行研究，年齡42～70歲，平均年齡(58.07±10.66)歲，<60歲67例，≥60歲63例；低分化45例，中、高分化85例；男71例，女59例；浸潤深度：T1～T2 78例，T3～T4 52例；病理類型：浸潤型15例，隆起型26例，潰瘍型89例；淋巴結轉移48例，淋巴結未轉移82例；腫瘤直徑：< 5cm 61例，≥5cm 69例；TNM分期：Ⅲ～Ⅳ期54例，Ⅰ～Ⅱ期76例。本院倫理委員會批準本研究，受試者和家屬對此研究知情同意。CRC患者納入標準：①符合CRC診斷標準[6]，經病理診斷為原發性CRC；②患者病例及檢查資料齊全；③入院前未行放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；④除CRC外，不伴有其他原發性腫瘤。排除標準：①隨訪資料缺失、病理類型難以判定者；②合并嚴重臟器病變者。

1.2方 法

1.2.1lnCAR數據庫檢索:采用lnCAR數據庫(https://lncar.renlab.org/#1st-screen)檢索CRC和正常結直腸組織中lncRNA TUSC7表達情況。

1.2.2標本收集:收集130例CRC患者行根治性手術切除的CRC組織、癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)，生理鹽水清洗，立即放入液氮罐(凍存24h)，移至-80℃冰箱。

1.2.3實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平:取出-80℃冰箱儲存的CRC和癌旁組織，無菌條件下，研缽中研碎，添加Trizol Reagent(簡石生物技術有限公司，CT2001)以提取CRC和癌旁組織中的總RNA；使用MultiMACS(TM) cDNA Synthesis Kit(美國Miltenyi公司，130-094-410)將總RNA反轉錄成cDNA；最終，應用SYBR Green qPCR Master Mix(美國MCE公司，HY-K0501)、qRT-PCR儀(美國ABI公司，PRISM?7900HT)擴增cDNA，讀取各基因循環閾值(CT值)。擴增參數：98.4℃預變性8min；97.6℃變性15s，64.5℃退火10s，68.2℃延伸15s，40個循環。GAPDH、U6分別是lncRNA TUSC7、miR-1270的內參基因(引物序列見表1)。lncRNA TUSC7、miR-1270相對表達量以2-△△CT法計算。

表1 lncRNA TUSC7 GAPDH miR-1270 U6引物序列

1.2.4生物信息學網站預測lncRNA TUSC7與miR-1270的關系:使用生物信息學網站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測lncRNA TUSC7與miR-1270間的關系。

1.3隨訪:以電話、入戶等方式跟蹤隨訪CRC患者6～36個月，以CRC患者手術后次日作為隨訪起點，隨訪截至CRC患者死亡或2022年1月。

2 結 果

2.1lnCAR數據庫中CRC組織與正常結直腸組織lncRNA TUSC7表達水平比較:lnCAR數據庫分析顯示，CRC組織lncRNA TUSC7表達水平較正常結直腸組織降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 lnCAR數據庫中CRC和正常結直腸組織中lncRNA TUSC7表達水平比較

2.2癌旁和CRC組織中lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平比較:CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平較癌旁組織降低(P<0.05)，miR-1270表達水平較癌旁組織升高(P<0.05)。見表2。

表2 癌旁/CRC組織中lncRNA TUSC7 miR-1270表達水平比較

2.3CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平與臨床病理特征的關系:以CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平的中位數(0.39、2.67)為界值，以低于lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平中位數的CRC患者為lncRNA TUSC7低表達組(66例)、miR-1270低表達組(62例)，以高于或等于lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平中位數的CRC患者為lncRNA TUSC7高表達組(64例)、miR-1270高表達組(68例)。結果顯示，CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平與年齡、病理類型、性別、腫瘤直徑無關(P>0.05)，與腫瘤淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度、TNM分期相關(P<0.05)。見表3。

表3 CRC組織lncRNA TUSC7 miR-1270表達水平與臨床病理特征關系n(%)

2.4CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平與miR-1270的相關性:Pearson法分析顯示，CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平與miR-1270呈負相關(r=-0.578，P<0.05)，見圖2；生物信息學分析顯示，lncRNA TUSC7與miR-1270存在靶向結合位點，見圖3。

2.5CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達水平與CRC患者預后的關系:跟蹤隨訪CRC患者6～36個月，死亡45例，生存85例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA TUSC7低表達組平均生存時間為27.77個月(95%CI：25.53～30.02)，短于lncRNA TUSC7高表達組平均生存時間34.34個月(95%CI：23.10～35.59)，log-rank檢驗結果顯示，lncRNA TUSC7低表達組、lncRNA TUSC7高表達組累積生存率比較，差異有統計學意義(χ2=30.459，P=0.000)，見圖4；miR-1270低表達組平均生存時間為33.90個月(95%CI：32.54～35.27)，長于miR-1270高表達組平均生存時間28.37個月(95%CI：26.15～30.58)，log-rank檢驗結果顯示，miR-1270低表達組與miR-1270高表達組累積生存率相比，差異有統計學意義(χ2=18.172，P=0.000)，見圖5。

圖2 CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平與miR-1270的相關性

圖3 生物信息學分析lncRNA TUSC7與miR-1270的靶向結合位點

圖4 CRC組織lncRNA TUSC7表達水平與CRC患者預后的關系

圖5 CRC組織miR-1270表達水平與CRC患者預后的關系

3 討 論

CRC患者可出現便血、大便性狀變化、腹痛等癥狀，臨床多以手術治療CRC為主，但治療效果不容樂觀，CRC患者預后較差[7]。因此，尋找與CRC有關的生物學靶點，對及時有針對性干預，提高CRC患者治愈率，降低病死率有積極意義。

lncRNA作為一類非編碼RNA，其雖不可編碼蛋白，但可調控信號轉導，影響CRC等癌癥細胞增殖、凋亡，參與機體免疫逃逸等過程[8]。研究發現，lncRNA TUSC7在食管鱗癌中表達下調，與淋巴結轉移相關，lncRNA TUSC7有望成為診治食管鱗癌的分子靶標[9]；另外，Zhang等[10]研究發現，過表達lncRNA TUSC7可抑制CRC細胞增殖、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，lncRNA TUSC7在CRC發展中起抑癌作用。本研究顯示，CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平較低，與lnCAR數據庫檢索結果及曹珊珊等[4]研究趨勢一致，提示lncRNA TUSC7可能與CRC病理發展相關。本文中CRC組織lncRNA TUSC7表達水平與腫瘤淋巴結轉移、浸潤深度、分化程度、TNM分期相關，提示lncRNA TUSC7可能與CRC嚴重程度有關，檢測CRC組織lncRNA TUSC7表達水平有助于臨床判斷CRC患者病情，對制定針對CRC患者的干預方案甚是有利。進一步研究發現，lncRNA TUSC7低表達組CRC患者平均生存時間、累積生存率短于、低于lncRNA TUSC7高表達組，提示lncRNA TUSC7可能與CRC患者預后密切相關，lncRNA TUSC7表達水平越低，CRC患者預后越差，lncRNA TUSC7可輔助臨床判定CRC患者預后情況。分析可能原因，lncRNA TUSC7可能通過與靶基因結合進而影響CRC細胞EMT、增殖、侵襲，從而影響CRC發展進程，顯示出其與CRC患者TNM分期等臨床特征、預后相關[10]。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA，其可參與肝細胞癌、CRC等癌細胞異常增殖，調節信號轉導，介導自噬，影響肝細胞癌、CRC等疾病發生發展[11]。近期報道顯示，miR-1270在食管癌、肝細胞癌中表達上調，且miR-1270可能是診治食管癌、肝細胞癌的潛在靶標[12,13]。而miR-1270在甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌中呈高表達，miR-1270在甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌中發揮促癌作用[14,15]。以上研究表明，miR-1270在不同腫瘤中的作用不同。本文中CRC組織miR-1270表達水平較高，與其在胃癌中的趨勢相同，提示miR-1270可能參與CRC發生發展，miR-1270可能是診治CRC的分子靶點。進一步研究顯示，處于Ⅲ～Ⅳ期、T3～T4浸潤深度、低分化，發生淋巴結轉移的CRC患者中miR-1270高表達患者占比較高，表明miR-1270可能與CRC發展程度相關，miR-1270有望成為評估CRC嚴重程度的標志物。另外，本研究顯示，miR-1270低表達組CRC患者平均生存期、累積生存率長于高于miR-1270高表達組，表示CRC組織中miR-1270表達水平越高，CRC患者發生不良預后風險越大，miR-1270有望成為臨床評估CRC患者預后的潛在指標。推測，miR-1270可能通過促進CRC細胞增殖、EMT，抑制CRC細胞凋亡，進而在CRC發生發展中起促進作用，從而顯示出miR-1270與CRC患者TNM分期等臨床特征、預后關系緊密[5]。

此外，生物信息學分析顯示，lncRNA TUSC7與miR-1270存在靶向結合位點，故本文探討了CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平與miR-1270相關性，結果顯示，lncRNA TUSC7表達水平與miR-1270呈負相關，提示lncRNA TUSC7可能與miR-1270共同影響CRC病理變化，推測lncRNA TUSC7可能與miR-1270靶向結合，進而影響CRC細胞增殖、EMT等惡性生物學行為，從而協同影響CRC發展過程。

綜上，CRC組織中lncRNA TUSC7表達水平較低，miR-1270表達水平較高，二者呈負相關，且lncRNA TUSC7、miR-1270均與TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度、預后等顯著相關，為臨床診治CRC、判定CRC患者預后提供新方向。但本研究樣本有限，后期將延長隨訪時間，擴大樣本，從多角度探究lncRNA TUSC7、miR-1270與CRC的關系，以增加實驗可靠性。