咪達唑侖調控miR-875-5p/STAG2軸對食管癌細胞增殖及凋亡的影響

劉夢詩，崔光銳，邱 堅，廖微微

(海南醫學院第二附屬醫院消化內鏡科，海南 海口 570100)

食管癌是最常見的胃腸道腫瘤之一，近年來發病率呈逐步上升趨勢[1]。由于患者在早期可能出現消瘦、惡心、體重減輕等非特異性癥狀，使食管癌的早期診斷變得困難。近年來，盡管通過手術、化療或放療等方式對食管癌的治療已經取得了很大進展，但對于這種致命的疾病仍然沒有有效的根治方法，存活率仍然很低[2]。因此，探究食管癌的發病機制，尋找治療食管癌的藥物，對于提高食管癌患者的生存率具有重要的意義。有研究表明，麻醉藥物能夠影響腫瘤細胞的生長與轉移[3]，而咪達唑侖(midazolam，MID)作為一種外科手術常用的的麻醉藥物，可誘導肺癌A549細胞凋亡[4]，但MID對于食管癌細胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。另有研究表明，miR-875-5p在食管癌細胞中呈高表達，且促進食管癌細胞的增殖和轉移[5]。本研究通過生物信息學預測發現miR-875-5p與基質抗原2(Stromal antigen 2，STAG2)存在結合位點，STAG2是位于X染色體(Xq25)上，含有34個外顯子的基因，已有研究報道上調STAG2基因的表達能抑制腎癌細胞的增殖能力、促進腎癌細胞的凋亡[6]。但MID是否可通過影響miR-875-5p/STAG2軸來調控食管癌細胞的增殖與凋亡尚未可知。因此。本研究主要探討MID對食管癌細胞增殖、凋亡的影響，分析其是否能夠調控miR-875-5p/STAG2軸，旨在為食管癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器:人食管癌細胞系Eca109及食管正常上皮細胞HEEC均購自深圳市豪地華拓生物公司；miR-875-5p模擬物(miR-875-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-875-5p抑制物(anti-miR-875-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自美國ThermoFisher公司；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒均購自金圖生物公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Bio-Rad公司；細胞周期試劑盒、TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix均購自上海李記生物公司；STAG2兔多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體(anti-STAG2、anti-β-actin)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；熒光定量PCR儀、CO2培養箱均購自德國SIGMA公司。

1.2細胞培養及分組:將Eca109細胞及食管正常上皮細胞HEEC在37℃，含有5%CO2的培養箱中進行培養。收集對數生長期的Eca109細胞接種到6孔培養板中(3×104個/孔)，參照文獻[7]，用不同濃度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)處理Eca109細胞24h，通過CCK-8法檢測Eca109細胞的存活率，篩選適宜的MID濃度用于后續實驗研究。細胞分組：在Eca109細胞中加入MID并調整濃度為30μmoL/L，記為MID組；正常培養的Eca109細胞記為NC組。細胞融合率達到80%左右時，利用LipofectamineTM2000轉染試劑盒對Eca109細胞進行分組轉染，分組如下：anti-miR-NC組(細胞轉染anti-miR-NC)、anti-miR-845-5p組(細胞轉染anti-miR-845-5p)、MID+miR-NC組(細胞轉染miR-NC后使用含有30μmoL/L MID的RPMI 1640培養基培養24h)、MID+miR-875-5p mimics組(細胞轉染miR-875-5p mimics后使用含有30 μmoL/L MID的RPMI 1640培養基培養24h)。

1.3miRNA轉錄組測序:提取MID組及NC組Eca109細胞的總RNA，對總RNA進行質量檢測及處理后構建cDNA文庫，通過RNA-seq測序及生物信息學技術分析MID組及NC組差異表達的miRNA。

1.4CCK-8法檢測Eca109細胞存活率:分別收集Eca109細胞接種至96孔板(5×103個/孔)中，按照1.2中的方法進行相應處理后，在37℃、5%CO2的條件下培養48h。然后再向每個孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育3h，采用全自動酶標儀測定Eca109細胞在450nm波長處的吸光值(OD值)。細胞存活率(%)=(OD實驗-OD空白對照)/(OD正常對照-OD空白對照)×100%。

1.5流式細胞術檢測Eca109細胞凋亡情況:分別收集不同處理組的Eca109細胞并用冰冷的PBS洗3次，加入200μL Annexin V-FITC結合液,輕輕重懸細胞，室溫(20-25℃)避光孵育15min；1000rpm離心5min，除去上清，加入190μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞；加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰溶避光放置2h；進行流式細胞儀檢測；最后使用FlowJo V10軟件對數據進行分析。

1.6流式細胞術檢測Eca109細胞周期:將細胞用75%乙醇過夜固定后，按照細胞周期試劑盒說明書處理細胞，最后利用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7qRT-PCR檢測Eca109細胞中miR-875-5p、STAG2 mRNA表達水平:用Trizol試劑從Eca109細胞中提取總RNA，利用TaqMan逆轉錄試劑盒將1μg RNA逆轉錄成cDNA，使用TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒對miR-875-5p、STAG2 mRNA表達水平進行定量。以GAPDH為內參，標準化STAG2值；以U6為內參，標準化miR-875-5p值。最后通過2-△△CT法計算基因表達水平。所用引物序列見表1。

表1 miR-875-5p U6 STAG2 GAPDH qRT-PCR引物序列

1.8Western Blot檢測Eca109細胞中STAG2蛋白表達水平:用RIPA裂解緩沖液提取Eca109細胞蛋白，將20μg蛋白質樣品經電泳、轉膜后，用5%脫脂牛奶封閉1h，分別添加兔多克隆抗體anti-STAG2(1∶4000)、anti-β-actin(1∶3000)于4℃下孵育過夜，然后與二抗(1∶5000)在TBST中室溫孵育2h。加入ECL試劑觀察蛋白質印跡。對蛋白質條帶進行掃描，并對灰度值進行量化分析。

1.9雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-875-5p與STAG2靶向關系:使用starbase網站預測miR-875-5p與STAG2的結合位點。分別構建STAG2的野生型(WT)和突變型(MUT)3'-UTR區質粒，標記為WT-STAG2、MUT-STAG2。將WT-STAG2和MUT-STAG2分別與miR-NC或miR-875-5p mimics共轉染Eca109細胞，48h后，用細胞裂解液裂解細胞15 min，離心，收集細胞上清；打開GLO-MAX 20/20熒光檢測儀，設置程序，讀數10 s，檢測間隔2 s；將20μL的上清液、100 μL螢火蟲熒光素酶底物LARII加入到96孔板中混勻后開始檢測，記錄數據；反應結束后，每孔加入100μL海腎熒光素酶工作液，混合均勻，終止螢火蟲熒光素酶反應，啟動海腎熒光素酶反應，開始檢測并記錄數據。計算二者比值，分析結果。

1.10體內異種移植瘤實驗:20只雄性BALB/c裸鼠隨機分為裸鼠NC組、裸鼠MID組、裸鼠MID+miR-NC組、裸鼠MID+miR-875-5p mimics組，每組5只，將細胞濃度為4×106個/mL的200μL對應的細胞懸液分別注射到裸鼠右腋下，NC組注射等量的細胞培養液，標準條件下飼養15d后頸椎脫臼處死各組裸鼠，分離出腫瘤并測量腫瘤質量。

2 結 果

2.1MID對Eca109細胞增殖的影響:與0μmoL/L MID相比，10μmoL/L MID、20μmoL/L MID、30μmoL/L MID、40μmoL/L MID處理的Eca109細胞存活率顯著下降(P<0.05)，見圖1，且MID濃度為30μmoL/L時，細胞存活率接近50%，因此后續選用30μmoL/L MID用于研究。

圖1 不同濃度MID對Eca109細胞增殖的影響

2.2miRNA轉錄組測序篩選差異miRNA:通過高通量測序和統計學分析后結果見圖2，▲為顯著上調的miRNA，▼為顯著下調的miRNA，●表示無顯著性差異的miRNA，本研究發現在顯著下調的miRNA中有miR-875-5p，表明MID可抑制Eca109細胞中miR-875-5p的表達。

圖2 MID處理后的Eca109細胞的miRNA轉錄組測序分析

2.3MID對Eca109細胞增殖、凋亡、細胞周期及miR-875-5p表達的影響:MID組Eca109細胞存活率、S期細胞比例、miR-875-5p表達水平顯著低于NC組，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著高于NC組(P<0.001)，見圖3。

圖3 MID對Eca109細胞增殖、凋亡、細胞周期及miR-875-5p表達的影響

2.4Eca109細胞和HEEC細胞中miR-875-5p與STAG2 mRNA表達:與食管正常上皮細胞HEEC比較，食管癌Eca109細胞中miR-875-5p表達水平顯著升高，而STAG2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.001)。見圖4。

圖4 Eca109細胞中miR-875-5p與STAG2的表達水平

2.5miR-875-5p靶向調控STAG2的表達:使用starbase網站預測發現miR-875-5p與STAG2存在結合位點，見圖5A。與miR-NC+WT-STAG2組比較，miR-875-5p mimics+WT-STAG2組Eca109細胞的熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，而miR-875-5p mimics+MUT-STAG2組Eca109細胞的熒光素酶相對活性與miR-NC+MUT-STAG2組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5B。

圖5 miR-875-5p靶向調控STAG2的表達

2.6抑制miR-875-5p表達對Eca109細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響:anti-miR-875-5p組Eca109細胞中miR-875-5p表達水平顯著低于NC組和anti-miR-NC組，提示細胞轉染成功，見圖6A。與NC組和anti-miR-NC組比較，anti-miR-875-5p 組Eca109細胞的存活率、S期細胞比例顯著降低，而細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著升高(P<0.05)，見圖6。

圖6 抑制miR-875-5p表達對Eca109細胞中miR-875-5p表達水平、細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響

2.7過表達miR-875-5p可逆轉MID對Eca109細胞增殖、凋亡及細胞周期的作用:與NC組比較，MID干預后的Eca109細胞中miR-875-5p表達水平、細胞存活率、S期細胞比例顯著降低，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著升高(P<0.05)；將miR-875-5p mimics轉染至Eca109細胞并聯合MID干預后，Eca109細胞中miR-875-5p表達水平、細胞存活率、S期細胞比例顯著高于MID組和MID+miR-NC組，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著低于MID組和MID+miR-NC組(P<0.05)，見圖7。

圖7 過表達miR-875-5p可逆轉MID對Eca109細胞增殖、凋亡及細胞周期的作用

2.8過表達miR-875-5p對MID處理的Eca109細胞中STAG2表達的影響:MID組Eca109細胞中STAG2 mRNA及蛋白表達水平顯著高于NC組(P<0.05)，而與MID組和MID+miR-NC組相比，MID+miR-875-5p mimics組Eca109細胞中STAG2的mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖8。

圖8 過表達miR-875-5p對MID處理的Eca109細胞中STAG2 mRNA及蛋白表達的影響

2.9MID及miR-875-5p對裸鼠體內移植瘤生長的影響:與裸鼠NC組比較，裸鼠MID組裸鼠體內移植瘤質量顯著降低(P<0.05)；與裸鼠MID組、裸鼠MID+miR-NC組比較，裸鼠MID+miR-875-5p mimics組裸鼠體內移植瘤質量顯著升高(P<0.05)，見圖9。

圖9 MID及miR-875-5p對裸鼠體內移植瘤生長的影響

3 討 論

MID是一種苯二氮卓類化合物，其具有典型的苯二氮卓類藥理活性，可產生抗焦慮、鎮靜、催眠、抗驚厥及肌肉松弛作用[7]。近年來，MID在抗腫瘤的研究中備受關注。如鄧大立等[8]闡明MID可通過上調miR-137表達，抑制胃癌細胞增殖并誘導其凋亡；Sun等[9]闡述MID能抑制非小細胞肺癌細胞增殖。本研究發現，不同濃度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)干預Eca109細胞后，隨著MID濃度的升高，Eca109細胞存活率顯著下降，且MID濃度為30μmoL/L時，細胞存活率接近50%，因此選用30μmoL/L MID用于后續研究；另外，本研究還發現經30μmoL/L MID干預的Eca109細胞增殖能力、S期細胞比例降低，細胞凋亡率、G0/G1期細胞比例增加，這與報道[7，9]是一致的，提示MID可能通過抑制Eca109細胞增殖，促進細胞凋亡，并將細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞分裂的方式來發揮抗腫瘤作用。

miRNA是一種由22個左右的核苷酸組成的非編碼的小分子單鏈RNA，其與mRNA的3‘端非編碼區以完全或不完全互補的方式相互作用，促進mRNA降解，進而抑制mRNA翻譯。miRNA對多種基因具有調控作用，在細胞增殖、凋亡、細胞周期等細胞生物學行為中發揮重要作用。一些miRNAs具有抑癌基因的功能，可以抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。另一些miRNAs具有原癌基因的功能，能抑制抑癌基因的表達，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。miR-875-5p作為一種與腫瘤的發生發展密切相關的miRNA，已有研究報道，miR-875-5p通過抑制SATB2促進肺癌細胞的侵襲[10]；miR-875-5p在甲狀腺癌中高表達，其上調可誘導甲狀腺癌細胞增殖[11]。表明miR-875-5p在多種腫瘤中具有致癌的作用。本研究通過采用高通量miRNA轉錄組學分析篩選出miR-875-5p在MID處理的Eca109細胞中顯著下調，同時通過qRT-PCR驗證了MID干預可抑制Eca109細胞中miR-875-5p表達，證明MID確實可引起miR-875-5p的下調。本研究結果同樣證實了miR-875-5p具有促癌作用，本研究發現miR-875-5p在Eca109細胞中高表達；抑制miR-875-5p表達可顯著抑制Eca109細胞增殖、促進細胞凋亡、G0/G1期細胞比例增加；過表達miR-875-5p可逆轉MID對Eca109細胞增殖、凋亡及細胞周期的作用，同時還可逆轉MID對裸鼠體內移植瘤生長的抑制作用。提示MID通過下調miR-875-5p抑制Eca109細胞增殖，促進細胞凋亡，調控細胞周期。

為了進一步探究MID通過下調miR-875-5p抑制Eca109細胞增殖，促進細胞凋亡，調控細胞周期的具體機制，本研究通過starbase網站預測和雙熒光素酶實驗證實STAG2是miR-875-5p的靶基因。STAG2是黏著蛋白復合物的亞基成分之一，其在有絲分裂或減數分裂過程中姐妹染色單體的正常分離中起著重要的作用。據報道，STAG2 突變可以改變染色質結構和轉錄程序，從而促進侵襲性癌癥表型[12]；STAG2在宮頸癌組織中呈低表達狀態，過表達STAG2可抑制宮頸癌細胞遷移及侵襲[13]。本研究結果與上述研究是一致的，本研究結果表明，STAG2在Eca109細胞中低表達；MID能夠上調Eca109細胞中STAG2 mRNA及蛋白表達水平；過表達miR-875-5p則逆轉MID處理對Eca109細胞中STAG2表達的促進作用。表明miR-875-5p通過靶向STAG2，可能是MID調控Eca109細胞增殖、凋亡以及細胞周期的重要途徑。

綜上所述，在Eca109細胞中miR-875-5p高表達，STAG2低表達，MID通過下調miR-875-5p水平靶向促進STAG2的表達，從而抑制Eca109細胞增殖，促進細胞凋亡。該研究為MID對食管癌的作用機制奠定理論基礎，為食管癌的治療提供新的方向。但是MID對食管癌細胞增殖和凋亡的作用涉及的分子機制較多，有待后續進一步深入探究。