制備牛型結(jié)核菌素高壓滅菌模型的建立與應(yīng)用

張廣川，王楠，李婉清，李巧玲，曾薈燕，靳繼惠，郭桐同，孟伯龍，李強(qiáng)，門星光，姚文生，程君生

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

生物安全三級實(shí)驗(yàn)室涉及一、二類病原微生物的大量培養(yǎng)、病原分離和毒力測定等試驗(yàn)操作，所有活病原微生物均需要滅活后才能離開生物安全三級實(shí)驗(yàn)室。高壓蒸汽滅菌法屬于常規(guī)滅菌方式，需根據(jù)病原微生物種類，感染性廢棄物和動物尸體等不同消毒滅菌對象，建立相應(yīng)的操作規(guī)程，并進(jìn)行效果驗(yàn)證[1-2]，以保證實(shí)驗(yàn)室生物安全。牛型結(jié)核菌素是將牛分枝桿菌接種適宜培養(yǎng)基后，經(jīng)高壓滅活和三氯乙酸提純的細(xì)菌代謝蛋白及其衍生物，可用于牛結(jié)核病診斷。按照《動物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動安全要求細(xì)則》[3]，牛分枝桿菌的大量液體培養(yǎng)，需要在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室條件下開展。研究[4-5]結(jié)果表明，高壓滅菌條件對于牛型結(jié)核菌素蛋白的成分和活性有較大影響，所以，針對牛分枝桿菌應(yīng)探索和建立一個既能保證滅菌效果，又能最大限度保留蛋白生物學(xué)活性的滅菌模型。本研究通過型式試驗(yàn)，優(yōu)化了排空、升溫、滅菌和排氣等階段的各項(xiàng)參數(shù)，最終建立了牛分枝桿菌高壓滅菌模型，以期為防范人畜共患病原菌擴(kuò)散，改進(jìn)牛型結(jié)核菌素提純制備工藝提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 雙扉生物安全型滅菌器（BIST-P3），購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9270），購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 壓力蒸汽滅菌生物指示劑（嗜熱脂肪地芽孢桿菌ATCC7953 含菌量1×105～5×106CFU/支），購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；121 ℃壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡（20200606），購自北京四環(huán)衛(wèi)生藥械有限公司；配氏培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（TG）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、酪胨瓊脂（GA），購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 滅菌柜裝載物放置 裝載架上放置8 個滅菌箱，平均分布在上下兩層。每個滅菌箱內(nèi)放入6個與制備牛型結(jié)核菌素體積相同的純凈水三角瓶。試驗(yàn)時將鍋體內(nèi)的移動感溫探頭插入到上層中間的液體三角瓶中，蓋好中間有透氣孔的硅膠瓶塞。

1.2.2 指示劑放置 試驗(yàn)時，在每層4 個滅菌箱外側(cè)角和內(nèi)側(cè)角的三角瓶中放入生物指示劑，共12 個點(diǎn)位。在中間上下2 個箱體的2 個點(diǎn)位分別放入1 張化學(xué)指示卡。滅菌結(jié)束后，取出生物指示劑和化學(xué)指示卡，按照說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.3 滅菌柜高壓參數(shù)設(shè)置 選用滅菌柜預(yù)設(shè)液體高壓程序作為基準(zhǔn)參數(shù)：滅菌溫度為121 ℃，滅菌時間為20 min，排空上限為60 kPa，排空下限為0，排空次數(shù)為3 次，升溫間隔為180 s，排氣間隔30 s，排氣壓差12 kPa，冷卻溫度90 ℃。分別對排空、升溫、滅菌、排氣階段的有關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較試驗(yàn)，確定最佳滅菌參數(shù)。

1.2.4 滿載牛分枝桿菌挑戰(zhàn)試驗(yàn) 按照確定的最佳滅菌參數(shù)，在滅菌腔最大裝載條件下，將液體培養(yǎng)的牛分枝桿菌全部放入，運(yùn)行程序。結(jié)束后按照《中華人民共和國獸藥典（三部）》[6]無菌檢驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。同時設(shè)立配氏培養(yǎng)基作為陽性對照，陽性對照置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30 d，觀察并記錄結(jié)果，此試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 型式試驗(yàn)

2.1.1 排空階段參數(shù)確認(rèn) 液體排空上限和下限相差過大容易造成瓶內(nèi)液體外溢。取排空上限為60 kPa，選取不同排空下限及排空次數(shù)作為調(diào)整參數(shù)，其他參數(shù)保持不變。經(jīng)6 次比較試驗(yàn)，在保證容器內(nèi)液體無外溢的前提下，得出最佳排空參數(shù)為排空4 次、排空上限60 kPa、排空下限-15 kPa。不同排空階段參數(shù)比較試驗(yàn)結(jié)果詳見表1。

2.1.2 升溫階段參數(shù)確認(rèn) 選取升溫間隔作為調(diào)整參數(shù)，其他參數(shù)保持不變。經(jīng)4 次比較試驗(yàn)，在保證滅菌效果的前提下，得出最佳升溫間隔為0 s。不同升溫階段參數(shù)比較試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。

2.1.3 滅菌階段參數(shù)確認(rèn) 參考牛型結(jié)核菌素制備工藝和生物指示劑建議的滅菌溫度，將滅菌溫度設(shè)置為121 ℃，調(diào)整滅菌時間，其他參數(shù)保持不變。經(jīng)4 次比較試驗(yàn)，121 ℃維持5 min 即可殺滅嗜熱脂肪地芽孢桿菌。為保障實(shí)驗(yàn)室生物安全，選擇最佳參數(shù)為滅菌時間10 min。不同滅菌階段參數(shù)比較結(jié)果詳見表3。

表2 升溫階段參數(shù)比較試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 排氣階段參數(shù)確認(rèn) 滅菌結(jié)束后，程序進(jìn)入排氣結(jié)束階段。選擇排氣間隔、排氣壓差以及冷卻溫度作為調(diào)整參數(shù)，其他參數(shù)保持不變。4 次比較試驗(yàn)的結(jié)果（表4）表明，縮短排氣間隔和調(diào)高排氣壓差可以降低排氣時長，但存在瓶塞掉落風(fēng)險，因此對這2 個參數(shù)不作調(diào)整。調(diào)高冷卻溫度可以有效縮短開門時間，且未對容器造成影響，出于安全考慮，不再升高冷卻溫度。得出最佳排氣參數(shù)為排氣間隔30 s、排氣壓差12 kPa、冷卻溫度98 ℃。

表3 滅菌階段參數(shù)比較試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 最終滅菌參數(shù)確認(rèn) 經(jīng)過3次重復(fù)性試驗(yàn)，確定最佳滅菌模型為滅菌溫度121 ℃、滅菌時間10 min、升溫間隔0 s、排空4 次、排空上限60 kPa、排空下限-15 kPa、排氣間隔30 s、排氣壓差12 kPa、冷卻溫度98 ℃。在此條件下，生物指示劑與化學(xué)指示卡滅菌檢測結(jié)果均為陰性，液體三角瓶無破損，瓶塞出現(xiàn)1 次掉落，鍋內(nèi)液體在100 ℃以上停留時長由130 min 縮短至77 min，高壓滅菌總時長由390 min 縮短至145 min。具體見表5。

2.2 滿載牛分枝桿菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果（表6）顯示，按照最佳滅菌參數(shù)運(yùn)行后，陽性對照仍有菌生長，而牛分枝桿菌全部被滅活，為陰性，說明滿載牛分枝桿菌的挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果滿意。經(jīng)過3 次重復(fù)，結(jié)果均一致。

表4 排氣階段參數(shù)比較試驗(yàn)結(jié)果

表5 最佳滅菌模型與原程序參數(shù)對比

表6 滿載挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

高壓蒸汽滅菌器普遍應(yīng)用于科研、醫(yī)療、制藥等領(lǐng)域，其快速有效的滅菌效果早已得到業(yè)內(nèi)公認(rèn)。影響高壓滅菌效果的因素有很多種，如溫度、壓力、時間、包裝、裝載量等。滅菌器廠家通常會在機(jī)器內(nèi)預(yù)設(shè)幾種常用物品的滅菌程序，但無論選擇哪種滅菌程序，使用單位都應(yīng)該對滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證，以建立適宜的高壓滅菌模型。高壓滅菌效果對牛型結(jié)核菌素蛋白的活性和成分有較大影響。本試驗(yàn)反復(fù)優(yōu)化了滿載牛型結(jié)核菌素的各項(xiàng)滅菌參數(shù)，目的在于保證滅菌效果的同時保留蛋白活性。

滅菌過程包括排空、升溫、滅菌和排氣4 個階段。排空階段是進(jìn)入鍋體內(nèi)的熱蒸汽與冷空氣置換的過程，冷空氣是否排空完全，直接影響下一階段的升溫速度與滅菌效果。升溫過程控制依據(jù)鍋體內(nèi)配置的3 個溫度傳感器，其中1～2 個為移動溫度傳感器探針。當(dāng)3 個溫度傳感器均達(dá)到設(shè)置的滅菌溫度時，滅菌器進(jìn)入滅菌程序。本試驗(yàn)將移動溫度傳感器探針插入了液體三角瓶中，這樣溫度控制更加精準(zhǔn)，更能保證滅菌效果[7-9]。滅菌結(jié)束后，程序進(jìn)入排氣階段，排氣間隔和排氣壓差會影響鍋體內(nèi)熱蒸汽向外排出，當(dāng)夾套壓力和鍋體內(nèi)壓力為“0”時，鍋體內(nèi)溫度將降至100 ℃。為進(jìn)一步縮短高溫時長，本試驗(yàn)將鍋內(nèi)溫度設(shè)置為自然冷卻至98 ℃時結(jié)束整個高壓程序，經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，高壓滅菌總時長由390 min 縮短至145 min，大大提高了滅菌效率。