豬δ 冠狀病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的建立與應用

苑建軍，楊德全，鞠厚斌，莊建萍，葛菲菲，楊顯超，李鑫，沈海瀟

（1.上海市崇明區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 202150；2.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；3.上海市嘉定區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201800）

豬δ 冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronavirinae）δ 冠狀病毒屬，最先由香港大學的Woo等[1]于2012 年從死亡鳥類、雞、哺乳動物的樣本中發(fā)現(xiàn)。2014 年2 月，美國學者在表現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬和母豬中發(fā)現(xiàn)了PDCoV，病毒導致的仔豬死亡率達30%～40%，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2-3]。此后，加拿大、韓國、泰國、中國、越南、老撾、日本和墨西哥等國家也相繼發(fā)現(xiàn)了PDCoV[4-10]。PDCoV 可以感染試驗雞、犢牛和小鼠等多種動物[11-14]，也可感染人[15]，其跨物種傳播的特性和潛力，對動物和人類健康構成了嚴重威脅[16]。

PDCoV 與豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病 毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）等豬腸道病原感染引起的臨床癥狀極為相似，且存在混合感染現(xiàn)象，因此對該病毒的檢測主要依靠實驗室方法進行。本研究建立了一種PDCoV 實時熒光RT-PCR 檢測方法，以期為其臨床檢測和流行病學調(diào)查提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和菌株 PEDV、TGEV、豬輪狀病 毒（porcine rotavirus，RV）、豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬嵴病毒（porcine kobuvirus，PKV）、大腸桿菌，均由本實驗室保存。

1.1.2 臨床樣品 2017 年9 月—2019 年3 月，采集上海市規(guī)模化豬場出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬糞便樣品42 份，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司；One Step PrimeScript?RT-PCR Kit、DNA 純化回收試劑盒、pMD 19-T Vector Cloning Kit、DL 2 000 DNA Marker、DH5α感受態(tài)細胞，購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.1.4 引物和探針設計 從GenBank 中下載不同PDCoV 毒株M基因序列，采用MEGA 5.0 軟件進行序列比對，利用Primer express 3.0.1 軟件設計引物和探針（表1）。

表1 引物及探針序列

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒標準品構建 將PDCoV S582N株（GenBank 登錄號：LC216915）M基因序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并克隆至pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞內(nèi)，構建重組質(zhì)粒。測序鑒定無誤后抽提質(zhì)粒作為標準品，利用Nanodrop 2000c 測定質(zhì)粒濃度，并按下面公式將濃度換算成拷貝數(shù)。DNA copies/μL=[6.02×1023×DNA 濃度（ng/μL）×10-9]/（DNA 堿基數(shù)×660）

1.2.2 反應條件優(yōu)化 對反應體系中的引物和探針濃度（引物濃度1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L，探針濃度1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）、反應參數(shù)（反轉(zhuǎn)錄時間5、10、15 min，退火溫度56、58、60 ℃，退火時間20、30 s）等條件進行摸索和優(yōu)化，確定最適反應條件。

1.2.3 標準曲線繪制 經(jīng)計算，陽性重組質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度為1.3×1010copies/μL。用ddH2O對陽性重組質(zhì)粒連續(xù)作10 倍系列稀釋，分別取濃度為1.3×103～1.3×107copies/μL 的陽性重組質(zhì)粒作為反應模板，按照優(yōu)化好的反應條件進行實時熒光RT-PCR 反應，每個梯度重復3 次，繪制標準曲線。

1.2.4 特異性試驗 分別以本實驗室保存的PEDV、TGEV、RV、PTV、PKV、大腸桿菌核酸及PDCoV 陽性重組質(zhì)粒為模板，進行實時熒光RT-PCR 擴增，設ddH2O 為陰性對照，評價方法的特異性。

1.2.5 靈敏性試驗 用ddH2O 對陽性重組質(zhì)粒連續(xù)作10 倍系列稀釋，分別取1.3×100～1.3×106copies/μL的陽性重組質(zhì)粒進行實時熒光RT-PCR 擴增，設ddH2O 為陰性對照，評價方法的靈敏性。

1.2.6 重復性試驗 對拷貝數(shù)濃度范圍為1.3×104～1.3×107copies/μL 的陽性質(zhì)粒，采用同批次配制的反應體系重復檢測3 次，計算批內(nèi)變異系數(shù)；采用3 個不同批次配制的反應體系重復檢測3次，計算批間變異系數(shù)。

1.2.7 臨床樣品檢測 將42 份糞便樣品分別與PBS按體積比1:10 混懸，震蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min；取上清液用試劑盒提取核酸，加入上述反應體系進行實時熒光RT-PCR。同時，按照文獻[17]中的普通RT-PCR 方法對樣品核酸進行平行檢測，將2 種方法的檢測結果進行比較，計算兩種方法的符合率。

2 結果與分析

2.1 反應條件優(yōu)化

通過棋盤法對引物和探針濃度進行優(yōu)化，當上下游引物濃度為0.2 μmol/L，探針濃度為0.4 μmol/L 時，熒光信號最強，熒光擴增效率最高，因此將其確定為最佳工作濃度；當反轉(zhuǎn)錄時間為5 min 時，熒光擴增效率較低，Ct 值略高，10 min和15 min 的熒光擴增效率基本一致，Ct 值無顯著差異，從節(jié)約時間上考慮，選擇反轉(zhuǎn)錄時間為10 min；當退火溫度為60 ℃，退火時間為30 s 時，熒光擴增效率最高。因此，確定本研究建立的實時熒光RT-PCR 檢測方法的最佳反應體系：2×One Step RT-PCR Buffer II 12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）1.0 μL，RNA 5.0 μL，最后用RNase Free ddH2O 補足至25.0 μL。反應條件：50 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)。

2.2 標準曲線繪制

以拷貝數(shù)濃度為1.3×103～1.3×107copies/μL的陽性重組質(zhì)粒為模板進行實時熒光RT-PCR 擴增，每個梯度重復3 次。結果（圖1）顯示，在該拷貝數(shù)濃度范圍內(nèi)，拷貝數(shù)對數(shù)值（x軸）與Ct 值（y軸）呈良好的線性關系，線性方程為y=-3.039x+27.464，R2=0.994。

圖1 標準曲線

2.3 特異性試驗

分別以PEDV、TGEV、RV、PTV、PKV、大腸桿菌核酸及PDCoV 陽性重組質(zhì)粒為模板，用本研究建立的實時熒光RT-PCR 檢測方法進行擴增，驗證方法的特異性。結果（圖2）顯示，僅PDCoV 出現(xiàn)特異性擴增曲線，而其他樣品均未出現(xiàn)特異性擴增曲線，表明該方法的特異性良好。

2.4 靈敏性試驗

用拷貝數(shù)濃度為1.3×100～1.3×106copies/μL的標準質(zhì)粒進行實時熒光RT-PCR 擴增。結果（圖3）顯示，本方法的最低檢出限為13 copies/μL。

2.5 重復性試驗

結果（表2）顯示，該方法的批內(nèi)CV 為0.24%～0.76%，批間CV 為0.57%～ 2.15%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于3%，表明本方法具有較好的重復性。

2.6 臨床樣品檢測

利用本研究建立的實時熒光RT-PCR 檢測方法對42份糞便樣品進行檢測，結果檢出5份陽性樣品，陽性率為11.9%（5/42），而使用普通RT-PCR 方法檢測上述樣品，有3 份為陽性（圖4），陽性率為7.1%（3/42），二者的符合率為95.2%。

圖2 特異性試驗結果

圖3 靈敏性試驗結果

表2 重復性試驗結果

圖4 普通RT-PCR 檢測陽性結果

3 討論

PDCoV 是引發(fā)豬腹瀉的重要病原之一，可引起豬較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重威脅我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。PDCoV 引發(fā)的腹瀉癥狀與PEDV、TGEV 等豬腸道病原相似，均以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和食欲下降為主要特征，且各年齡段豬群均易感，其中新生仔豬的感染率和發(fā)病率較高，感染后死亡率為30%～40%。國內(nèi)外多項研究[7，18-19]表明，檢測樣品中有20%～50%為PDCoV 和PEDV 雙陽性，呈現(xiàn)共感染特征。目前國內(nèi)的流行病學調(diào)查結果[7]顯示，PDCoV 與PEDV 普遍共存于腹瀉豬群中，給豬腹瀉病的防控增加了難度。

目前，PDCoV 防控尚無商品化疫苗可用，在感染早期及時作出準確診斷至關重要。而傳統(tǒng)的病毒檢測方法，如病毒分離鑒定、普通PCR、ELISA等，存在操作復雜、費時費力、靈敏度低、特異性不強、試驗周期長等不足。熒光定量PCR 因具有優(yōu)異的靈敏度和特異性且快速簡便而被廣泛用于多種疫病的臨床診斷中。由于TaqMan 探針法不受非特異性擴增及引物二聚體的影響，在特異性和準確性方面遠遠優(yōu)于染料法，本研究根據(jù)NCBI 上已公布的PDCoV的M基因保守區(qū)域設計特異性引物和探針，通過對PCR 反應體系和條件進行優(yōu)化和驗證，成功建立了PDCoVTaqMan 實時熒光RT-PCR檢測方法。

本研究建立的方法在1.3×103～1.3×107copies/μL拷貝數(shù)濃度范圍內(nèi)，拷貝數(shù)對數(shù)值與Ct 值呈良好的線性關系，R2=0.994；最低檢出限為13 copies/μL，較文獻[20-21] 報道的SYBR Green I 染料法和TaqMan 探針法更靈敏；利用該方法檢測PEDV、TGEV、RV、PTV、PKV 和大腸桿菌等病原核酸，均無擴增曲線，表明本方法特異性良好。利用本研究建立的實時熒光RT-PCR 方法與普通RT-PCR同時檢測臨床樣品，兩種方法的符合率為95.2%，且實時熒光RT-PCR 陽性率（11.9%）高于普通RT-PCR（7.1%）。綜上所述，本研究建立了一種靈敏、特異、可靠的PDCoV 實時熒光RT-PCR 檢測方法，能夠滿足臨床診斷和流行病學調(diào)查需求，為該病的有效防控提供了技術支持。