鴨星狀病毒3 型RT-RAA 快速檢測方法的建立

鄧春冉，張富友，尚佳靜，羅娟，于曉慧，蔣文明，劉華雷，王一新，劉冠慧，徐麗娜，李陽

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；3.山東農業大學動物醫學院，山東泰安 271018）

禽星狀病毒（avian astrovirus，AAstV）屬于星狀病毒科，包含多種亞型，是危害家禽養殖業的重要病原之一。AAstV 是一種無囊膜的單股正鏈RNA 病毒，直徑25～35 nm，基因組全長6.1～7.9 kb，包括5'端非編碼區、3 個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2）、3'端非編碼區和1 個多聚腺苷酸尾巴[1]。鴨星狀病毒（DAstV）是最早被發現的AAstV，早在1965 年研究人員就從患病毒性肝炎的鴨群中發現了DAstV。目前，已知的DAstV 基因型有4 種（DAstV-1～4）[2-4]，其中DAstV-3 是近年來在我國鴨群中感染率較高的星狀病毒，流行的范圍也越來越廣，可以引發鴨病毒性肝炎、產蛋下降等，給我國養鴨業帶來了嚴重經濟損失[5]。

目前，對于DAstV-3 的檢測主要依靠傳統RT-PCR、熒光RT-PCR 和血清學檢測等方法，但這些方法耗時長，對設備要求較高，并不適用于DAstV-3 的現場快速檢測。重組酶介導的等溫擴增技 術（recombinase aided amplification，RAA）是一種利用重組酶、單鏈結合蛋白和DNA 聚合酶，在恒溫條件下進行核酸擴增的新技術，相比于傳統的PCR 檢測方法，具有快速、簡便、靈敏等優點，目前已被應用于乙型腦炎病毒[6]、新型冠狀病毒[7]、雞滑液囊支原體[8]等病原體的快速檢測，在很大程度上為疫病防控提供了便利。本研究建立了一種DAstV-3 的RT-RAA 快速檢測方法，以期為該病原感染臨床快速診斷和流行病學調查提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RT-RAA 核酸擴增試劑盒（熒光法），購自杭州眾測生物科技有限公司；一步法RT-PCR 試劑盒（HiScript High Fidelity One step RT-PCR Kit），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自濟凡生物科技（北京）有限公司；轉錄試劑盒（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7），購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；純化試劑盒（RNeasy Mini Kit），購自德國QIAGEN 有限公司；膠回收試劑盒，購自賽默飛世爾科技公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit 和Trans5α Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術（TransGen Biotech）股份有限公司；LB培養基，購自青島海博生物技術有限公司；DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要儀器 RAA-B6100 恒溫振蕩混勻儀、RAA-F1620 恒溫核酸擴增檢測儀，購自江蘇奇天基因生物科技有限公司；miniAmp PCR 儀、Nano Drop 核酸定量儀，購自賽默飛世爾科技公司；渦旋振蕩器，購自上海沃元科技有限公司。

1.1.3 病毒及臨床樣本 DAstV、H9 亞型禽流感病毒（H9-AIV）、鵝星狀病毒（GoAstV）、新城疫病毒（NDV）、禽呼腸孤病毒（ARV）等，均由中國動物衛生與流行病學中心分離鑒定并保存。鴨拭子和組織樣品，采集自廣東、廣西、福建、湖南等地，共計166 份。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針設計與合成 依據DAstV-3 參考毒株CPH 株（GenBank：KJ020899）基因序列，利用Oligo 軟件設計探針和引物，序列詳見表1。所有引物及探針均由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2 cRNA 標準品制備 以提取的DAstV-3 RNA 為模板，使用AAstV 通用引物（XZ-F/R）擴增DAstV-3的RdRp基因，回收目的片段后連接到T 載體上，通過熱激將重組質粒轉化進大腸桿菌感受態細胞DH5α 中；篩選陽性單克隆菌落并進行培養，使用SpeI 內切酶對陽性質粒進行單酶切；使用膠回收試劑盒對酶切后的質粒進行純化，選擇合適濃度的純化產物作為模板，使用T7 轉錄試劑盒進行體外轉錄，再使用RNeasy Mini Kit 純化試劑盒對轉錄產物進行純化，以除去體系中的雜蛋白和各種離子；使用Nano Drop 核酸定量儀測量cRNA標準品濃度，通過公式計算拷貝數，并將cRNA 標準品10 倍倍比稀釋至100copies/μL，-80 ℃保存。

表1 引物探針序列

1.2.3 RT-RAA 方法建立及優化

1.2.3.1 引物篩選 以1.2.2 制備的cRNA 為模板，將表1 中的8 種上游引物和6 種下游引物分別進行組合（共48 對），挑選起峰時間早、擴增曲線斜率高的引物組合作為最佳引物對。按照熒光RT-RAA 擴增試劑盒說明書配制反應體系（表2），在含有凍干粉的反應管中加入47.5 μL 上述混合液，在管蓋上加2.5 μL B-Buffer（280 mmol/L 乙酸鎂），小心蓋好蓋子，置于恒溫振蕩混勻儀中振蕩混勻，再轉移到恒溫核酸擴增檢測儀中，39 ℃反應20 min。

表2 RT-RAA 反應體系

1.2.3.2 反應條件和反應體系優化 對RT-RAA的反應溫度、引物探針用量等參數設置梯度，分別設置反應溫度為37、39、41 ℃，引物用量為2.0、1.6、1.2、0.8 μL，探針用量為0.6、0.4、0.2 μL。對比不同條件下的熒光擴增曲線斜率，確定最佳反應條件，同時設置陰性對照。

1.2.3.3 特異性試驗 使用優化的RT-RAA 方法，分別對DAstV-3、H9-AIV、GoAstV、NDV、ARV等常見禽病毒進行檢測，以驗證該方法的特異性。

1.2.3.4 靈敏性試驗 以拷貝數濃度為106～100copies/μL 的cRNA 標準品為模板，使用建立的RT-RAA 方法進行檢測，測定模板的最低檢出量，從而確定該方法的靈敏性。

1.2.3.5 重復性試驗 以106～100copies/μL 拷貝數濃度的cRNA 標準品為模板，RNase-free water為陰性對照，利用優化的熒光RT-RAA 方法進行試驗，設置8 個重復，并統計重復試驗結果。

1.2.4 臨床樣品檢測 利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法同時對采集的166 份臨床樣品進行檢測，驗證該方法的臨床適用性。

2 結果

2.1 RT-RAA 反應體系建立

2.1.1 引物篩選 選擇起峰時間早、擴增曲線斜率高的引物為最佳組合。從48 對引物中挑選7 對引物組合作圖。結果（圖1）顯示：F8/R1 組合擴增效果最好，因此選用此組合進行后續試驗。

圖1 部分引物篩選結果

2.1.2 反應體系優化 分別選擇不同反應溫度（37、39、41 ℃）、不同引物用量（2.0、1.6、1.2、0.8 μL）和不同探針用量（0.6、0.4、0.2 μL）進行RT-RAA 試驗，對比不同條件下的熒光擴增曲線斜率。結果顯示：3 種探針用量對RT-RAA擴增結果影響不大（圖2）；引物用量為2.0 μL和1.6 μL 時，RT-RAA 的擴增結果更好（圖3）；3 種反應溫度對RT-RAA 擴增結果影響不大（圖4～6）。綜合考慮試劑盒說明書要求和試驗成本，最終確定引物用量為2.0 μL，探針用量為0.4 μL，反應溫度為39 ℃。

圖2 不同探針用量下RT-RAA 反應結果

圖3 不同引物用量下RT-RAA 反應結果

圖4 37 ℃條件下RT-RAA 反應結果

圖5 39 ℃條件下RT-RAA 反應結果

圖6 41 ℃條件下RT-RAA 反應結果

2.1.3 特異性試驗 利用優化的RT-RAA 方法分別對DAstV-3、GoAstV、H9-AIV、NDV、ARV 進行檢測。結果（圖7）顯示：只有DAstV-3 出現特異性熒光擴增曲線，其他病毒均未出現擴增曲線。

圖7 特異性試驗結果

2.1.4 靈敏性試驗 以10 倍倍比稀釋的cRNA為模板，利用優化的RT-RAA 反應體系進行檢測。結果（圖8）顯示：建立的RT-RAA 方法最低檢測限為101copies/μL。

圖8 靈敏性試驗結果

2.1.5 重復性試驗 使用建立的RT-RAA 方法進行重復性試驗。結果顯示：以106～103copies/μL 的cRNA 標準品為模板，8 次檢測均出現擴增曲線；以102copies/μL 的cRNA 標準品為模板時，8 次檢測中有6 次出現擴增曲線；以101copies/μL 的cRNA 標準品為模板時，8 次檢測中有3 次出現擴增曲線；以100copies/μL 的cRNA 標準品為模板時，8 次檢測均為陰性。

2.2 臨床樣品檢測

利用建立的RT-RAA 方法和RT-PCR 方法分別對166 份臨床樣品進行平行檢測。結果（表3）顯示：RT-RAA 方法檢測到40 份陽性樣品，RT-PCR 檢測到22 份陽性樣品，其中兩種方法均檢測為陽性的樣品有22 份。為驗證RT-RAA 方法的準確性，對RT-RAA 結果陽性但RT-PCR 結果陰性的樣品進行測序鑒定，證實均為DAstV-3。結果表明，RT-RAA 方法檢測結果準確可靠，且具有更高的陽性檢出率。

表3 RT-RAA 和RT-PCR 方法臨床樣品檢測結果統計單位：份

3 討論

AAstV 是近年來新發現的一種重要病原，既可通過水平和垂直傳播，也可跨物種傳播，除可感染雞、火雞、鴨等禽類外，也可感染哺乳動物[10]，導致AAstV 感染的診斷與防控難度日益增大。作為一種潛在的人獸共患病毒，AAstV 對人類健康構成了嚴重威脅[11]。DAstV-3 在我國最早于2014年被發現并報道，其傳播速度快，分布范圍廣，給我國養鴨業帶來較大的經濟損失[12]。目前，實驗室常用的DAstV-3 檢測方法主要有病毒分離培養、分子生物學檢測、電子顯微鏡（EM）觀察等[13]，但鑒于DAstV-3 的分離培養較為困難，常規檢測耗時長且操作復雜，電子顯微鏡對儀器設備要求較高等原因，以上方法均無法滿足DAstV-3 的快速和大規模檢測需求。因此，開發一種快速、特異、靈敏、操作簡單的檢測方法至關重要。

RAA 技術是近年來快速發展的一種新型等溫擴增技術。該技術利用大腸桿菌酶將模板核酸鏈解螺旋后，在重組酶、聚合酶作用下對模板核酸進行重組和特異性擴增。恒溫條件下，RAA 技術在20～30 min 內即可完成核酸快速擴增，具有特異性強、成本低、耗時短及結果判讀簡單直觀等優勢，已在多種動物病原檢測中被廣泛應用，具有廣闊的發展前景。DAstV-3 作為新發病原，目前尚未見RT-RAA 檢測方法的報道。在此背景下，本研究建立了一種基于熒光探針的DAstV-3 RT-RAA 快速檢測方法。

DAstV-3的RdRp基因編碼病毒核糖核酸聚合酶，該基因序列在不同DAstV-3 毒株中較為保守。本試驗首先分析了GenBank 中登錄的DAstV-3RdRp序列，根據保守序列設計了特異性引物及探針，驗證確定最佳引物后，對該方法的反應條件進行了優化，并對其靈敏度、特異性和重復性進行了驗證。結果表明，本試驗所建立的熒光RT-RAA檢測方法僅需20 min 即可完成樣品的快速檢測，與常見的禽病毒無交叉反應，其最低檢測限可達101copies/μL。為進一步驗證該方法的臨床應用效果，采用該方法檢測166 份臨床樣品，發現熒光RT-RAA 方法的陽性檢出率高于常規RT-PCR 方法。同時，檢測結果也提示，DAstV-3 在我國鴨群中感染率可能較高，需要持續關注該病毒的流行及其帶來的危害。

綜上，本研究建立了一種DAstV-3 RT-RAA 快速檢測方法。該方法特異性強，靈敏度高，操作簡單，為開展DAstV-3 的快速檢測及流行病學監測提供了可靠的技術支撐，具有良好的應用前景。