納米抗體在口蹄疫防治中的研究進展

靳慧茹，武藝，賈婷，張宏亮，王申元，凌宇，劉羿羿，劉春霞，周歡敏，李璐，張焱如，曹俊偉

（1.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古自治區生物制造重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；2.赤峰市元寶山區農牧局，內蒙古赤峰 024076）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的高度接觸傳染性疫病，侵染對象為豬、牛、羊等偶蹄類動物[1]。FMD 發病率高，傳播途徑廣，常引發幼畜患心肌炎而猝死，是威脅偶蹄動物健康的主要疾病之一。FMD 曾在歐洲、亞洲、非洲以及南美洲地區流行[2]，其最具代表性的臨床特點為口腔黏膜以及蹄部和乳房皮膚發生水皰、糜爛或潰瘍性病變。FMDV 基因組是一個單鏈RNA，長約8.5 kb。FMDV 由4 種（VP1—VP4）結構蛋白組成的蛋白質外殼包裹，共有7 種血清類型，分別為A、O、C、Asia1 以及SAT1、SAT2 和SAT3，各血清型間無交叉免疫保護[3]。接種滅活疫苗是預防FMD 的主要措施之一。完整病毒粒子（146S）和空衣殼（75S）可以使疫苗具有較好的免疫保護力，而這兩種顆粒在疫苗制造、配制和儲存過程中都可能被解離成12S 亞單位，導致疫苗效力降低[4]。由于目前尚缺乏能夠長期有效且完全抑制FMDV 的藥物或疫苗，因此如何研究出高效的抗FMDV 藥物仍需不斷探索。

納米抗體，一種存在于駝科動物體內僅含有重鏈可變區的特異性抗體。這些特異性抗體可以通過自身單個結構域進行抗原識別，最初被命名為VHH（variable domain of the heavy chain of heavychain antibody），而后根據其相對分子質量極小的特點被命名為納米抗體（nanobody，Nb）[5]。Nb可與酶、底物、放射性物質和其他生物活性物質連接形成融合的Nb 以表達特定的功能效應[6-7]。相比傳統單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb），Nb 結合抗原的能力優于mAb。Nb 抗原結合系統非常廣泛，可以與其他抗體片段通過巢式PCR 技術擴增獲得中和能力更強的雙特異性Nb，創建具有高親和力和高效力的多價分子[8-9]。

Nb 因獨特的結構成為對抗病毒的抗體之一，為病毒性疾病的診斷和治療開辟了新天地，目前在獸醫學領域應用范圍很廣，許多RNA 病毒疾病的治療方向已被轉入Nb 開發中。近年來，隨著生物技術的不斷發展，各領域對Nb 的研究愈發深入。Nb 不僅可以作為探針來診斷疾病，將藥物傳遞到機體內部，還可以作為免疫抑制劑或治療藥物來中和病毒毒力，且Nb 的制備也可以采用噬菌體篩選技術快速獲得[10]。目前已經有許多Nb 類藥物被批準上市，應用于炎癥性疾病、腫瘤等各種疾病的診療中，在未來的研發中Nb 將會發揮更大的作用。本文主要對Nb 的優勢及其目前在FMD 防治中的應用等相關內容進行綜述并作展望。

1 Nb 的結構

1993 年Hamers-Casterman等[11]在駱駝體內首次發現一種只有重鏈，缺乏輕鏈和第一個恒定 區CH1（conventional region of heavy chain 1）的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HCAb），克隆其可變區得到的單域抗體即為Nb。Nb 是一種新型天然抗原特異性結合功能片段（antigenbinding fragments，ABF），也是目前已知的最小ABF[12]。Nb 可以通過基因工程改造融合后獲得新的結構模塊，從而實現多特異性和多功能性[13]。Nb 晶體呈橢圓形，短軸只有2.5 nm，長軸4 nm，相對分子質量為12～15 kDa，大小只有傳統mAb（約150 kDa）的10%左右，單鏈可變片段（single chain variable fragments，scFv，約30 kDa）的50% 左右，抗原結合片段（約50 kDa）的33% 左右[14-15]。各類抗體相對分子質量示意圖見圖1[16]。Nb 由3 個抗原互補決定區（complementarity determining region，CDR）和4個框骨架區（framework region，FR）組成。其中CDR3 會與CDR1、CDR2 或FR2 之間通過二硫鍵相連，進而形成一種穩定結構，這有助于CDR3 凸形結構的形成。研究[16-17]表明，CDR3 通常采用α-螺旋構象進行抗原識別，是抗原結合的主要位點。

2 Nb 的特性

圖1 各類抗體相對分子質量示意圖

駱駝的VHH（Nb）相比傳統mAb 單域可變區（heavy chain variable region，VH）而言，二者同源性可達到80%（圖2）。與VH 相似，駱駝VHH（Nb）包含9 個β-鏈組成典型的IgV 折疊，但其免疫原性較低，且輕鏈可變區（VL）的缺失導致兩種片段在功能上存在顯著差異[18]。在傳統的VH 區域中，FR2 片段是由4 個高度保守的疏水氨基酸（Val37、Gly44、Leu45 和Trp47）組成，這些氨基酸可以與Gln39、Gly44、Tyr91 和Trp103一起形成一個保守的疏水界面。而在VHH（Nb）中，為了避免如此龐大的疏水區暴露在溶劑中，其FR2片段則由更親水的氨基酸（Phe37、Glu44、Arg45和Gly47）組成，且其對溫度和pH 變化表現較穩定，表明VHH（Nb）溶解性更好，穩定性更強[19-22]。

VHH（Nb）與VH 的CDR3 環長度也存在明顯差異。VHH（Nb）的CDR3 長度超過20 個氨基酸殘基，而傳統抗體可變區VH 的典型氨基酸長度僅為9 個（小鼠）或12 個（人）。VHH（Nb）的CDR1 和CDR3 氨基酸序列較長，其形成的凸環結構可深深嵌入到抗原分子的凹槽或縫隙中，以增大與抗原相互接觸和作用的表面積，也相對彌補其因缺少輕鏈而喪失的抗原結合能力。而CDR1 和CDR2 由于在結構上容易彎折，非常便于免疫球蛋白與抗原表位相結合，因此可以增強抗原抗體的結合能力[23-26]，使VHH（Nb）具有較高的親和力及識別能力。

在目前的抗體治療領域中，抗體大小可以決定其治療效果[27]。由于Nb 體積小，且具有高組織滲透性，它們能夠快速滲透到組織中，使其或相關藥物的作用發揮到極致，從而避免機體被病毒感染[28]。同時，Nb 分子結構簡潔，更易于被克隆與基因修飾，可在各種細胞中重組表達，也可在大腸桿菌和酵母菌等微生物表達系統中自由表達，這為工業化大規模生產奠定了基礎。因Nb 缺少傳統抗體的Fc（fragmentcrytallizable）片段，所以避免了Fc 段可能引起的補體反應，使其對人體的免疫原性很低，從而表現出較好的生物相容性[29]。

圖2 VHH 和VH 結構示意圖[30]

3 Nb 在FMD 診斷中的應用

基于FMDV 感染特性，研究者們非常重視開發新的早期診斷方法。血清檢測是動物進出口認證、動物“無感染”狀態確認以及證明疫苗有效性所必需的，因此被認為是FMD 診斷方法的重要組成部分[31]。目前針對FMD 診斷已經研發出幾種酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），但需要多次評估其特異性、靈敏性及重復性，且試驗抗體耗費較大，使得一些發展中國家無法承擔。利用Nb 生產成本低等一系列優點，Gelkop等[32]針對烏干達牛群FMDV 非結構蛋白（non-structural proteins，NSP）3ABC 的Nb，開發了一種新型競爭ELISA 方法，用于血清檢測。他們將O 型FMDV 的3ABC 蛋白成功純化表達，注射到駱駝體內，使其產生免疫抗體，構建噬菌體展示文庫，經淘洗、篩選得到與目的蛋白親和力較高的Nb；利用自制的基于Nb 的競爭性NSPELISA 來檢測FMDV 3ABC 蛋白的循環抗體水平，分析其診斷敏感性（diagnostic sensitivity，DSE）和診斷特異性（diagnostic specificity，DSP），并與PrioCHECK 商業化的FMDV NSP 檢測結果進行比較，結果發現兩種分析方法具有高度一致性，表明研發方案可應用于FMD 診斷，可大大節約檢測成本。此外，另有研究[33-34]將FMDV O 型（INDR2/1975）、A 型（IND40/2000）和Asia1型（IND63/1972）疫苗株滅活全病毒作為抗原免疫駱駝，制備FMDV 特異性Nb。通過構建抗FMDV的VHH 片段，使其在細菌中成功大量表達，經篩選濃縮后發現，在ELISA 檢測中VHH 的表位鑒定可以充分捕捉抗體，代替傳統兔血清成為包被抗體，成功應用于液相阻斷ELISA（liquid-phase blocking ELISA，LPB-ELISA），并且證實建立的LPB-ELISA 與標準LPB-ELISA 相似性極高，而重組VHH 的生產也非常有助于減少樣品檢測成本。還有研究[35]利用雙抗夾心法（double antibody sandwich，DAS）分離獲得具有廣譜識別能力的特異性Nb。該抗體可以定量FMD 疫苗中的完整衣殼蛋白，是監測疫苗生產、配制和儲存過程中完整衣殼數量和穩定性的極佳工具。2017 年Harmsen[36]等在美洲駝的免疫文庫中，利用噬菌體篩選技術分離到針對FMDV SAT2 和Asia1 型毒株的特異性Nb。這些特異性結合146S 顆粒的Nb 不會與其他FMDV 血清型毒株結合，故利用這一特點構建了新型ELISA。試驗表明，這些特異性Nb 可以用作FMD 疫苗質量的控制與研發。根據前人的試驗積累，王迪[37]使用FMDV 滅活苗免疫雙峰駝，構建親和力較高的Nb 免疫文庫，篩選得到兩株Nb，并證明這兩株Nb 特異性較好，親和力較高。之后他們使用量子點——一種半導體納米微晶，對單域抗體進行偶聯，發現間接免疫熒光方法可檢測到BHK-21 細胞內的FMDV，這有利于檢測細胞與病毒間的關系，為探索Nb 在FMD 檢測診斷中的應用提供了新型思路。生物傳感器即通過分子識別元件（生物活性物質）去結合被測目標，從而產生某種物理或化學變化，將此變化轉換為可以被檢測到的信號進行分析[38]。Nb 因具有高度特異性被廣泛用作生物傳感器。Trilling[39]等利用識別FMDV 的Nb 蛋白制作生物傳感器，采用點擊化學方法，將暴露環辛炔的表面等離子體共振（SPR）芯片與具有疊氮化物的VHH 結構域反應，結果發現生物傳感器的靈敏度提高了800 倍，表明這項技術可能有助于加強對FMD 的控制和早期診斷。

總的來說，隨著科技的進步，抗體已被證明是診斷方法開發的核心[40]。盡管單克隆抗體在診斷中發揮著重要作用，但它們的生產技術要求很高，而且價格昂貴。Nb 則因其良好的生物特性、物理化學特性以及生產成本相對實惠的優勢被廣泛應用于病毒檢測。

4 Nb 在中和FMDV 中的作用

現如今FMD 的防御主要依賴于滅活病毒疫苗的接種。目前的疫苗針對FMDV 雖具有一定的保護性免疫反應，但是由于病毒復制能力強、傳播速度快，或許已經超過了其免疫防御系統的清除速度，且FMDV 血清型間顯著的抗原多樣性，使開發具有抗病毒逃逸能力的中和抗體顯得尤為重要。Harmsen等[41]通過篩選4 個大羊駝的噬菌體展示免疫庫，鑒定出24 個能夠在體外中和O 型FMDV的Nb，其中M8 和M170 的單個中和活性最強；將M8 和M23 混合免疫時起到的保護作用更顯著，說明M8 和M23 會對FMDV 表現出較強的協同中和作用。2008 年Harmsen等[42]又將3 個結合FMDV 的Nb（M3、M8 和M23）與結合FMDV的豬IgM 分別進行融合，在體外獲得了3 個雙功能的中和抗體，這3 株雙特異性Nb 抗體半衰期比單價Nb 延長了100 倍，在體外與單價抗體一樣有效中和了FMDV，而且可有效減少病毒血癥和排毒，抑制病毒傳播。隨著研究的進行，Harmsen等[43]發現，僅兩種融合的VHH 對豬起到的保護作用時間短，因此將先前構建的兩個VHH 的基因融合體（VHH2）與其他型號FMDV 的VHH 結合，得到兩個Nb。實驗結果表明兩個Nb 共同作用要比單個Nb（VHH）更有效地中和FMDV，在豬FMD 激發感染前24 h 注射這兩個Nb 的混合物可減少并延遲臨床疾病、病毒血癥和病毒脫落的發展。Dong等[44]為了研究M8 和M170 的血清型特異性或交叉反應性，通過ELISA 檢測發現M170僅與O 型結合，而M8 可以和A、Asia1 和C 血清型結合；為了探索這兩種抗體是否能同時結合病毒，他們進行了競爭性表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）分析，證明一種抗體的結合會阻斷另一種抗體的附著，因此二者存在競爭關系；然后他們給豚鼠體內注射特異性抗體，通過檢測豚鼠體內病毒載量來評估這兩種抗體的保護效果，結果發現在服用治療性Nb 之前，豚鼠體內可檢測到高水平的病毒復制，而注射M8 和M170 后豚鼠體內病毒滴度大幅降低。通過結構分析得出，M8 和M170 會分別識別RGD 基序和HS 結合位點，阻止FMDV 附著到宿主細胞表面，具有阻斷病毒突變逃逸的巨大潛力[45]。

自1930 年以來，人們一直在嘗試開發FMDV強效疫苗。FMDV 疫苗接種歷史記錄了各種類型的疫苗，例如滅活病毒疫苗和空衣殼疫苗，減毒疫苗和重組疫苗[46-47]。但它們都存在局限性，如昂貴、保質期短、保護期短等問題[48]。目前關于FMD Nb 治療方面的研究較少，而Nb 作為一種簡單、經濟、有效的工具，可以快速誘導機體產生中和反應，以對抗傳染性疾病和難治性疾病，因此此類型抗體研發非常必要。

5 Nb 在FMD 治療中的展望

FMDV 的聚合酶缺乏校對能力，使其基因組具有非常高的突變率[49]。目前我國流行的FMDV血清型主要為A、O 型。Nb 作為一種溶解度高、熱穩定性強、親和能力高和生產成本低的理想抗體，可以彌補單克隆抗體生產成本高、滲透力弱等一系列缺陷，即使在嚴苛的外界環境條件下，Nb 仍然可以保持原有的抗原結合能力，并且使疫苗效力與儲存得到保障。利用駱駝的天然文庫或免疫文庫篩選得到的Nb 可以有效中和病毒，且其序列和長度的高度可變性使得它們可以識別各種蛋白質表位，包括裂隙中的隱藏表位，從而抑制或降低受體與病毒蛋白的結合作用，增強抗病毒藥物的中和作用。多價結合的Nb 也有希望提高病毒中和效力。晶體結構的解析也可以更具體地分析抗原位點，為后期FMD 治療提供有力依據。有研究[50]從SARS-CoV-2 刺突蛋白受體結合域（RBD）免疫的駱駝中鑒定到一組高親和力Nb，通過晶體解析了與RBD 形成復合物的兩個非競爭Nb（NB1A7和NB1B11）的結構，發現Nb 針對SARS-CoV-2變異株和其他冠狀病毒共有的高度保守的隱蔽表位，阻斷了刺突蛋白與ACE2 受體的結合，且這兩種抗體連接形成的多價抗體顯著提高了親和力與中和力，可進一步抑制病毒逃逸。另有研究[51-52]發現，針對不同表位的單價和雙價表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的特異性Nb 和雙價異型Nb 都在體外和體內成功抑制了實體瘤的生長。

FMD 傳播迅速且途徑廣泛，應及早預防?，F階段，已有諸多研究團隊通過噬菌體展示等技術篩選出多種可以與FMDV 蛋白相互作用的高效Nb。研制靶向FMDV 的Nb 為將其用于FMD 的疫苗研發奠定了基礎，對保障畜牧業的健康發展，改善因病毒感染造成的經濟損失具有重要意義。

6 結語

Nb 研究是一個多元化的領域。Nb 憑借其自身獨特的優點成為醫學方面抗體研究不可或缺的角色，同時作為強大的治療和診斷試劑，在生物技術中得到大量應用，成為當下疾病診斷、治療和藥物研發等的主要研究對象。Nb 在生物、物理和治療方面的高效性和多功能性一直是其研發的重要驅動力，其高度穩定性使其在細胞內表達自如，并有助于產生功能性的抗原結合體。這種強有力的功能為設計分子生物學或發育生物學創新工具帶來了無數可能性，為未來科研與疾病治療開辟了新型道路。