移液工作站在獸醫檢測工作中的應用

楊得勝，孫榮釗

（1.福建省動物疫病預防控制中心，福建福州 350003；2.青島立見生物科技有限公司，山東青島 266032）

隨著各行業對動物疫病防控認識程度的不斷加強，監測數量不斷增加，檢測的精準化和通量化要求也迅速提升，自動化技術也逐步應用于實驗室工作。獸醫實驗室監測工作，主要包括血清學抗體和病原學核酸等檢測項目。這些項目需要進行精確移液，而自動化工作站將已經成熟的工業自動化控制技術與液體移動技術相結合，越來越廣泛地被應用到獸醫實驗室檢測工作[1]。本文就血清抗體檢測和病毒核酸檢測工作中使（試）用的工作站進行評估，以期建立更高精度、高通量的抗原抗體檢測“標準化+全面質量管理”標準操作流程。

1 移液工作站在動物疫病血清學檢測中的應用

運用血清學檢測技術開展免疫抗體監測，可評估免疫效價是否可靠，免疫方式是否有效，免疫程序是否合理等。血清學監測是動物疫病監測預警的重要手段之一，通過定期、分階段、分群體地對養殖場內動物群體進行血清學監測，可以準確了解監測群體的免疫狀況和健康狀況，從而制定相應的防控措施，提高免疫效果。同時血清學監測也可進行疫病檢測和凈化及動物性食品安全監管。目前動物疫病血清學監測常用方法包括酶聯免疫吸附試驗、血凝和血凝抑制試驗、平板凝集試驗等，所用的設備多為小型移液站、洗板機等，全流程或半自動化程度整體偏低。

移液工作站在血清學檢測中表現出很好的可靠性和穩定性。李軍等[2]用RSP 100-BEP Ⅲ自動酶免疫分析系統檢測乙肝6 項標志物，發現設備可提高酶免疫分析方法的精密度，減輕勞動強度。付杰等[3]用AddcareElisa800 全自動酶免工作站，以操作簡單、檢測快速、結果準確等優點，實現了ELISA 分析的自動化、標準化、快速化，避免了人工加樣錯誤，同時也降低了檢驗人員的感染風險。張鵬等[4]使用Freedom EVO 150 全自動酶免工作站與人工操作比較檢測養殖場的4 種禽病，確定了工作站的可靠性和穩定性。

目前，市場上的自動化工作站品目繁多（表1），各類型機器并非單一功能，用戶在熟悉使用工作站時應充分挖掘其性能。如B 品牌（以下產家均用代碼簡稱）的高通量洗板機可兼具實現用塔架完成30～50 塊硬質90 度板的快速分液，分液的最低量可達1 μL，同時兼具洗板和高精度分液的使用。雖然單塊板分液速度平均約為12 s（人工約15 s），但分液持續性和穩定性卻優于人工操作。該設備的低容量5 μL、20 μL 等分液頭因分液頭過于精細，容易造成噴口堵塞，特別是血凝/血凝抑制試驗中使用容易沉淀的紅細胞時，因此低容量分液頭對試劑有一定要求。T 品牌的高通量洗板機也可實現高達50 塊板的自動分液和洗板，但其最低分液量只有50 μL，適合ELISA 的各種分液，并不適合應用于血凝/血凝抑制試驗。如果將分液頭升級為96通道，其3 遍洗板的平均時間約為50 s，相對于8通道3 遍洗板的時間180 s，對于批量化監測工作可以大大縮短時間。相對進口產品，國產設備的優勢在反饋和模具調整及時。如深圳L 品牌的全自動微量分液器不僅能適用于標準的ELISA 板、硬質90 度V 型板，對不規則的軟質90 度V 型板也專門配備專用基座，對基層的使用更方便，在稍作改造和編程后，也能完成平板凝集試劑的快速分液（圖1）。

圖1 平板凝集實驗中檢測試劑快速分液

表1 動物疫控系統較常用血清學檢測相關設備

對于移液工作站而言，H 品牌工作站與T 品牌工作站兩者的工作原理不同。H 品牌工作站使用的為石墨槍頭，具備電容式液面探測（cLLD）功能，另有壓力式液面探測（pLLD）功能，管道中采用空氣置換原理，可監控空氣置換情況，實現通道吸放液全程監控。T 品牌工作站的電導槍頭也為石墨型，但其通過空氣傳導或液體傳導測量壓力差來感知頁面高低。H 品牌工作站能感知泡沫、液體等變化差，敏感性高，移液棒可兼具小抓手功能，相對于T 品牌工作站的專業抓手來說更節省經費，在小型工作臺上具有一定優勢。但H 品牌工作站的臺面為平面型，可使用的一般為5×5 型或5×6型平面，對需使用大量槍頭的工作來說并不方便。T 品牌工作站的臺面為立體型，除了3×3 型平面，設備的后方還可加載7 層常溫塔架、37 ℃控溫塔架或其他規格塔架，在使用鋼針的情況下，可實現不同任務的批量動物疫病ELISA 檢測。實際工作中，用戶應根據實際需求選擇所需設備（表2）。

2 移液工作站在動物疫病病原學檢測中的應用

自動移液工作站在法醫、醫院、科研部門均得到了廣泛應用。劉冰泉等[5]用Freedom EVO 150-8 型核酸提取及PCR 體系構建工作站提取血液中的DNA，稀釋2～32 倍的血樣本，采用工作站和Chelex-100 法的檢驗成功率均可達到100%；稀釋64 倍的樣本，Chelex-100 法成功率為41.3%，完整分型數為78.3%，自動化工作站成功率為13.0%，完整分型數為43.5%，兩者比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。姜先華等[6]應用Freedom EVO 150 工作站開展批量血斑STR 分型研究，發現自動化工作站批量檢測方法在成功率、穩定性、均一性等方面具有優勢。王大明等[7]使用Tecan工作站相比較于Gentra法和胍鹽酸法全血用量少，價格比較便宜，適合大批量全血樣本抽提基因組DNA，且工作站提取基因組DNA 適用于高通量HLA流式磁珠基因分型等下游的分子生物學試驗。王淼[8]用Beckman 的自動化工作站評估了不同核酸提取方法的效果，顯示全自動提取核酸處理大批量樣本，不僅省時省力，降本增效，且減少化學試劑對工作人員的影響。

動物疫病病原學監測中，常用的方法是病原核酸檢測，現有的主要操作步驟集中在核酸提取過程和擴增體系構建。傳統核酸提取方法中包含的沉淀、離心等步驟較為繁雜，費時長，實現自動化操作難度較高，且不適合大批量樣本的核酸提取；在工作過程中，人員還需直接接觸有毒的化學試劑。近年來，磁珠法核酸提取法的出現，大大優化了操作體驗。磁珠法與非磁性核酸提取方法相比較，磁珠法除了節省時間，防止人員傷害以外，最突出的優勢就是易實現自動化，防止交叉污染。國內外也制造了很多相關的自動化核酸提取儀器及配套試劑（表3），如西安天隆的GeneRotex、NP968-S和NP968-C，北京天根的TGuide S96、TGuide S32 和TGuide M16，杭州博日的GenePure Plus/Pro 和GenePure Pro 96/T，ROCHE 的Magna Pure LC，ABI 的Magmax，Qiagen 的EZ1、QIAcube和Biorobot，Thermo 的Kingfisher，Eppendorf 的epMotion 5075 等設備，減少了核酸提取過程的人工參與。與一些廠家將磁珠法和自動化工作站整合，升級為核酸提取和體系構建自動化系統以實現非人工介入的大規模樣本處理，如西安天隆的PANA9600S，Qiagen 的QIAsymphony SP/AS，Backman 的Biomeck3000、Biomeck FXNX。但目前能較好整合各類儀器設備實現全流程自動核酸提取、PCR 反應體系構建、（熒光）PCR、自動電泳的暫時只有帝肯Tecan 的EVO 系列和哈密爾頓Hamilton 的STAR 系列。

表2 動物疫病血清學檢測快速移液工作站配置方案

3 移液工作站在動物疫病檢測中的優缺點

3.1 在動物疫病檢測中的優勢

3.1.1 結果準確 自動化工作站按照設定好的程序自動進行試驗，不會出現由于人員疲勞或分神導致的錯誤。目前各類移液工作站在10 μL 容量允許誤差≤±6%，測量重復性≤3%；25 μL 容量允許誤差≤±3%，測量重復性≤1.5%；100 μL 容量允許誤差≤±2%，測量重復性≤1%。但在使用過程中也應不定期核驗數據，定期開展儀器的校準工作和設備的期間核查，減低系統誤差。

3.1.2 操作穩定 主要表現在設備運行過程完全按設定的時間和步驟進行，全程電腦控制，無需人員干預。其次是工作站需要的很多耗材和試劑是配套產品，出廠時已完成模塊化生產和預裝配，實驗室購入后不需要人員再預分裝，使用前僅需除去外包裝放入機器即可，減少了人員干預過程，降低了不穩定因素。盧婷[9]用酶免工作站與全自動化學發光免疫分析儀共同檢測HBV 血清學標志物時，發現兩者的結果一致性很好，檢測總符合率≥98%，Kappa 檢驗系數K均大于0.96。

3.1.3 運行高效 自動化工作站可完全按設定好的程序，實現無人值守工作，提高實驗室工作效率。

3.1.4 安全性高 工作站減少了人員接觸潛在感染性樣品和檢測化學試劑的風險，提高了檢測人員的安全性。

3.2 移液工作站在動物疫病檢測中的不足

3.2.1 對樣品的處理要求高 移液工作站的管道設置、移液頭、多通閥和蠕動泵等均為精密配件，如血清中的絮狀物、脂肪凝集塊等被吸入管道均會使設備停擺，甚者造成配件損毀。因此，在使用工作站時應做好樣品的前處理，放入機器前應認真檢查樣品狀態。

表3 動物疫控系統較常用核酸檢測相關設備

3.2.2 價格較為昂貴 一是小型的工作站起步價十余萬，大型工作站或聯動工作站更加高昂。二是耗材成本較高，很多工作站的耗材多為封閉式，無法開源生產，推高了使用成本。以石墨槍頭為例，其石墨導電槍頭單支價格達到1 元，遠超其他PFA 或PP 材質的移液槍頭，但也有用特殊洗液清洗固定鋼針的辦法來代替石墨槍頭開展檢測。如加拿大皇家騎警在3 年內用次氯酸溶液清洗Tecan 工作站固定鋼針的核酸提取方法對15 000 名嫌疑人DNA 進行STR 分型，未發生交叉污染[10]；北卡羅來納大學的Ditter 實驗室對癌癥相關基因研究過程中，使用清洗固定鋼針的方法進行qPCR 體系構建工作，也未發生交叉污染[11]。經次氯酸溶液處理鋼針能有效避免交叉污染，但大量次氯酸的使用則給試驗后期的環保處理增加了壓力。

3.2.3 維護有難度 工作站與操作人員需要較長時間磨合，才能實現良好的人機互動。工作站的每個操作節點均需提前設置，以Tecan 工作站為例，其移液高度、排液速度、液面感應、管道壓力選擇等均要細化，軟件編程、修改和機械臂定位需要長時間培訓，檢測實驗室如無專人進行維護則外包維護成本激增，且后期需拓展新的移液項目困難，同時聯動儀器越多的工作站維護難度及成本也就越高。

3.2.4 校準檢定困難 因操作復雜，很多移液工作站在校準時需單獨編程移液，而第三方校準服務公司因不會使用工作站而無法開展校準檢定，因此多數工作站均只能由廠家出面進行調校，這對量值溯源有要求的檢測工作有一定影響。

3.2.5 試劑損耗增加 理論上移液工作站的試劑損耗在較小范圍內，但在實際中，由于無液面探測的移液槍頭蘸取、無蓋蒸發、管道沖洗等原因，造成的試劑損耗相比手工操作會偏高，因此需要操作人員不斷優化流程，實現工作最優化。

4 工作站在動物疫病檢測中的展望

除了現有檢測工作的精細化程度不斷提升外，基層獸醫實驗室人員老化也嚴重，部分人員視力、精力跟不上日常精細檢測工作的需求，因此基層實行自動化或半自動將是獸醫實驗室今后硬件設備發展的趨勢。實現全流程自動化的需求目前在基層獸醫實驗室很難實現，但可以將部分檢測步驟自動化。目前進口設備在很多領域的技術性能仍優于國產品牌，但國產的自動/半自動移液工作站也在逐步發力。謝志豪等[12]設計的工作站滴定精度小于1 μL，定位精度≤10 μm，重復精度≤15 μm。李晶等[13]設計的200 μL 移液模塊用蒸餾水進行測試，在70～150 μL 時CV 小于0.75%，對比吸液理論數據和實測數據，驗證此移液模塊的精度符合設計和使用要求。刁保衛等[14]建立了適合于微生物實驗室以及分子分型實驗室的高通量的自動化PCR 體系配置與PCR 產物純化系統，與使用96 孔PCR 板手工操作相比，使用384 孔板利用自動液體工作站完成相同的PCR 體系配置工作，效率能夠提高2.5 倍，顯示了較好的應用前景。工作站逐步代替人工的趨勢漸漸形成，獸醫實驗室工作也正在向自動化方向發展，可以預見，自動化移液工作站將會被越來越廣泛應用于動物疫病監測工作中。在使用進口產品的同時，也應大力支持國產設備的發展，實現國產設備內外雙循環良性發展。