新疆和靜縣巴音布魯克羊新孢子蟲感染狀況橫斷面研究

艾日登才次克，馬偉，薛文，丁劍，范冰潔，賈舒安，劉平，劉亞濤

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

在我國，巴音布魯克羊主要飼養(yǎng)在新疆和靜縣、和碩縣、焉耆縣和輪臺縣，是巴音郭楞蒙古自治州的一個主要地方養(yǎng)殖品種，具有性早熟、耐粗飼、抗寒抗病能力強、適應(yīng)高海拔地區(qū)等優(yōu)點，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民主要飼養(yǎng)的肉脂兼用地方品種[1]。

新孢子蟲病（neosporosis）是犬新孢子蟲（N.caninum）寄生于犬、牛、馬、羊等多種動物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病，在全世界范圍內(nèi)流行，對母畜危害尤為嚴(yán)重，主要造成母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，以及新生仔畜的運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。新孢子蟲病可通過垂直和水平傳播方式傳播[2]。

從20 世紀(jì)80 年代末發(fā)現(xiàn)新孢子蟲病以來，有關(guān)報道主要集中于牛，涉及美國、澳大利亞、新西蘭、南非、日本等30 多個國家，流行率一般為10%～40%，最高可達(dá)82%。我國對牛新孢子蟲病的研究較多，但對羊的調(diào)查較少[3-4]。馬少麗等[5]首次對青海省絨山羊新孢子蟲病進(jìn)行了報道，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲感染率為6.44%。李宗文等[6]、陸艷等[7]對青海省改良絨山羊新孢子蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率為3.0%～12.8%。李曉卉等[8]對青海省烏蘭縣改良絨山羊群中混群生產(chǎn)的綿羊進(jìn)行了新孢子蟲檢測，發(fā)現(xiàn)新孢子蟲感染率為8.25%。楊娜等[9]應(yīng)用新孢子蟲凝集試驗（NAT），對內(nèi)蒙古地區(qū)散養(yǎng)放牧的263 份綿羊和242 份山羊血樣進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)綿羊新孢子蟲抗體陽性率為14.8%，山羊為13.6%。哈希巴特等[10]利用重組蛋白間接ELISA 方法，對新疆地區(qū)的267 份絨山羊血清進(jìn)行新孢子蟲抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率為 16.1%，陽性率高于青海省和內(nèi)蒙古地區(qū)。

上述調(diào)查多數(shù)是在2010 年以前開展的，近期的調(diào)查數(shù)據(jù)較少。為了解新疆地區(qū)最新的羊新孢子蟲病群流行率及群間傳播相關(guān)風(fēng)險因素，2021 年9 月—2022 年5 月對和靜縣巴音布魯克羊開展了新孢子蟲感染橫斷面研究，以期為該病防控提出建議。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群及研究個體

以和靜縣12 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的7 102 個羊養(yǎng)殖場戶為目標(biāo)群體，包括農(nóng)區(qū)和牧區(qū)，均為散養(yǎng)戶；以這些養(yǎng)殖場戶飼養(yǎng)的巴音布魯克羊為研究個體。

1.2 抽樣策略

1.2.1 抽樣框 將7 102個養(yǎng)殖場戶定為抽樣框，采用分階段抽樣方法，先確定抽樣場戶，再在場內(nèi)進(jìn)行個體抽樣。

1.2.2 場戶選擇 按照預(yù)估流行率方式計算理論抽樣場數(shù)（N），取95%置信度（CI）、50%群預(yù)期流行率（P）、12%可接受誤差（d），通過估計動物疾病流行率的抽樣量計算器[16]，計算得到的抽樣場戶數(shù)為67 個；根據(jù)12 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)場戶數(shù)量按比例分配，在每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)內(nèi)簡單隨機挑選抽樣場戶。抽樣場戶鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布見表1。

表1 和靜縣巴音布魯克羊存欄量和場群抽樣計劃

1.2.3 場內(nèi)個體選擇 按照發(fā)現(xiàn)疫病方式計算場內(nèi)個體采樣數(shù)（n），取95%置信度（CI）、95%試驗敏感性（Se）、15%預(yù)期流行率（p）[10]，場內(nèi)動物數(shù)定為200 只，計算得到每場需采集樣本20 份；場戶內(nèi)樣品通過簡單隨機方法抽取，共采集樣品1 340 份。

1.3 檢測方法

參照《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 3499—2013），采用新孢子蟲間接ELISA 抗體檢測盒（ID.vet）檢測。根據(jù)試劑盒生產(chǎn)公司提供的數(shù)據(jù)，該試劑盒的敏感性（Se）為95%，特異性（Sp）為100%。

1.4 病例定義

經(jīng)新孢子蟲間接ELISA 抗體試劑盒檢測為陽性的羊只為陽性個體，檢出m例及以上陽性個體的養(yǎng)殖場戶為陽性場戶。m為判定陽性場的 cut-off值，由個體流行率（p）結(jié)合試驗敏感性（Se）、特異性（Sp）和每場抽樣數(shù)量（n）確定。

1.5 風(fēng)險因素問卷設(shè)計

前期對幾家養(yǎng)殖場進(jìn)行預(yù)調(diào)查，根據(jù)實際情況和調(diào)查結(jié)果，最終確定調(diào)查問卷內(nèi)容。內(nèi)容包括養(yǎng)殖場點基本情況和可能存在的風(fēng)險因素兩部分，共15 個問題。采樣時，同步進(jìn)行問卷調(diào)查，主要由村級防疫員發(fā)放，待問卷填寫完成后和樣品一起收回。

1.6 數(shù)據(jù)分析

按公式計算場群表觀流行率（HAP）和場群真實流行率（HTP）：HAP=場群陽性數(shù)/總檢測場群數(shù)；HTP=（HAP+HSp-1）/（HSe+HSp-1）。式中，HSe 為群敏感性，HSp 為群特異性。

根據(jù)試驗敏感性（Se）、特異性（Sp）、場內(nèi)抽樣數(shù)量（n）、場內(nèi)預(yù)期流行率（p），計算HSe 和HSp[12]：HSe=1-[1-p×Se -（1-p）（1-Sp）]n；HSp=Spn；95%CI 通過Beta 分布模擬計算。計算出不同cut-off值下的HSe 和HSp 見表2。cut-off值為 1 時HSe 和HSp 均最高，因此確定經(jīng)新孢子蟲間接ELISA 抗體試劑盒檢測出1 例及以上新孢子蟲陽性個體的養(yǎng)殖場戶為陽性場（m=1），此時檢出陽性場的HSe 為91.1%，HSp 為100%。

表2 不同 cut-off值下的HSe 和HSp 單位：%

1.7 風(fēng)險因素問卷統(tǒng)計分析

以是否為新孢子蟲病陽性場為結(jié)局變量，用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。采用卡方檢驗進(jìn)行單因素分析，篩選出P＜0.20 的因素，并采用Logistic 回歸進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群流行率

抗體檢測結(jié)果（表3）顯示：共檢測了67 個場戶1 340 份羊血清樣品，檢出22 個陽性場戶、110份陽性樣品，個體表觀流行率為8.21%（95%CI：6.79%～9.81%），群表觀流行率（HAP）為32.84%（95%CI：21.85%～45.40%），群真實流行率（HTP）為36.05%（95%CI：24.93%～49.93%）。乃門莫墩鎮(zhèn)、和靜鎮(zhèn)場群陽性率較高，其次為巴潤哈爾莫墩鎮(zhèn)，以上鄉(xiāng)鎮(zhèn)均位于農(nóng)區(qū)；而克爾古提鄉(xiāng)、巴音郭愣鄉(xiāng)、巴侖臺鎮(zhèn)、鞏乃斯鎮(zhèn)沒有檢測到陽性場，這些鄉(xiāng)鎮(zhèn)均位于牧區(qū)。農(nóng)區(qū)群陽性率為59.09%（13/22），牧區(qū)為20.00%（9/45），農(nóng)區(qū)場群陽性率明顯高于牧區(qū)（P＜0.05）。

2.2 風(fēng)險因素分析

2.2.1 單因素分析 根據(jù)問卷調(diào)查結(jié)果，用IBM SPSS Statistics 25 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素分析卡方檢驗，對8 個自變量（假定風(fēng)險因素）與結(jié)局（是否為新孢子蟲陽性場）之間的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果（表4）顯示：“飼養(yǎng)方式”“建廠時間”“混群前是否隔離觀察”“圈舍是否消毒”和“養(yǎng)殖環(huán)境”具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.20）。

2.2.2 多因素分析 為了進(jìn)一步尋找可能造成新孢子蟲感染的風(fēng)險因素，剔除混雜因素，使用Logistic 回歸進(jìn)行多因素分析。Logistic 回歸分析

結(jié)果（表5）顯示，“飼養(yǎng)方式”“建廠時間”和“圈舍是否消毒”具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)Hosmer&Lemeshow 檢驗，P=0.972（＞0.05），表明Logistic 回歸模型的擬合度較好。繪制ROC曲線（圖1），曲線下面積為81.3%（95%CI：70.2%～92.4%），表明該模型預(yù)測性能尚可。

表3 不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)殖場戶檢測結(jié)果統(tǒng)計

表4 新孢子蟲病單因素風(fēng)險分析結(jié)果

表5 多因素Logistic 回歸分析結(jié)果

圖1 Logistic 回歸模型ROC 曲線

3 討論

3.1 流行率

本研究發(fā)現(xiàn)，和靜縣巴音布魯克羊新孢子蟲病群表觀流行率為32.84%（95%CI：21.85%～45.40%），群真實流行率為36.05%（95%CI：24.93%～49.93%）。過往文獻(xiàn)研究個體流行率的較多，而研究場群流行率的較少。本次檢測的個體陽性率為8.21%（95%CI：6.79%～9.81%），低于哈希巴特等[10]檢測的新疆地區(qū)絨山羊新孢子蟲陽性率16.1%，也低于楊娜等[9]檢測的內(nèi)蒙古地區(qū)散養(yǎng)半牧半舍綿羊新孢子蟲陽性率14.8%，而與李曉卉等[8]檢測的青海省綿羊陽性率8.25%近似。本次檢測的巴音布魯克羊個體陽性率雖然低于新疆絨山羊，但在12 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)中的8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢測出陽性場點，場群流行率也較高，表明新孢子蟲病流行范圍較廣，在場群中流行普遍。

3.2 風(fēng)險因素

經(jīng)卡方檢驗和二元Logistic 回歸分析得到“飼養(yǎng)方式為舍飼”“建廠時間在6 年以上”和“圈舍沒有消毒”等3 個因素具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示這些為養(yǎng)殖場感染新孢子蟲的主要風(fēng)險因素。初步分析，新孢子蟲可通過胎盤垂直傳播，也可通過攝入被新孢子蟲卵囊或包囊組織污染的食物或水而水平傳播。舍飼環(huán)境相對密封，如果對圈舍不消毒，羊群就更容易感染新孢子蟲；而半舍半牧的飼養(yǎng)方式，飼養(yǎng)季節(jié)不同，飼養(yǎng)環(huán)境就不一樣，夏天圈舍長時間空舍，太陽照射較為充分，可以殺滅新孢子蟲，從而降低新孢子蟲感染率。新孢子蟲可垂直傳播，因此建廠時間越長，新孢子蟲感染的可能性就越高。因此，規(guī)范的消毒制度可以降低新孢子蟲感染風(fēng)險。

3.3 局限性

本次研究采用橫斷面研究方法，僅代表一個時間段內(nèi)的結(jié)果，建立起的關(guān)聯(lián)性不一定有因果聯(lián)系，需進(jìn)一步研究；在調(diào)查問卷問題設(shè)定方面，因流產(chǎn)的因素眾多，且新孢子蟲病對羊群危害和風(fēng)險因素相關(guān)研究較少，設(shè)置不夠全面，有一定的局限性。

4 結(jié)論

研究表明：新孢子蟲在和靜縣巴音布魯克羊群中流行普遍，流行范圍較廣；長時間舍內(nèi)飼養(yǎng)、建廠時間久、衛(wèi)生消毒管理差是導(dǎo)致該地區(qū)新孢子蟲流行的主要風(fēng)險因素。因此，需提高養(yǎng)殖場戶飼養(yǎng)管理水平，定期對圈舍進(jìn)行消毒并保證一定的空圈時間，以降低新孢子蟲感染風(fēng)險。