煙草根際細菌YF-6的分離篩選與生測

安依凡， 曹洋， 毛文林， 何佶弦， 楊洋， 李斌

(1.西北農林科技大學植物保護學院 植物病毒/資源微生物實驗室，陜西 楊凌 712100；2.四川省煙草公司廣元市公司，四川 廣元 628017； 3.四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644000；4.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610000)

煙草赤星病是煙葉成熟期病害，1892年在美國首次發現[1]，其病原為鏈格孢菌，屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬。該屬真菌的分生孢子梗呈淡褐色至褐色，由菌絲上生出，與菌絲無明顯區別[2]，其分生孢子最適宜在煙葉表面萌發，易從葉毛基部細胞、葉緣和蟲咬傷口處侵入，有時也可從氣孔侵入[3]。

微生物拮抗作用是指一種微生物在其生命過程中，通過產生某些代謝產物而改變其他微生物的生存環境，從而使其他微生物的生長受到抑制，甚至致死的現象[4]。煙草赤星病孢子主要靠風傳播，對于用微生物菌劑防止煙草赤星病菌侵染，需要配合劑型為可噴霧水劑的葉面噴霧拮抗菌劑來阻擋病菌侵染。

一般來講，在植物根系分泌物中，微生物的營養物質對有益菌和病菌都有吸引作用。利用微生物抑制病菌生長的一個思路是，首先找到植物根系分泌物中營養物質所吸引的有益菌，比如某些芽孢桿菌，然后將其培養為數量占優的頭領微生物[5]，再利用與植物和諧生長的該芽孢桿菌的殺菌和占位效應來抑制病菌。王麗珍[6]從重慶市煙區煙草根際土壤中篩選出抗赤星病的生防菌巨大芽孢桿菌B-43-6；李安娜等[7]從山東煙田煙草根際和根圍土壤中篩選出抗赤星病的芽孢桿菌B102；張芬芬等[8]從甜羅勒根際篩選出對煙草赤星病菌具有抑制作用的枯草芽孢桿菌LL-16；王靜等[9]從煙草根際土壤中篩選出抗赤星病的生防菌[10]短小芽孢桿菌AR03。本研究進行了拮抗赤星病菌的煙草根際細菌篩選，旨在判斷拮抗細菌YF-6是否具有研發煙草赤星病生防可噴霧水劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年8月，在陜西省漢中市南鄭縣新集鎮煙區和四川省廣元市劍閣縣普安鎮煙區采集健壯煙株根際土壤樣本。供試菌株有煙草赤星(Alternariaalternata)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、蘋果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花枯萎(Fusariumoxysporum)、玉米大斑(Exserohilumturcicum)、枯草芽孢桿菌1號(Bacillussubtilis1)，均由西北農林科技大學植物病毒和資源微生物試驗室保存和提供，采用LB(luria-bertani)培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基。

1.2 方法

1.2.1 根際細菌的分離與菌株制作

土樣采集。找到長勢旺盛、無病蟲害的煙草植株，從莖稈底部由中心向四周刨開土壤，使根系露出，收集根系周圍小顆粒的土壤，剪下部分根系，將土壤和根系裝入自封袋中。

根際細菌的分離。稱取土壤樣本10 g，倒入裝有90 mL無菌水的錐形瓶中[11]，于200 r·min-1振蕩20 min[12]，60 ℃水浴30 min，制成1∶10的土壤稀釋液，用移液槍吸取1 mL，加入9 mL無菌水充分振蕩，制成1∶102的土壤稀釋液。依此類推，分別制成1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀釋液。每個濃度的土壤稀釋液搖勻后用移液槍移取250 μL至LB平板上，用玻璃涂布器畫圈涂勻封口，在26 ℃恒溫箱中培養4 d。

挑取形態、顏色等特征不同的菌落畫線于提前制作好的LB斜面，每個不同的菌落畫線3個斜面，編號后在26 ℃恒溫箱中培養3 d，待細菌沿斜面畫線完全生長，即完成菌株制作。

1.2.2 從根際細菌中篩選拮抗細菌

初篩。接種煙草赤星病菌至PDA平板，待其長滿后，用5 mm打孔器打孔，將菌餅移到對峙用PDA平板中央。對分離到的細菌按編號順序，每3個菌依次接種在距離病菌3 cm的3個對角上，另1個對角作為空白對照，重復2組。于26 ℃恒溫箱中培養5 d，根據抑菌帶寬度確定拮抗程度，選取拮抗效果好的菌株，視為拮抗細菌。

復篩。將5 mm煙草赤星病菌的菌餅接種至PDA平板中央，對初篩選擇的拮抗細菌，單菌接種在距離病菌3 cm的兩點最遠的對稱位置，重復2組。26 ℃恒溫培養箱中培養12 d，測量5 d樣本和12 d樣本的對峙試驗數據[13]。篩選效果最好的1株拮抗細菌，對其12 d樣本進行顯微鏡觀察，觀察靠近抑菌圈邊緣的病菌菌絲的生長情況，以遠離抑菌圈的病菌菌絲為對照。

1.2.3 拮抗細菌的觀察與鑒定

制作YF-6 LB培養液，梯度稀釋找到YF-6菌落，并觀察其形態。挑取少量YF-6菌株，分置于盛有100、500 μL無菌水的離心管內，振蕩均勻，吸取2.5 μL涂于蓋玻片上，制作高濃度(100 μL)和低濃度(500 μL)蓋玻片樣本，在電鏡下對YF-6進行觀察，并送第三方進行菌種鑒定。

1.2.4 拮抗細菌的生測試驗

施用對象為延安1號溫室煙苗，設為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四組，每組4株煙苗，保證所選16株煙苗大小接近。YF-6的10倍稀釋LB培養液(9×106mL-1)施用于Ⅰ組煙苗；YF-6的50倍稀釋LB培養液(1.8×106mL-1)施用于Ⅱ組煙苗；LB 50倍稀釋液施用于Ⅲ組煙苗；無菌水施用于Ⅳ組煙苗。

先進行煙苗灌根試驗，施用品施用量為每棵煙苗50 mL，灌根后觀察煙苗11 d。若灌根對煙苗無害，則重復試驗設置，對煙苗進行葉噴試驗，3 d后重復葉噴，繼續觀察煙苗生長情況。若葉噴也對煙苗無害，則將煙草赤星病菌培養液等量噴淋于4組煙苗葉面上，以噴淋后7 d時間為觀察截點，評價YF-6的防病效果。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌YF-6

從11份煙草根際土壤樣本中分離得到81種形態根際細菌，制作共計243支菌株斜面。初篩得到9株對煙草赤星病菌有拮抗效果的根際細菌。復篩得到1株拮抗效果最好的根際細菌YF-6。

比較對峙試驗中赤星病菌的生長參數篩選根際細菌。在表1中，5 d抑菌直徑(對峙5 d病菌生長的最大長度減去最小長度)反映拮抗細菌的殺菌能力，12 d邊沿遠端距離(對峙12 d病菌生長邊沿端點之間的直線距離)反映拮抗細菌的占位能力，12 d最小寬度(對峙12 d病菌生長的最小長度)反映病菌活性。光學顯微鏡下觀察(圖1、2)，在對峙試驗中，細菌YF-6使煙草赤星病菌菌絲顏色加深，膨大變粗，且分支增多。

表1 有效菌株與參照菌株的復篩試驗數據

圖1 YF-6細菌培養5 d(左)和12 d(右)復篩樣本

圖2 12 d樣本中對峙最近處(左)和對峙最遠處(右)的煙草赤星病菌菌絲形態

2.2 YF-6的抑菌譜

圖3顯示，YF-6對辣椒疫霉病菌、蘋果炭疽病菌、棉花枯萎病菌、玉米大斑病菌均有良好的抑菌效果，YF-6具有抑菌廣譜性。

圖3 YF-6的抑菌譜

2.3 YF-6的形態

圖4顯示，YF-6菌落外圍呈淡黃色，邊沿處呈放射鋸齒狀生長，菌落中心呈奶白色，有兩圈輪紋凸起，大輪紋外密集分布細小白色顆粒，挑起時有黏稠感。電鏡下，YF-6單菌長1.3～1.5 μm，寬0.5～0.6 μm，呈近似桿狀的橢圓形，菌體一端較明亮，偶有尖銳突出，兩側有褶皺，中部有縱向隆起。經青島正信檢測分析有限公司鑒定，YF-6為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖4 YF-6菌落和電鏡照片

2.4 生測試驗

圖5顯示，Ⅰ、Ⅱ組的溫室煙苗葉片深綠，有生長，未見煙草赤星病菌侵染；Ⅲ組和無菌水的溫室煙苗出現煙草赤星病菌侵染。

圖5 YF-6不同培養液的侵染情況

Ⅰ組的促生效果體現在以下3個指標。Ⅰ組株高平均為14.2 mm，Ⅳ組平均為13.8 mm，Ⅰ組大于Ⅳ組3.1%；Ⅰ組最大葉長平均為14.2 mm，Ⅳ組平均為12.8 mm，Ⅰ組高于Ⅳ組10.6%；Ⅰ組最大葉展寬度平均為23.6 mm，Ⅳ組平均為20.7 mm，Ⅰ組大于Ⅳ組14.1%(表2)。

表2 YF-6 10倍稀釋培養液對延安1號溫室煙苗促生效果數據

3 小結與討論

本研究從采自四川、陜西的煙草根際土壤樣本中分離得到81種形態、243株根際細菌，對峙篩選出1株拮抗煙草赤星病菌效果最好的細菌YF-6，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。生測試驗表明，YF-6 10倍稀釋培養液(9×106mL-1)可以防止煙草赤星病菌侵染，且對延安1號溫室煙苗有促進生長的作用。

煙草赤星病是一類嚴重影響煙草生產的病害，煙草赤星病的防治可以分為農業防治、抗性品種選擇、化學藥劑防治、生物防治[14]。依靠拮抗細菌防治煙草赤星病是煙草植保研究的一個方向[15]，芽孢桿菌因具有產芽孢、抗逆性強、容易在環境中存活與增殖的特點，現已成為研發煙草赤星病生防菌劑的對象[16]。試驗證明，本研究得到的煙草根際細菌解淀粉芽孢桿菌YF-6拮抗煙草赤星病菌，且具有研發成為預防煙草赤星病可噴霧水劑的潛力。