響應面法優化酶輔助超聲提取藍莓花青素工藝研究

馬全民， 劉王梅， 聶復禮， 張堯， 汪娟

(1.浙江惠松制藥有限公司，浙江 杭州 310000； 2.浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州 310023)

藍莓是一種甜味多汁、營養健康的深藍色漿果，具有抗氧化、抗癌、保護肝臟、調節腸道菌群、緩解視覺疲勞等多種功效，是世界糧農組織推薦的5種健康水果之一，被譽為“水果皇后”[1-2]。藍莓富含酚酸、木質素、單寧等酚類化合物和花青素、黃烷醇等黃酮類化合物，其中花青素含量在所有水果和蔬菜中最高[3]。花青素是一種廣泛存在于植物中的天然色素，由牽牛花色素、錦葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥色素等花青素苷元及這些苷元與乙酰阿拉伯糖、半乳糖、乙酰葡萄糖、葡萄糖、阿拉伯糖連接所形成的花青素糖苷組成[4]。花青素因其具有清除自由基、抗氧化應激、抗炎癥、抗輻射、保護視網膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等多種功能而備受關注[5]。將藍莓中花青素提取出來作為膳食補充劑，不僅可以充分利用其生理功能，而且可以解決藍莓不耐貯藏、易腐爛等問題，提高藍莓的商品價值。因此，藍莓花青素的提取和制備工藝受到研究人員的關注。

超聲輔助提取法是利用超聲波振動帶來的空化效應，強大的壓力使植物細胞壁瞬間破裂，從而促進胞內活性物的溶出[6]。超聲和酶的聯合使用結合了超聲提取和酶法提取的優點，提取時間短、效率高，且能保持提取物的活性，已被廣泛用于提取活性物質[7]。本研究以藍莓為對象，采用Plackett-Burman(篩選試驗)設計法、最陡爬坡路徑法和Box-Behnken(盒狀試驗)設計中的響應面分析法，對酶輔助超聲提取藍莓花青素工藝參數進行優化。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藍莓原料購自本地農貿市場，-20 ℃冷凍保存。果膠酶和纖維素酶購自南寧龐博生物工程有限公司。矢車菊素-3-O-葡萄糖購自上海百靈威，其他試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器與設備：榨汁機，九陽股份有限公司出品；BAS224S電子天平和PB-10精密pH計，德國Sartorius出品；Primor高速離心機和MK3酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司出品；FreeZone2.5L冷凍干燥儀，美國Labconco出品。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

藍莓用榨汁機打漿，分別精確稱取藍莓果漿10 g于燒杯中，采用超聲法，以酸水溶液為溶劑，分別考察酶種類(果膠酶、纖維素酶、混合酶、無酶)，超聲溫度(20、30、40、50、60 ℃)，酶量(0.33、0.67、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·g-1)，超聲時間(5、10、15、20、25 min)，料液比(0.20、0.25、0.33、0.50、1.00 g·mL-1)，pH(0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)等對花青素提取的影響，加入無水乙醇至相應的乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%)，繼續超聲攪拌10 min，提取液在4 500 r·min-1條件下離心10 min。過濾，濾液定容到50 mL，通過pH示差法測定花青素含量。

1.2.2 響應面優化

在單因素試驗基礎上，通過Minitab軟件的顯著因素篩選，按照3因素3水平進行Box-Behnken中心試驗設計。

1.2.3 花青素含量測定

以矢車菊素-3-O-葡萄糖為標準品，通過pH示差法測定花青素含量[8]。

2 結果與分析

2.1 單因素影響

2.1.1 酶種類

花青素主要存在于藍莓果皮之中，簡單的溶劑提取很難將花青素完全提取出來，而酶會降解藍莓果皮的細胞壁，使細胞中的花青素成分迅速擴散到溶液中, 從而有效提高藍莓花青素的提取率[9]。圖1顯示，與無酶處理相比，酶解法明顯提高了花青素的含量，其中，果膠酶效果最好，纖維素酶次之，混合酶(果膠酶∶纖維素酶1∶1)效果最差。

混合酶為果膠酶∶纖維素酶1∶1。

2.1.2 酶量

以果膠酶進行藍莓花青素提取，研究酶量對花青素含量的影響，結果如圖2所示。從圖中可知，花青素含量呈現出先增后降的變化趨勢，因此，選擇3.00 mg·g-1的酶量進行下一步試驗。

圖2 酶量對藍莓花青素含量的影響

2.1.3 超聲溫度

超聲溫度對花青素穩定性、提取率及果膠酶活性都有影響。本研究考察了不同溫度對藍莓花青素含量的影響(圖3)，結果表明，藍莓花青素的含量隨溫度的降低而增加，說明在酶解和超聲輔助提取時，20 ℃即可有效提取花青素。研究[6,10]表明，長時間處在熱溶劑中，容易造成花青素等活性成分降解和生理活性降低，超聲波輔助提取實現了低溫條件下活性物的提取，是一種非常有效的提取方法。

圖3 超聲溫度對藍莓花青素含量的影響

2.1.4 料液比

考察了料液比對藍莓花青素含量的影響，結果如圖4所示。隨著料液比降低，花青素含量呈現出先增后降的趨勢，料液比0.50 g·mL-1時含量最高。

圖4 料液比對藍莓花青素含量的影響

2.1.5 超聲時間

在超聲過程中，超聲波會產生一定的空化效應和熱效應，使細胞壁更快破碎，加快花青素的釋放和溶解，從而提高花青素的提取率。但如果提取時間過長，花青素的結構也會發生一定程度的變化，導致提取率降低[11]。本研究考察了超聲提取時間對藍莓花青素含量的影響(圖5)，隨著超聲時間的增加，藍莓花青素的含量逐漸降低，這可能是因為當超聲時間過長時，花青素的結構因為超聲而發生改變，從而降低了花青素含量。超聲提取時間5 min時含量最高。

圖5 超聲時間對藍莓花青素含量的影響

2.1.6 pH

花青素在中性和弱堿性溶液中不穩定，在pH大于6的堿性環境中易降解，生成活性較低的酚類和醛類，而在酸性條件下穩定性較好[12]。同時，酸性溶劑能破壞植物細胞膜，使水溶性色素更好地溶解，有利于花青素的提取。圖6結果表明，隨著pH的增加，藍莓花青素含量呈先升高后降低的趨勢，在pH 0.5時藍莓花青素含量達最高點，因此，以pH 0.5進行后續試驗。

圖6 pH對藍莓花青素含量的影響

2.1.7 乙醇體積分數

藍莓花青素是水溶性黃酮，常用的提取溶劑為酸化乙醇、甲醇、丙酮等強極性溶劑或它們的混合溶劑[13]。圖7表明，隨著乙醇體積分數的提高，藍莓花青素含量呈先升高后降低的趨勢，含量最高點在乙醇體積分數50%處，此后隨著乙醇體積分數增加，花青素提取率逐漸降低，因此，以乙醇體積分數50%進行后續試驗。

圖7 乙醇體積分數對藍莓花青素含量的影響

2.2 響應面優化

2.2.1 Plackett-Burman設計確定顯著影響因素

根據單因素試驗確定藍莓花青素提取的初步條件：使用果膠酶，pH(A因素)0.5，超聲溫度(B因素)20 ℃，超聲時間(C因素)5 min，乙醇體積分數(D因素)50%，料液比(E因素)0.5 g·mL-1，酶量(F因素)3.0 mg·g-1。為確定顯著影響因素，選用12個處理組合的Plackett-Burman設計，來考察A、B、C、D、E、F因素-1、1水平對花青素含量的影響，結果如表1所示。

應用Minitab軟件對表1數據進行分析、擬合，結果模型的F值為6.10，表明模型的擬合顯著性好，具有統計學意義。根據各因素P值(表2)確定對藍莓花青素提取率的顯著影響因素為pH、料液比和酶量。

表1 Plackett-Burman試驗設計及響應值

2.2.2 最陡爬坡試驗確定因素水平

通過Plackett-Burman試驗得出影響藍莓花青素含量的顯著因素后，需要通過響應面法優化提取工藝參數。根據表2中A、E、F因素的系數項效應可知，pH、料液比為負效應，在設計試驗方案時應當依次減小；酶量為正效應，在設計試驗方案時應當依次增大。最陡爬坡試驗結果如表3所示，隨著pH、料液比的不斷減小和酶量的不斷增加，藍莓花青素含量呈先增大后減小的趨勢。當pH為0.3，料液比0.3 g·mL-1，酶量為4.33 mg·g-1時，花青素含量達到最大值(0.506 mg·g-1)。因此，以處理組合8作為中心值進行后續的響應面試驗。

表2 Plackett-Burman試驗各因素效應

表3 最陡爬坡路徑試驗設計及響應值

2.2.3 響應面設計結果

通過最陡爬坡路徑法確定3個顯著影響因子之后，以pH為0.3，料液比為0.3 g·mL-1，酶量為4.33 mg·g-1作為試驗中的中心點進行響應面設計，優化藍莓花青素提取工藝。其中，Box-Behnken設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken設計及響應值

應用Minitab軟件對數據進行分析、擬合，結果二次模型多元相關性系數R2=97.14%，表明僅有2.86%的變異不能由此模型解釋。回歸模型的F值為26.45，表明模型的擬合顯著性好，具有統計學意義。失擬因素的F值為0.31，表明失擬不顯著，即可用該回歸方程代替試驗真實點，對試驗結果進行分析。

對試驗模型進行二階回歸模擬，得到回歸方程：花青素含量=-4.584 81-2.125 39A+3.087 21F-5.490 75E+0.784 09AF-5.25AE+2.413 64FE-0.233 25A2-0.480 56F2-7.715 75E2。

此外，從回歸方程的方差分析可以看出，料液比的一次項影響極顯著(F=40.58**)，pH、酶量的一次項影響不顯著。這表明料液比對花青素含量有較大影響；pH、酶量的變化對花青素含量也有影響，但相對料液比而言并不顯著。模型的響應面圖及其等高線圖如圖8所示。

圖8 Box-Behnken設計藍莓花青素提取的響應面

2.2.4 驗證試驗

由軟件分析可知，pH 0.5、酶量4.13 mg·g-1、料液比0.15 g·mL-1時預測花青素含量最大，為0.578 mg·g-1。

為證實模型預測結果的可靠性，在該條件下進行重復試驗，實際檢測花青素含量為0.606 mg·g-1，與理論值相比，相對偏差為4.84%，重復試驗結果說明，可利用回歸方程對提取結果進行預測。

3 小結

本研究通過單因素試驗，分析各因素對藍莓花青素含量的影響；在此基礎上，通過Plackett-Burman設計確定影響藍莓花青素含量的3個顯著因素(pH、料液比和酶量)，通過最陡爬坡試驗得出3個因子的最大響應值區域；最后，通過Box-Behnken設計的響應面得出最優提取工藝：使用果膠酶，提取液pH 0.5，超聲溫度20 ℃，超聲時間5 min，乙醇體積分數50%，料液比0.15 g·mL-1，酶量4.13 mg·g-1。

在最優提取工藝條件下，實際測得花青素含量為0.606 mg·g-1，優化結果與實際提取結果相對偏差為4.84%。