基于數據挖掘和網絡藥理學探討中藥外治治療乳腺癌相關淋巴水腫的用藥規律及機制*

陳筱筱，吳雪卿，邵士珺，瞿文超，陳瑋黎，萬 華

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200120；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200080）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，根據世界衛生組織國際癌癥研究機構的統計數據顯示，2020年乳腺癌發病人數首次超過肺癌，成為全球最常見癌癥。而在乳腺癌治療過程中，約20%的患者都會出現淋巴水腫，常見的主觀臨床癥狀是腫脹、麻木、沉重、緊繃、僵硬、協調性和活動度降低、肢體疲勞或虛弱，影響患者正常肢體運動，日常功能受損，從而大大降低生活質量并且影響患者的身心健康[1-2]。此外，淋巴水腫的程度不一，國際淋巴學會將其分為3個階段[3]。關于乳腺癌相關淋巴水腫（breast cancer-related lymphedema，BCRL）的病因，現在國內外研究者多認為與淋巴管堵塞及間質蛋白積聚、間質功能失調相關。目前治療方式主要包括引流、壓迫、功能運動及手術治療，但是在選擇最佳的治療方式上仍存在挑戰[4]，綜合減充血療法仍然是目前公認的一線治療，但是療效很大程度取決于患者的依從性[5]。

研究[6-8]顯示中藥外治在BCRL中療效佳，單獨應用抑或聯合中藥外治均能達到提高療效的作用，但因為中醫各家學術思想的差異，中藥外治方多樣且復雜，缺乏相應的機制研究。因此，本研究從乳腺癌相關淋巴水腫出發，通過數據挖掘等相關手段，挖掘文獻中既往報道有效的中藥外治方，并對篩選出的核心藥物進行可能機制的分析及分子靶點研究。

1 資料與方法

1.1 檢索方法以“中醫外治”“中藥外治”“中藥外敷”“中藥敷貼”“中藥貼敷”“乳腺癌淋巴水腫”“乳腺癌上肢水腫”“乳腺惡性腫瘤淋巴水腫”“乳腺惡性腫瘤上肢水腫”為檢索詞，各檢索詞之間自由組合，在中國知網、萬方及維普數據庫中進行檢索，檢索時間為建庫到2021年11月1日。

1.2 文獻篩選標準

1.2.1 納入標準 符合乳腺癌相關淋巴水腫診斷的臨床研究、案例報道等；中藥外治療效確切或中藥外治聯合用藥組優于非聯合用藥組的文獻。

1.2.2 排除標準 缺乏具體藥物組成或藥物組成未列舉完全的文獻；重復發表文獻；動物實驗、綜述類文獻。

1.3 中藥名稱規范中藥名稱的規范以2020年版《中華人民共和國藥典》[9]為準，并參考《中華本草》[10]、《本草綱目》[11]。如：“元胡”規范為“延胡索”，“白芥子”規范為“芥子”。并采用古今醫案云平臺中數據標準化對中藥名稱進行標準化處理，對于無法進行標準化的名稱進行手動修改。

1.4 研究方法

1.4.1 核心藥物篩選及用藥規律分析 應用古今醫案云平臺V2.3.5的數據挖掘模塊進行中藥頻數、中藥屬性（包括四氣五味及歸經）分析、關聯分析、聚類分析。并采用Cytospace 3.8.0軟件進行藥物共現網絡可視化分析，篩選核心藥物，對文獻中中藥外治治療乳腺癌相關淋巴水腫的用藥規律進行分析。

1.4.2 中藥成分靶點及疾病靶點篩選 首先通過（Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP）平臺篩選核心藥物的化學成分和相應靶點，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，并通過Uniprot數據庫進行靶點的轉換。在GeneCards基因數據庫中搜索關鍵詞為“Breast cancer-related lymphedema”相關的靶基因，通過在線維恩圖工具（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選兩者交集基因。

1.4.3 藥物成分-靶點網絡構建及可視化 選擇藥物及疾病的交集靶點，并篩選出藥物之間相同的成分用相應字母標識，將生成的Excel表格導入Cytospace 3.8.0軟件構建藥物成分-靶點網絡并進行可視化分析，展示藥物成分和靶點間的關系。

1.4.4 基于Bisogenet的PPI網絡構建和篩選 借助Cytospace中的Bisogenet插件分別構建乳腺癌相關淋巴水腫靶點和核心藥物靶點的蛋白質互作網絡（protein-protein interaction,PPI），并通過Merge功能合并兩者的網絡，應用CytoNCA插件計算合并網絡的相關參數并進行PPI網絡篩選，篩選條件為：2倍的degree、Betweenness以及Closeness中位數。

1.4.5 GO富集分析和KEGG通路分析 將交集基因上傳至Metascape平臺（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進行GO富集分析和KEGG富集分析，并通過微生信在線繪制氣泡圖和GO富集分析圖。

1.4.6 分子對接 結合Degree值和通路富集分析篩選出核心靶點ESR1和TP53，并選取主要有效成分。檢索RCSB PDB和Pub Chem數據庫，得到靶點與成分的化學及三維結構，并通過Pymol軟件和AutoDockTools進行對接。

2 結 果

2.1 文獻檢索結果根據納入標準、排除標準，最后納入文獻48篇，合計48首中藥外治方，共143味中藥。具體文獻篩選情況見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 中藥頻數、功效統計對48首方劑的中藥頻數進行統計分析，總計143味中藥。排名前5的中藥分別為紅花、桂枝、黃芪、雞血藤、當歸，頻數均大于10。其中紅花的頻數最高，使用頻率占所有處方的41.67%（20/48）。排名前20的中藥頻數情況見表1。然后進一步對中藥的功效進行統計分析，納入的中藥外治方頻數前3的功效分別是利水消腫、調經止痛及散瘀止痛，排名前10的中藥功效情況見圖2。

表1 中藥頻數表（前20位）

圖2 中藥功效分布情況餅圖（前10位）

2.3 中藥四氣五味及歸經統計分析對143味中藥的四氣五味進行統計分析，結果顯示中藥以溫性頻數最高，其次則為平性和寒性。中藥五味包括辛、苦、甘、咸、微苦、淡、酸、微甘、澀，其中辛味頻數最高。對中藥歸經進行統計分析，發現主要以肝經、脾經、肺經為主。（見圖3～5）

圖3 中藥四氣雷達圖

圖4 中藥五味雷達圖

圖5 中藥歸經雷達圖

2.4 中藥配伍分析設置置信度≥0.8，支持度≥0.1，對48首外治中藥方進行配伍關聯分析，最后得到關聯數據24條。（見表2）

表2 中藥配伍表

2.5 聚類分析對48首方劑頻數排名前20的藥物進行聚類分析，設置距離類型為歐氏距離，聚類方法為最長距離法。根據距離≥3.5，可將藥物分為3組。第一組：黃芪、桑枝、紅花、桂枝、雞血藤；第二組：芒硝、細辛、乳香、芥子、吳茱萸、紫蘇子、萊菔子；第三組：澤瀉、川芎、甘草、當歸、冰片、威靈仙、艾葉和伸筋草。（見圖6）

圖6 治療BCRL的高頻藥物系統聚類圖

2.6 核心藥物共表達網絡分析運用Cytospace 3.8.0軟件對所有中藥進行共表達網絡分析，并篩選出核心藥物28個。圓圈大小表示Degree值大小，圓圈越大代表與該藥物有作用關系的藥物越多，連線的粗細表示藥物之間連接的強弱程度。最終得出28味核心藥物，其中紅花、桂枝、黃芪、雞血藤為核心藥物。（見圖7）

圖7 治療BCRL核心藥物的共現網絡圖

2.7 核心藥物有效成分、靶點及疾病靶點借助TCMSP平臺根據篩選條件，最后分別得出核心藥物的有效成分，其中雞血藤15個、黃芪12個、紅花13個、桂枝6個，并通過有效成分找出對應靶點，經過Uniprot轉換、去重后得到核心藥物的靶點251個。在GeneCards數據庫中共檢索到BCRL靶基因509個，與核心藥物靶基因取交集，最后得到交集靶點60個。

2.8 藥物成分-靶點網絡構建及分析應用Cytospace 3.8.0構建核心藥物成分-靶點的網絡，其中“GZ”代表桂枝，“HQ”代表黃芪，“JJT”代表雞血藤，“HH”代表紅花，“GZ1”代表桂枝的有效成分，以此類推。4個藥物之間的共有成分則用大寫字母表示，“A1”“A2”分別表示雞血藤和黃芪的共有成分，“B1”表示雞血藤和桂枝的共有成分，“C1”是雞血藤、紅花、桂枝的共有成分，“D1”是雞血藤和紅花的共有成分，“E1”“E2”則分別是紅花和黃芪的共有成分，各成分詳見表3，成分-靶點網絡見圖8。

表3 圖8各成分描述

圖8 紅花-雞血藤-黃芪-桂枝的成分-靶點網絡

2.9 PPI網絡構建及篩選通過GeneCards數據庫共獲得BCRL靶基因509個，分別將核心藥物251個靶基因和疾病靶基因導入Cytospace 3.8.0構建藥物和疾病的PPI網絡，通過Merge功能得到一個由4 251個節點和106 108條邊構成的網絡，并通過Degree、Betweenness及Closeness 3個參數的2倍中位數進一步篩選，最后得到由64個節點和1 060條邊組成的核心網絡，并根據Degree值顯示形狀的大小。結果發現Degree值排名前5的蛋白所對應的基因名分別為NTRK1、TP53、ESR1、CUL3、MCM2，為后續分子對接蛋白篩選提供借鑒。（見圖9）

圖9 雞血藤-紅花-黃芪-桂枝和BCRL疾病靶點的PPI網絡篩選圖

2.10 GO富集分析和KEGG通路分析在Metascape數據庫中導入交集靶點進行GO富集分析及KEGG通路分析，其中分子功能共84條，生物過程共1 446條，細胞組分共33條，共得到KEGG通路245個。排名前10的生物過程主要包括對無機物、脂多糖、細菌來源分子、上皮細胞增殖等反應，細胞組分包括膜筏、膜微區、線粒體外膜、Bcl-2家族蛋白復合物等，分子功能主要涉及細胞因子受體結合、蛋白域特異性結合、磷酸酶結合、轉錄因子結合、核受體活性等。根據P值篩選排名前10的信號通路，包括癌癥的途徑、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、麻疹、丙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路、Jak-STAT信號通路。（見圖10～11）

圖10 雞血藤-紅花-黃芪-桂枝治療BCRL靶點GO分析圖（排名前10）

圖11 雞血藤-紅花-黃芪-桂枝治療BCRL的KEGG通路分析氣泡圖（排名前10）

2.11 藥物核心成分和疾病關鍵靶點的分子對接根據PPI網絡中得出的Degree值結合通路篩選出關鍵靶點TP53和ESR1，并分別與核心藥物的關鍵成分山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇進行分子對接。結果顯示6對分子的結合能均＜-6.0kcal/mol，表示配體分子和受體蛋白結合活性較好。β-谷甾醇與活性位點附近的ASN-439氨基酸形成氫鍵結合到ESR1，與活性位點附近的SER-166氨基酸形成氫鍵結合到TP53；山奈酚、槲皮素與活性位點附近的SER-456、GLU-385、ARG-515、LEU-511、THR-483、LEU-479這6個氨基酸形成氫鍵結合到ESR1；山奈酚與活性位點附近的PRO-222、HIS-233、GLU-198這3個氨基酸形成氫鍵結合到TP53；槲皮素與活性位點附近的GLU-224、PRO-222、HIS-233、GLU-198這4個氨基酸形成氫鍵結合到TP53。（見圖12）

圖12 分子對接模式圖

3 討 論

BCRL在中醫學中屬于“水腫”范疇。《素問·至真要大論篇》中記載“諸濕腫滿，皆屬于脾”，故后世醫家多從健脾利水著手治療。張微微等[12]則自擬溫陽利水方進行治療。《景岳全書·腫脹》就曾記載“凡水腫等癥，乃肺脾腎三臟相干之病。蓋水為至陰，故其本在腎”，強調治腫以腎陽為根本。另外活血化瘀、益氣養陰亦為本病的治法。中醫外治日漸應用于BCRL的治療中，研究[13-17]顯示中藥敷貼、熏蒸、熱敷等中藥外治法治療本病療效顯著。然而各家用藥多樣，對于藥物的選擇缺乏統一的認識。

淋巴系統由與心血管系統互補的復雜血管和器官網絡組成，它在幾個生物學事件中起著至關重要的作用，包括免疫反應和間質液體、細胞、分子和組織碎片的動態平衡[18]。盡管有很多研究從基因和分子水平探討了BCRL的形成機制，但在分子機制方面的研究仍存在挑戰。本研究從分子通路水平探討核心外治中藥治療乳腺癌相關淋巴水腫的療效機制。

3.1 從中藥頻數分析用藥規律143味中藥中高頻藥物包括紅花、桂枝、黃芪、雞血藤、當歸、芒硝、紫蘇子、細辛、吳茱萸、川芎、桑枝、萊菔子、威靈仙。紅花、雞血藤、當歸、川芎活血通經，桂枝、黃芪溫陽益氣，芒硝、紫蘇子、萊菔子利水消腫，細辛、吳茱萸溫陽止痛，桑枝通經止痛。“治水即以治血，治血即以治水。”故活血可以利水，補血可以利水。故中藥處方中以活血通經的紅花頻數最高。乳腺癌患者經過手術或化療治療后氣血虧虛，氣虛無法推動血行，則導致氣滯血瘀，水濕停聚，故出現肢體腫脹，沉重。將活血和利水貫穿于治療始末，方能事半功倍。頻數僅次于紅花的藥物是桂枝，桂枝具有溫通經脈、助陽化氣之功，少佐桂枝可達到溫化水濕之效。“氣行則血行”，黃芪通過益氣達到活血通經的作用，行氣利水，通利水濕，使腫脹自去。

3.2 從四氣五味及歸經分析用藥規律中藥外治方中溫、平、寒性藥物居多，而其中溫性藥物占比最高。溫性藥具有溫通經脈、通經散寒之功。藥味則以辛、苦、甘為主。辛味能散能行，具有行氣活血的作用；苦味能泄能燥，具有燥濕軟堅的作用。而藥物歸經則以肝經頻數最高。肝主疏泄，可調暢三焦的氣機，從而促進水液代謝。

3.3 從中藥配伍分析用藥規律分析中藥的配伍對于指導臨床選用藥物具有一定意義。本研究分析了中藥外治方的配伍情況，常用的配伍包括雞血藤-紅花、雞血藤-桂枝、吳茱萸-紫蘇子、紫蘇子-萊菔子等。雞血藤是補血活血要藥，《飲片新參》記載其能“去瘀血，生新血，流利經脈。”現代藥理學表明[19]，雞血藤可以促進紅細胞的生成，提高血紅蛋白的含量。而紅花的活血能力較強，主要取其活血化瘀之效，因此紅花和雞血藤相須為用，共奏補血活血之功，補而不滯。桂枝外用可溫陽通脈、化氣行水[20]，桂枝和雞血藤聯用可加強通利血脈之功。其他幾組配伍，取散寒止痛的吳茱萸和降氣化痰的紫蘇子。萊菔子和紫蘇子則來自三子養親湯，行氣化飲。

3.4 從聚類分析分析用藥規律通過對頻數前20的中藥進行聚類分析，以組為單位找到文獻中外用藥的配伍情況，可為用藥提供參考。第一組：黃芪、桑枝、紅花、桂枝、雞血藤。紅花、雞血藤活血補血，桂枝溫通經脈，桑枝通經絡行水氣，從而達到消腫之用，佐以黃芪補氣利水。第二組：細辛、乳香、芥子、吳茱萸、紫蘇子、萊菔子。該組方主要為三子養親湯加減用藥，三子養親湯主要用于痰濁壅盛，加上吳茱萸散寒止痛，細辛化飲止痛，乳香消腫通經，共同起到消腫通經的作用。第三組：澤瀉、川芎、甘草、當歸、冰片、威靈仙、艾葉、伸筋草。當歸補血活血，川芎行氣活血，威靈仙和伸筋草共奏舒筋活絡之效，艾葉、冰片止痛，甘草緩急止痛。

3.5 共表達網絡分析用藥規律為了更加直觀分析藥物之間的相關性，通過構建共表達網絡分析尋找核心藥物并分析其相互作用。本研究應用Cytospace軟件進行共表達網絡的構建，通過顏色的深淺及節點的大小，發現篩選出的28個核心藥物中，紅花、雞血藤、黃芪、桂枝的連接緊密，可作為后續選用外敷藥的參考。

BCRL與氣滯血瘀關系密切，臨床上用藥也多選用活血化瘀、行氣活血、利水消腫的藥物[21-23]，且中藥外治通過皮膚直達患處，使水腫更易于吸收消散，且臨床療效顯著。共表達網絡分析最終篩選出的4味中藥不僅具有活血行血之效，還具有通利經脈、行氣利水之功。與臨床用藥指導思想一致，具有較好的實際應用性。

3.6 靶點和通路分析BCRL的發病機制尚未明確[24]，其影響因素包括手術切口、清掃淋巴結數量、肥胖、激素、基因、高血壓和糖尿病等[25-28]。本研究通過分析核心藥物的作用靶點和相關通路，旨在探究治療乳腺癌相關淋巴水腫的可能作用機制。通過PPI網絡的篩選結合KEGG通路富集分析，最后得出兩個關鍵靶基因：ESR1和TP53。在既往研究中，與乳腺癌相關淋巴水腫易感性有關的基因主要包括LCP2、VCAM1等[29-30]。本研究則發現中藥外治的治療靶基因是ESR1和TP53，對之前研究結果進行了補充。ESR1即雌激素受體1，與雌激素受體抵抗和乳腺癌密切相關。已有研究[31]表明女性激素（如黃體酮和雌激素）是調節淋巴生理的關鍵因素，在淋巴水腫的發生發展中具有重要作用。除此之外，淋巴管內皮細胞（LEC）可表達孕激素和雌激素受體。上述研究都證實雌激素受體可能是治療BCRL的靶點之一。雞血藤、桂枝、黃芪、紅花組成的核心藥物可能通過調節ESR1從而影響淋巴管內皮細胞。而TP53基因主要與誘導細胞周期停滯、凋亡、衰老、DNA修復或代謝變化相關[32]。篩選排名前10的信號通路，發現AGE-RAGE相關信號通路、IL17等與核心藥物的作用機制中密切相關。其中AGE-RAG軸的活化可參與到多項下游信號通路的激活，如參與糖尿病腎病的氧化應激、炎癥及纖維化的過程[33-34]。核心藥物可能通過抑制AGE-RAGE軸的活化，從而調節糖尿病腎病的進程，發揮其減輕水腫的作用。已有研究[35]證實在BCRL患者的循環DNA中發現了促炎性細胞因子（如IL1、IL2、IL8、IL17、NFKB2）和抗炎細胞因子（如IL4、IL10、IL13）的變化，中藥可能通過調節炎癥因子的表達治療疾病。因此，網絡藥理學的分析結果對之前的發現進行了補充和驗證，為后續探討乳腺癌相關淋巴水腫的分子機制提供借鑒。

3.7 分子對接分析本研究篩選的藥物有效成分及基因靶點均成功對接，且結合能均＜-5.0 kcal/mol。其中山奈酚、槲皮素和ESR1的結合能均＜-7.0 kcal/mol，具有強烈的結合活性。

4 總 結

本研究通過古今云醫案平臺進行數據管理和分析，并應用數據挖掘相關技術及網絡藥理學分析篩選已有文獻中證實有確切療效的中藥外治方中的核心藥物，并進行了可能機制的探討，為臨床上治療乳腺癌相關淋巴水腫外治方的選擇提供了借鑒，也為后續的機制探討奠定了基礎。