象皮生肌膏聯(lián)合成纖維細(xì)胞生長因子對克羅恩病肛瘺患者瘺管切開術(shù)后創(chuàng)面及肉芽組織Bax、p53、Caspase-3水平的影響*

劉夢竹，賓東華，趙 丹

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

克羅恩病（Crohn’s disease，CD）是一種炎癥性腸道疾病，其致病原因尚未明確，可能與免疫異常、感染和遺傳等因素有關(guān)，可發(fā)于胃腸道的任何部位。患者常有腹痛、腹瀉等臨床表現(xiàn)。CD可伴有發(fā)熱、貧血和體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)[1]。肛瘺是CD患者常見的局部并發(fā)癥，CD患者由于其腸道黏膜長期受炎癥刺激，易導(dǎo)致腸道黏膜潰瘍進(jìn)而形成瘺管。根據(jù)瘺管類型，本病可分為腸皮瘺、內(nèi)瘺和肛瘺。CD肛瘺患者的治療以內(nèi)科治療為主，若有膿腫形成則須行外科手術(shù)治療，但肛瘺術(shù)后會留下開放性創(chuàng)面，存在創(chuàng)面感染風(fēng)險高、肛周膿腫復(fù)發(fā)率高等問題，故積極探索術(shù)后促進(jìn)創(chuàng)面愈合的治療方案對CD肛瘺患者的治療具有重要意義[2]。成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors,FGF）是存在于機(jī)體多種組織中的一類生長因子，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂的作用，有利于外科手術(shù)后創(chuàng)面的愈合[3]。象皮生肌膏具有止痛生肌、消炎長皮的功效[4]。本研究采用象皮生肌膏聯(lián)合FGF治療CD肛瘺瘺管切開術(shù)后患者，分析其對患者術(shù)后創(chuàng)面及肉芽組織中促凋亡蛋白Bax、p53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）水平和創(chuàng)面滲出液中炎癥因子水平的影響，以期為CD肛瘺患者術(shù)后的治療方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)CD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年·北京）》[5]擬定。患者均行體格檢查、核磁共振成像檢查及麻醉下探查。肛瘺西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2017年德國肛周膿腫和肛瘺S3指南[6]擬定。肛瘺中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《痔、肛瘺、肛裂、直腸脫垂的診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行草案）》[7]擬定。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）體格檢查、核磁共振成像檢查及麻醉下探查結(jié)果符合CD診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）符合肛痿的西醫(yī)和中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）年齡18～65歲；（4）影像學(xué)或內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)節(jié)段性或非連續(xù)性病變，腸壁明顯增厚或出現(xiàn)“雙暈征”或“靶征”；（5）影像學(xué)或內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)腸道縱向潰瘍或卵石樣黏膜；（6）臨床出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量減輕、腹部包塊等臨床癥狀；（7）同意參與本研究，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）有肛腸疾病手術(shù)史者；（2）合并心、肝、腎等重要臟器功能衰竭者；（3）先天性肛腸畸形及合并免疫功能異常者；（4）存在手術(shù)禁忌證及對本研究藥物過敏者。

1.4 研究對象選取2018年10月至2020年12月于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科接受肛瘺手術(shù)治療的83例CD患者作為研究對象。采取隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組41例和治療組42例。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（HZFY倫審20180A25號）。

1.5 治療方法兩組患者術(shù)后均給予1:5 000高錳酸鉀溶液熏蒸泡浴創(chuàng)面、碘伏溶液消毒創(chuàng)面邊緣、無菌凡士林紗布外敷和醫(yī)用紗布包扎等常規(guī)治療，1次/d。

1.5.1 對照組 在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子外用溶液（商品名：貝復(fù)濟(jì)噴霧劑，珠海億勝生物制藥有限公司，規(guī)格：63 000IU/15 mL）噴涂，每次劑量為262.5 IU/cm2，1次/d。

1.5.2 治療組 在對照組基礎(chǔ)上給予象皮生肌膏填塞創(chuàng)腔，1次/d。象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批準(zhǔn)文號：湘藥制字Z20070276）方藥組成：象皮10 g，當(dāng)歸15 g，龜甲5 g，血余炭15 g，生地黃25 g，爐甘石粉30 g，生石膏粉50 g，黃蠟120 g，香油1 500 g，麝香10 g。

兩組均于每日常規(guī)換藥期間給予外用藥物，兩組均持續(xù)治療至創(chuàng)面愈合。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 創(chuàng)面愈合情況（1）創(chuàng)面腐肉脫落時間和創(chuàng)面愈合時間。（2）創(chuàng)面滲液情況。術(shù)后7 d后對患者創(chuàng)面滲液情況進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[8]：滲液未滲透1塊紗布，計0分；滲液滲透1～3層紗布，計1分；滲液滲透4～6層紗布，計2分；滲液滲透6層紗布以上，計3分。得分越高表明創(chuàng)面滲液越多，創(chuàng)面愈合情況越差。（3）肉芽組織生長情況。術(shù)后7 d后對兩組患者肉芽組織生長情況進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)[9]：肉芽組織生長良好，創(chuàng)面基本愈合，計0分；肉芽組織生長旺盛，色澤鮮紅，創(chuàng)面呈顆粒狀，計1分；肉芽組織生長旺盛，色澤白或淡紅，創(chuàng)面光滑，計2分；肉芽組織生長緩慢，色澤灰暗，創(chuàng)面凹陷，計3分。得分越高表明肉芽組織生長情況越差。（4）創(chuàng)面面積減少率。記錄兩組患者術(shù)后1 d及術(shù)后7 d后的創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面面積減少率。創(chuàng)面面積減少率（%）=[（術(shù)后1 d創(chuàng)面面積-術(shù)后7 d創(chuàng)面面積）/術(shù)后1 d創(chuàng)面面積]×100%。

1.6.2 肛門功能 術(shù)前1 d及術(shù)后7 d后采用腸胃電圖儀檢測兩組患者肛管最大收縮壓（anal maximal contraction pressure,AMCP）、肛管靜息壓（anal resting pressure,ARP）和肛管最長收縮時間（anal longest contraction time,ALCT）。

1.6.3 促凋亡蛋白 術(shù)后1、7 d后采集兩組患者創(chuàng)面肉芽組織，加入蛋白裂解液，加入裂解液充分勻漿后放置45 min，以4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肉芽組織中Bax、p53、Caspase-3蛋白水平。

1.6.4 炎癥因子 術(shù)后1、7 d后采集兩組患者創(chuàng)面滲出液。采用5cm×1cm規(guī)格的定量分析濾紙，于距濾紙前段3cm處做標(biāo)記，于換藥時將濾紙前端置于傷口內(nèi)，待滲出液濕潤至標(biāo)志處時停止收集，將濾紙濕潤部分剪下并浸泡于1 mL磷酸鹽緩沖溶液中2 h，冷凍保存待測[10]。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測創(chuàng)面滲出液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平。

1.7 療效標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后1個月根據(jù)創(chuàng)面愈合情況及臨床癥狀評價療效[10]。治愈：創(chuàng)面愈合，且疼痛、腫脹和發(fā)熱等癥狀消失；顯效：創(chuàng)面面積減少率≥70%，癥狀明顯減輕；有效：45%≤創(chuàng)面面積減少率＜70%，癥狀有所減輕；無效：創(chuàng)面面積減少率＜45%，癥狀無改善甚至加重。總有效率=[(治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)]×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布，采用（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料對照組患者年齡19～65歲，本次發(fā)病病程2～18 d；治療組患者年齡20～63歲，本次發(fā)病病程1～19 d。兩組患者基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（見表1）

表1 兩組患者基線資料比較

2.2 兩組患者療效比較治療組總有效率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表2）

表2 兩組患者療效比較[例（%）]

2.3 兩組患者創(chuàng)面愈合情況比較治療組患者腐肉脫落時間、創(chuàng)面愈合時間均短于對照組，創(chuàng)面滲液評分、肉芽組織生長評分均低于對照組，創(chuàng)面面積減少率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表3）

表3 兩組患者創(chuàng)面愈合情況比較（±s）

表3 兩組患者創(chuàng)面愈合情況比較（±s）

組別 例數(shù) 腐肉脫落時間（d）創(chuàng)面愈合時間（d）創(chuàng)面滲液評分（分）肉芽組織生長評分（分） 創(chuàng)面面積減少率（%）對照組 41 5.86±1.24 24.58±5.83 0.83±0.24 1.18±0.38 31.26±4.72治療組42 5.14±0.87 20.18±4.79 0.57±0.16 0.81±0.22 36.89±5.63 t 3.393 2.282 6.302 5.949 4.842 P 0.001 0.025 0.000 0.000 0.000

2.4 兩組患者肛門功能比較術(shù)前1 d，兩組患者AMCP、ARP和ALCT比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；術(shù)后7 d，兩組患者AMCP、ARP均較術(shù)前1 d升高，ALCT均較術(shù)前1 d延長，且治療組患者AMCP、ARP均高于對照組，ALCT長于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表4）

表4 兩組患者肛門功能比較（±s）

表4 兩組患者肛門功能比較（±s）

AMCP（kPa） ARP（kPa） ALCT（s）術(shù)前1 d 術(shù)后7 d t P 術(shù)前1 d 術(shù)后7 d t P 術(shù)前1 d 術(shù)后7 d t P對照組41 11.02±2.37 12.76±2.85 3.005 0.004 12.53±2.44 14.98±3.16 3.929 0.002 22.84±5.94 26.91±4.63 3.460 0.008治療組42 10.93±2.29 14.43±2.93 6.099 0.000 12.37±3.41 16.95±2.32 7.196 0.000 22.66±6.17 29.73±4.58 4.962 0.002 t 0.185 2.907 0.544 2.630 0.144 2.353 P 0.853 0.005 0.588 0.010 0.886 0.021組別 例數(shù)

2.5 兩組患者肉芽組織中促凋亡蛋白水平比較術(shù)后1 d，兩組患者肉芽組織中Bax、p53和Caspase-3蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；術(shù)后7 d，兩組患者肉芽組織中Bax、p53和Caspase-3蛋白水平均較治療前降低，且治療組患者肉芽組織中Bax、p53和Caspase-3蛋白水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表5）

表5 兩組患者肉芽組織中促凋亡蛋白水平比較（±s）

表5 兩組患者肉芽組織中促凋亡蛋白水平比較（±s）

Bax（ng/L） p53（pg/L） Caspase-3（ng/L）術(shù)后1 d術(shù)后7 d t P 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d t P 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d t P對照組41 3.19±0.87 1.86±0.53 3.359 0.005 120.84±29.63 71.58±12.45 2.963 0.002 6.79±1.74 4.33±1.21 3.137 0.006治療組42 3.06±0.75 1.42±0.34 12.906 0.000 117.63±26.86 54.72±11.69 13.917 0.000 6.95±1.86 3.92±1.07 4.412 0.003 t 0.415 3.942 0.951 6.033 0.178 3.240 P 0.680 0.000 0.344 0.000 0.857 0.002組別 例數(shù)

2.6 兩組患者創(chuàng)面滲出液中炎癥因子水平比較術(shù)后1 d，兩組患者創(chuàng)面滲出液中TNF-α、IFN-γ和IL-10水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；術(shù)后7 d，兩組患者創(chuàng)面滲出液中TNF-α、IFN-γ水平均降低，IL-10水平均升高，且治療組患者創(chuàng)面滲出液中TNF-α、IFN-γ水平均低于對照組，IL-10水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表6）

表6 兩組患者創(chuàng)面滲出液中炎癥因子水平比較（±s）

表6 兩組患者創(chuàng)面滲出液中炎癥因子水平比較（±s）

TNF-α（ng/L） IFN-γ（μg/L） IL-10（μg/L）術(shù)后1 d 術(shù)后7 d t P 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d t P 術(shù)后1 d 術(shù)后7 d t P對照組41 216.58±36.53 134.37±27.61 4.736 0.007 17.32±4.25 15.28±3.16 4.518 0.009 19.15±5.04 22.45±5.38 3.187 0.003治療組42 209.64±34.91 112.76±24.14 14.792 0.000 17.14±4.46 12.53±3.59 7.218 0.000 18.81±4.67 24.62±5.23 6.370 0.000 t 1.079 3.264 0.198 3.106 0.488 2.176 P 0.284 0.002 0.844 0.003 0.627 0.032組別 例數(shù)

3 討 論

CD是一種慢性腸道疾病，典型表現(xiàn)為胃腸道出現(xiàn)原因不明的炎癥表現(xiàn)，可發(fā)生于胃腸道的任何部位。CD患者的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣化，可出現(xiàn)腹瀉、腹痛、血便等消化道表現(xiàn)和體質(zhì)量下降、發(fā)熱、貧血等全身性表現(xiàn)[11-12]。CD患者的胃腸道長期處于炎癥狀態(tài)，易導(dǎo)致黏膜潰瘍形成瘺管，進(jìn)而導(dǎo)致腸道穿孔、腸梗阻和肛瘺等并發(fā)癥[13]。CD肛瘺患者的治療以內(nèi)科治療為主，但膿腫形成后則需行外科手術(shù)充分引流，而術(shù)后留下的開放性創(chuàng)面易發(fā)生感染，進(jìn)而導(dǎo)致引流后膿腫復(fù)發(fā)[14]。

FGF是存在于機(jī)體多種組織中的一類生長因子，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂的作用，常用于治療外傷、燒傷及外科手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)面，能促進(jìn)肛瘺手術(shù)創(chuàng)面的愈合[15]。本研究中象皮生肌膏是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科結(jié)合臨床實踐，在《瘍科綱要》中象皮生肌膏的基礎(chǔ)上研制而成[16-17]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CD的主要病因病機(jī)為飲食不節(jié)、感受外邪，導(dǎo)致濕邪內(nèi)蘊、氣血壅滯和脾腎虧虛。CD導(dǎo)致的肛瘺屬于中醫(yī)學(xué)中的“肛漏”范疇，病機(jī)為肛癰潰后，余毒未盡，蘊結(jié)不散，血行不暢，瘡口不合，日久成漏[18]。象皮生肌膏中象皮、血余炭、生地黃、爐甘石具有止血斂瘡的功效；當(dāng)歸、黃蠟、麝香具有消腫止痛、排膿生肌的作用；龜甲、生石膏、香油可清熱涼血，瀉火解毒；諸藥配伍，具有清熱活血、散瘀止痛、斂瘡生肌的作用，與CD肛瘺方證對應(yīng)[19]。本研究采用象皮生肌膏聯(lián)合FGF治療CD肛瘺術(shù)后患者，結(jié)果顯示：治療組患者腐肉脫落時間、創(chuàng)面愈合時間均顯著短于對照組；術(shù)后7 d后，治療組患者創(chuàng)面滲液評分、肉芽組織生長評分均顯著低于對照組，創(chuàng)面面積減少率顯著高于對照組；術(shù)后1個月，治療組總有效率顯著高于對照組。結(jié)果表明在FGF噴涂創(chuàng)面治療的基礎(chǔ)上給予象皮生肌膏填塞創(chuàng)腔治療可有效促進(jìn)CD肛瘺患者肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合。

肛門的功能主要依賴于括約肌、肛提肌等肌肉的收縮能力，而肛瘺的瘺道常貫通于肛門肌肉間，可直接對括約肌等肛門肌肉的收縮功能造成影響。瘺道貫通于肛門肌肉間，故肛瘺手術(shù)可對瘺道涉及的肌肉造成損傷，導(dǎo)致肛門肌肉收縮功能異常，進(jìn)而影響肛瘺患者的肛門功能[20-21]。AMCP、ARP和ALCT均是臨床評價肛門功能的指標(biāo)。AMCP、ARP降低，ALCT縮短提示肛門自制能力降低，可導(dǎo)致大便失禁[22]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，治療組患者AMCP、ARP均顯著高于對照組，ALCT顯著長于對照組。結(jié)果表明在FGF噴涂創(chuàng)面治療的基礎(chǔ)上給予象皮生肌膏填塞創(chuàng)腔治療可有效改善CD肛瘺患者術(shù)后的肛門功能。

創(chuàng)面的愈合依賴于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的增殖、分化，而細(xì)胞的增殖分化與細(xì)胞的凋亡機(jī)制密切相關(guān)[23]。Bax、p53和Caspase-3蛋白均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中Bax蛋白主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)中。在凋亡信號的刺激下，Bax蛋白發(fā)生構(gòu)象改變并轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，通過改變線粒體膜通透性促進(jìn)促凋亡因子釋放入胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase-3凋亡執(zhí)行蛋白，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[24]。p53蛋白可作用于DRAM基因，促進(jìn)其編碼表達(dá)出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的溶酶體蛋白，進(jìn)而起到介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[25]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，治療組患者肉芽組織中Bax、p53和Caspase-3蛋白水平均顯著低于對照組。結(jié)果表明象皮生肌膏聯(lián)合FGF治療可抑制創(chuàng)面新生細(xì)胞的凋亡，利于創(chuàng)面的愈合。

TNF-α、IFN-γ均為促炎癥因子，而IL-10為炎癥抑制因子。TNF-α和IFN-γ水平升高而IL-10水平降低提示創(chuàng)面炎癥水平上調(diào)，可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂攻擊自身組織細(xì)胞，從而影響創(chuàng)面的愈合[26-27]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，治療組患者創(chuàng)面滲出液中TNF-α、IFN-γ水平均顯著低于對照組，IL-10水平顯著高于對照組。結(jié)果表明象皮生肌膏聯(lián)合FGF治療可減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，利于創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，象皮生肌膏聯(lián)合FGF治療CD肛瘺瘺管切開術(shù)后患者，可有效抑制肉芽組織細(xì)胞凋亡，減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，改善肛門功能。