多西他賽聯(lián)合四君子湯對RM-1前列腺癌荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用及免疫功能的影響*

胡佳貞，何春峰，吳曉慧，張青川

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

前列腺癌（prostate carcinoma）在發(fā)達國家的發(fā)病率位列第一、而死亡率位列第二[1-2]。在我國新增確診的前列腺癌患者中中期、晚期患者的比例明顯高于美國等發(fā)達國家[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)將多西他賽（Docetaxel，DXT）作為治療前列腺癌的一線化療藥物，在2004年美國FDA審核準予其正式成為臨床上治療難治性前列腺癌的藥物[4-5]，是臨床上常用的標靶藥物[6]。多西他賽治療效果明確，但其副作用隨著臨床應(yīng)用日益凸顯，急需探索能夠同時減輕患者的化療副作用、協(xié)同抑瘤，進而提高機體免疫力的綜合治療方法。中醫(yī)學(xué)認為前列腺癌臟腑病變主要在于腎與膀胱，病機主要為正虛邪實，以虛為主。由于前列腺癌臨床表現(xiàn)不同且復(fù)雜，不同中醫(yī)醫(yī)家對其診治分型各有不同[7]。前列腺癌以虛證為主，而四君子湯是益氣補氣的經(jīng)典方。四君子湯源自《太平惠民和劑局方》。全方由4味中藥組成：人參（君藥）性甘，有補氣益氣之功效；白術(shù)（臣藥）性溫，具有健脾、益氣及輔助運化之功效；茯苓（佐藥）性平，有滲濕、潤燥、益氣之功效；甘草（使藥）性甘，有輔助調(diào)和諸藥、健脾益氣的功效。全方共奏扶正固本、益氣補氣、補脾利濕之功[8]。腫瘤進展與體內(nèi)免疫狀態(tài)密切相關(guān)，機體抗腫瘤占主導(dǎo)作用的是細胞免疫[9]。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)以人參為君藥的參芪扶正液具有提高免疫力的功能[10]。本研究在前期實驗研究的基礎(chǔ)上，擬探討四君子湯聯(lián)合多西他賽對RM-1前列腺癌荷瘤小鼠皮下移植瘤的生長情況及對機體細胞免疫功能的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠共30只，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物合格證編號：20170005012229，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。動物實驗環(huán)境：恒溫26℃，濕度50%～70%，壓差25 Pa，噪聲≤60 dB，照度150 Lux。本實驗由上海同濟大學(xué)滬北動物實驗中心倫理委員會審查批準，并開展動物實驗。實驗完畢后脫頸椎處死小鼠。

1.2 細胞株小鼠前列腺癌RM-1細胞株，購自中國科學(xué)院上海分院。

1.3 藥物與試劑多西他賽（Medchem ExPress公司，批號：114977-28-5）；中藥材人參粉（上海信德中藥飲片廠，批號：20160149）、白術(shù)顆粒劑（批號：9025022）、茯苓顆粒劑（批號：9050432）、炙甘草顆粒劑（批號：9045682）均購自廣東一方制藥有限公司；胎牛血清（北美BI，批號：04-001-1AUS）；胰酶（Gibco公司，批號：25200056）；細胞培養(yǎng)基（RPMI-1640）（Hyclone公司，批號：SH30809.01）；Fc block（BD Pharminge公司，批號：8086608）；Staining Buffer（BD Pharminge公司，批號：554656）；Collagenase IV（Biofroxx公司，批號：EZ4567D111）；DNase酶（Biofroxx公司，批號：EZ3416D319）；紅細胞裂解液（北京索萊寶科技公司，批號：R1010）；PE-anti mouse CD3抗體（上海Biolegend，批號：100206）；FITC-anti mouse CD4抗體（美國BD Bioscience，批號：11-0041-81）；APC-anti mouse CD8抗體（美國BD Bioscience，批號：561093）；Cy5.5-anti mouse CD11c抗體（美國BD Bioscience，批號：117328）；PE-anti mouse CD80抗體（上海Biolegend，批號：104713）；FITC-anti mouse CD86抗體（美國eBioscience，批號：11-0862-81）；Cy5.5-anti mouse CD8抗體（美國BD Bioscience，批號：551162）；FITC-anti mouse CD44抗體（美國eBioscience，批號：11-0441-82）；APCanti mouse CD62L抗體（美國BD Bioscience，批號：553152）；Mouse T-Cell surface Glycoprotein CD4 Elisa試劑盒（CUSBIO公司，批號：CSB-E13393m)；Mouse Cluster of differentiation 8a Elisa試劑盒（DLDEVELOP公司，批號：DL-CD8a-Mu）。

1.4 主要儀器DNP9082型恒溫孵育箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；5427R型低溫高速離心機（EPPendorf公司）；MM-1型微量震蕩器（金壇市醫(yī)療器械廠）；CKX41型倒置顯微鏡（OlymPus公司）；Bit1000型電熱恒溫水浴鍋（精宏實驗設(shè)備有限公司）；BSA124S型電子天平（Sartorius公司）；CytoFLEX LX型流式細胞儀（BECKMAN COULTER公司）；Synergy LX型多功能熒光酶標儀（美國BIOTEK公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模30只C57BL/6雄性小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體的動物實驗室，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，均存活。按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組，每組6只。無菌條件下配置RM-1細胞懸液（細胞密度為5×107個/L），放于冰上低溫暫存。除空白對照組外，其余各組建立小鼠荷瘤模型，外科精細剪刀剪去移植部位黑色毛發(fā)，小鼠前列腺癌RM-1細胞懸液以0.2 mL/只接種于小鼠的右側(cè)腋窩皮下，接種7 d后測量腫瘤直徑達到約0.5 cm即為造模成功，最終24只小鼠均造模成功。

2.2 藥物制備四君子湯顆粒劑，方藥組成：人參9 g，白術(shù)顆粒2.7 g（相當于飲片9 g），茯苓顆粒0.45 g（相當于飲片9 g），炙甘草顆粒1.2 g（相當于飲片6 g）。按照人與小鼠體表面積換算成用藥組小鼠所需藥量：四君子湯顆粒劑給藥量2 g/kg（前期預(yù)實驗結(jié)果）。1劑四君子湯顆粒劑加66 mL的三蒸水配置成含藥量0.2 g/mL所需藥液，4℃保存。多西他賽加0.9%氯化鈉溶液配制成2.5 mg/kg所需溶度。

2.3 實驗給藥多西他賽組小鼠腹腔注射給予多西他賽溶液，0.2 mL/只；四君子湯組小鼠灌胃給予四君子湯藥液，2 g/kg；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠腹腔注射多西他賽溶液（0.2 mL/只）的同時灌胃給予四君子湯藥液（2 g/kg）；空白對照組和荷瘤模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃、等量的生理鹽水腹腔注射，1次/d。各組小鼠連續(xù)干預(yù)10 d。

2.4 觀察指標

2.4.1 抑瘤率 每2天測量小鼠腫瘤體積變化并記錄數(shù)據(jù)，用游標卡尺測量瘤體最大橫徑線a、垂直短徑b，體積=b×b×a/2。末次給藥后禁食不禁水24 h后頸椎脫臼法處死，剝除瘤體，測量瘤體體積、瘤質(zhì)量，計算抑瘤率。抑瘤率（TIR）=（荷瘤模型組瘤體積-給藥組瘤體積）/荷瘤模型組瘤體積×100%。

2.4.2 流式細胞儀檢測小鼠淋巴結(jié)樹突狀細胞（CD11c、CD80、CD86）、腫瘤瘤體T淋巴細胞（CD3、CD4、CD8）、脾臟記憶T淋巴細胞（CD3、CD8、CD44、CD62L）分別摘取右側(cè)腋窩淋巴結(jié)，完整剝除瘤體、脾臟。取淋巴結(jié)消化制成密度為1×106個/mL的細胞懸液，F(xiàn)c block（1 μL/100 μL）冰上孵育5 min，加入表面分子抗體Cy5.5-anti mouse CD11c抗體、PE-anti mouse CD80抗體、FITC-anti mouse CD86進行染色。取瘤體消化制成密度為1×106個/mL的細胞懸液，加入表面分子抗體PE-anti mouse CD3抗體、FITC-anti mouse CD4抗體、APC-anti mouse CD8抗體進行染色。取脾臟消化制成密度為1×106個/mL的細胞懸液，加入表面分子抗體PE-anti mouse CD3抗體、Cy5.5-anti mouse CD8抗 體、FITC-anti mouse CD44抗 體、APC-anti mouse CD62L抗體。均在室溫避光孵育15 min，2 000 r/min低溫離心10 min，棄去上清，取200 μL Stain buffer重懸細胞，上細胞流式儀檢測細胞比例。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2.4.3 ELISA法檢測小鼠血清CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞 末次給藥后禁食不禁水24 h后，頸椎脫臼處死前，雙側(cè)眼眶取血，EDTA抗凝，室溫靜置1 h后，2 000 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA雙抗體夾心法免疫試劑盒檢測，計算CD4+T細胞、CD8+T細胞表達。血清樣品1∶5稀釋，100 μL混勻后分別加入各待測孔中，加蓋，置于37℃孵育2 h。甩干棄液后每孔加入Biotin-antibody（1×）100 μL、封板37℃下孵育1 h后洗板3次。每孔加入HRP-avidin（1×）100 μL后，封板37℃下孵育1 h后洗板5次。每孔加入90 μL TMB顯色劑，封板37℃下孵育15 min避光。每孔加入50 μL的ELISA終止液終止反應(yīng)，在5 min內(nèi)用熒光酶標儀在450 nm波長條件下檢測吸光度。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料用“均數(shù)±標準差”（±s）表示。重復(fù)測量計量資料比較采用重復(fù)測量方差進行分析。計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表應(yīng)用Graph pad prism 5作圖圖像分析處理軟件。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠瘤體體積比較所有小鼠瘤體體積隨時間延長均明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在時間效應(yīng)，4組均如此。4組小鼠瘤體體積總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在分組效應(yīng)；第3、5、7、10天，多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體體積均低于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體體積均低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠瘤體體積明顯高于多西他賽組（P＜0.01）。時間因素與分組因素間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。（見表1、圖1）

表1 各組小鼠瘤體體積比較（±s，mm3）

表1 各組小鼠瘤體體積比較（±s，mm3）

注：F交互效應(yīng)=11.617，P交互效應(yīng)=0.000；F時間主效應(yīng)=20.876，P時間主效應(yīng)=0.000；F組別主效應(yīng)=29.312，P組別主效應(yīng)=0.000；與荷瘤模型組比較，aP＜0.01；與多西他賽組比較，bP＜0.01；與四君子湯組比較，cP＜0.01，與第1天比較，dP＜0.01；與第3天比較，eP＜0.01；與第5天比較，fP＜0.01；與第7天比較，gP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天 F P荷瘤模型組 6 15.77±4.46 51.70±2.20d 76.49±6.56d e 175.91±4.19d e f 488.45±3.47d e f g 351.580 0.000多西他賽組 6 13.18±4.20 28.10±1.14a d 42.40±5.74a d e 103.47±4.13a d e f 157.82±2.40a d e f g 241.671 0.000四君子湯組 6 11.62±2.53 38.18±3.48a b d 57.85±2.35a b d e 113.20±1.68a b d e f 165.85±2.48a b d e f g 215.613 0.000多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 14.01±3.56 16.14±6.03a b c 28.72±2.75a b c d e 49.22±4.30a b c d e f 65.19±4.87a b c d e f g 47.819 0.000 F 1.239 36.478 66.030 327.635 565.767 P 0.670 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組小鼠瘤體體積交互效應(yīng)輪廓圖

3.2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量均低于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量均低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠第10天瘤體質(zhì)量與多西他賽組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。多西他賽組、四君子湯、多西他賽聯(lián)合四君子湯的抑瘤率分別為67.68%、67.06%、86.65%。（見表2）

表2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠第10天瘤體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與荷瘤模型組比較，aP＜0.01；與多西他賽組比較，bP＜0.01；與四君子湯組比較，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）瘤體質(zhì)量（images/BZ_6_979_1892_998_1929.png±s，g） 抑瘤率（%）荷瘤模型組 6 5.90±0.46 -多西他賽組 6 2.53±0.21a 67.68±1.52四君子湯組 6 2.84±0.11a 67.06±2.35多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 1.85±1.11abc 86.65±5.31bc F 276.300 61.950 P 0.000 0.000

3.3 各組小鼠淋巴結(jié)樹突狀細胞DCs比較荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組及多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+細胞比例、CD11c+CD86+細胞比例、CD11c+CD80+CD86+細胞比例均明顯高于空白對照組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+細胞比例、CD11c+CD86+細胞比例、CD11c+CD80+CD86+細胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；四君子湯組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD86+細胞比例、CD11c+CD80+CD86+細胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組CD11c+CD80+細胞比例、CD11c+CD86+細胞比例、CD11c+CD80+CD86+細胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.01）。（見表3、圖2）

圖2 各組小鼠淋巴結(jié)樹突狀細胞CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+比較

表3 各組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、D11c+CD80+CD86+細胞比例比較（±s，%）

表3 各組小鼠淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、D11c+CD80+CD86+細胞比例比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與荷瘤模型組比較，bP＜0.01；與多西他賽組比較，cP＜0.01；與四君子湯組比較，dP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）CD11c+CD80+CD11c+CD86+CD11c+CD80+CD86+空白對照組 6 17.38±2.13 22.52±1.44 10.09±1.73荷瘤模型組 6 46.56±4.95a 31.71±6.06a 17.12±2.78a多西他賽組 6 45.68±8.15a 34.61±7.20a 19.07±2.70ab四君子湯組 6 46.15±3.20a 39.91±1.59ab 27.57±3.16abc多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 79.36±1.15abcd 46.72±1.25abcd 40.58±2.42abcd F 135.100 15.810 80.210 P 0.000 0.000 0.000

3.4 各組小鼠瘤體T淋巴細胞比較多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.05），CD3+CD4+T細胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05），CD3+CD4+T細胞比例均明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05）；四君子湯組小鼠瘤體CD3+CD8+T細胞比例、CD3+CD4+T細胞比例與多西他賽組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4、圖3）

圖3 各組小鼠瘤體CD3+CD8+、CD3+CD4+T淋巴細胞比較

表4 各組小鼠瘤體CD3+CD8+T細胞比例、CD3+CD4+T細胞比例比較 （±s，%）

表4 各組小鼠瘤體CD3+CD8+T細胞比例、CD3+CD4+T細胞比例比較 （±s，%）

注：與荷瘤模型組比較，aP＜0.05；與多西他賽組比較，bP＜0.05；與四君子湯組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）CD3+CD8+ CD3+CD4+荷瘤模型組 6 31.94±6.03 10.45±2.35多西他賽組 6 41.33±4.36a 8.27±2.35a四君子湯組 6 40.95±5.37a 8.67±1.29a多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 52.84±9.57abc 5.71±2.58abc F 5.044 3.249 P 0.009 0.043

3.5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+T淋巴細胞比較荷瘤模型組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細胞比例明顯高于空白對照組（P＜0.01），CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比例明顯低于空白對照組（P＜0.01）；多西他賽組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.01），多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.01）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-T細胞比例均明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05或P＜0.01），CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比例均明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05或P＜0.01）。（見表5、圖4～5）

圖4 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44、CD62L流式細胞儀門控選擇

表5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比例比較（±s，%）

表5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比例比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與荷瘤模型組比較，bP＜0.01；與多西他賽組比較，cP＜0.05；與四君子湯組比較，dP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）CD3+CD8+CD44+CD62L-CD3+CD8+CD44-CD62L+空白對照組 6 17.39±2.97 52.14±2.44荷瘤模型組 6 38.29±4.38a 24.28±1.89a多西他賽組 6 29.01±3.43ab 33.49±5.01ab四君子湯組 6 31.41±6.95a 38.22±3.11ab多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 26.02±2.51abcd 44.29±2.85abcd F 6.342 16.74 P 0.000 0.000

圖5 各組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44+CD62L-、CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞比較

3.6 各組小鼠血清T淋巴細胞比較荷瘤模型組、多西他賽組、四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細胞、CD8+T細胞比例均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；四君子湯組、多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細胞比例均明顯高于荷瘤模型組（P＜0.05），多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD8+T細胞比例明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽組小鼠血清CD4+T細胞、CD8+T細胞比例均明顯低于荷瘤模型組（P＜0.05）；多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠血清CD4+T細胞比例明顯高于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05），CD8+T細胞比例明顯低于多西他賽組、四君子湯組（P＜0.05）。（見表6）

表6 各組小鼠血清CD4+T細胞、CD8+T細胞比較（±s，pg/mL）

表6 各組小鼠血清CD4+T細胞、CD8+T細胞比較（±s，pg/mL）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與荷瘤模型組比較；bP＜0.05；與多西他賽組比較，cP＜0.05；與四君子湯組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） CD4+ CD8+空白對照組 6 737.10±10.31 10 537.10±14.11荷瘤模型組 6 4 053.29±13.30a 13 204.56±37.44a多西他賽組 6 3 834.25±53.24abd 11 996.09±11.18abd四君子湯組 6 5 913.87±25.73abc 13 337.87±18.07ac多西他賽聯(lián)合四君子湯組6 8 813.38±18.85abcd 10 684.52±60.02abcd F 63 956 9 444 P 0.000 0.004

4 討 論

中醫(yī)藥可以輔助惡性腫瘤的治療，體現(xiàn)在調(diào)動免疫系統(tǒng)，緩解化療藥物的副作用等方面。故化療藥物聯(lián)合中藥，可以幫助患者度過免疫系統(tǒng)被抑制的化療期，提高患者的耐受性[11-12]。中醫(yī)常用“扶正-活血-解毒”治療方法，即是中醫(yī)藥治療腫瘤的精髓[13]。本研究表明多西他賽聯(lián)合四君子湯具有協(xié)同抑瘤作用，這與蔣志明等[14]的研究結(jié)果相符。蔣志明等[14]應(yīng)用加味四君子湯聯(lián)合奧沙利鉑及5-氟尿嘧啶治療晚期結(jié)直腸癌患者，與單純化療組患者相比，聯(lián)合組患者的KPS體力評分量表分數(shù)明顯升高，瘤體縮小更明顯。

淋巴結(jié)樹突狀細胞DCs具有強大的抗原提呈功能，如何調(diào)動激活機體DCs，是最近研究免疫抗腫瘤的重點和熱點[15]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠淋巴結(jié)內(nèi)樹突狀細胞在CD11c+總數(shù)量沒有明顯變化的前提下，多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠淋巴結(jié)內(nèi)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+細胞表達明顯高于多西他賽組。說明四君子湯與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用，更能有效刺激淋巴結(jié)CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+CD80+CD86+細胞的增殖，增強了其抗原遞呈功能，表明DCs更多的轉(zhuǎn)化為成熟DC，抗原遞呈功能被明顯激活。這與田晉生等[16]的研究相一致，該研究表明當處于IL-4的炎癥因子刺激下，小鼠骨髓DCs中CD11c+CD80+、CD11c+CD86+明顯升高。徐雪蓮等[17]綜述發(fā)現(xiàn)近年來DCs疫苗已經(jīng)應(yīng)用到消化道惡性腫瘤的臨床治療中，DCs疫苗聯(lián)合化療，可明顯改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

T淋巴細胞的數(shù)量變化、T淋巴細胞的功能變化，常與腫瘤的發(fā)生、進展高度相關(guān)。其中T淋巴細胞亞群又是體內(nèi)細胞免疫最重要的組成部分，腫瘤內(nèi)CD8+T細胞的比例越高，其機體抗腫瘤的免疫功能越強。本研究通過對小鼠瘤體T淋巴細胞亞群檢測發(fā)現(xiàn)多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠瘤體CD8+T細胞表達明顯升高，CD4+T細胞表達明顯降低，優(yōu)于多西他賽組。說明多西他賽聯(lián)合四君子湯具有協(xié)同作用，緩解了小鼠機體的免疫抑制，提高了小鼠的免疫功能，具有調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的作用。這與王婷等[18]的研究結(jié)果相一致。王婷等[18]通過分組觀察益氣復(fù)生方聯(lián)合化療對胃癌荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤淋巴細胞CD4+、CD8+的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組明顯優(yōu)于單用化療組。胡喜珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤性淋巴細胞在漿液性卵巢癌中，CD8+T浸潤程度與腫瘤的預(yù)后成正相關(guān)。初始T細胞（Native T cell，Tn）表達CD3+CD8+CD44-CD62L+，抗凋亡能力最強，但殺傷能力最弱，Tn接受抗原刺激后形成效應(yīng)記憶性T細胞（Effective Memory T cell，Tem）。Tem位于分化終止期，殺傷能力最強，Tem表面表達CD3+CD8+CD44+CD62L-。本研究結(jié)果表明，多西他賽聯(lián)合四君子湯組下調(diào)脾臟CD3+CD8+CD44+CD62LT細胞作用最顯著；與多西他賽組比較，多西他賽聯(lián)合四君子湯組小鼠脾臟CD3+CD8+CD44-CD62L+T細胞下調(diào)至更接近正常水平。多西他賽聯(lián)合四君子湯使化療荷瘤小鼠記憶性T細胞保持在更為原始的狀態(tài)，從而降低了效應(yīng)性殺傷性CD8+T細胞的增殖分化。

正常情況下，機體血清CD4+T細胞、CD8+T細胞表達的動態(tài)平衡維持正常的免疫功能，一旦比例失調(diào)，提示機體的免疫功能減弱[20]。本研究檢測了小鼠的血清T淋巴細胞亞群，多西他賽聯(lián)合四君子湯能明顯提高機體輔助性CD4+T細胞、回調(diào)CD8+T細胞表達水平，聯(lián)合應(yīng)用能夠有效提高化療小鼠機體的免疫功能。有相關(guān)研究也提出化療聯(lián)合中藥化療效果更好，如陸蓉等[21]研究顯示參芪扶正注射液聯(lián)合多西他賽能上調(diào)乳腺癌患者CD3+CD4+T細胞比例，下調(diào)CD3+CD8+T細胞比例，聯(lián)合應(yīng)用抑制腫瘤更有效，同時有改善化療后機體的免疫抑制狀態(tài)。計小清等[22]研究發(fā)現(xiàn)四君子湯合當歸補血湯能提高化療小鼠機體自身免疫功能。

綜上所述，多西他賽與四君子湯聯(lián)合應(yīng)用，能提高RM-1前列腺癌荷瘤小鼠的免疫功能，同時緩解了單用多西他賽的化療副作用。其機制與調(diào)動化療荷瘤小鼠免疫抑制狀態(tài)、激活機體免疫功能有關(guān)。