加味蘇連溫膽湯治療終末期腎病作用機制的生物信息學研究▲

馬思佳 范 嬌 潘知玉 張紫嫣 薛舜暄 張 昱

(中國中醫科學院西苑醫院腎病科，北京市 100091)

在全球范圍內，腎臟疾病尤其是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的患者數量增加，嚴重威脅著人類的健康，并給社會帶來巨大的經濟負擔[1]。雖然目前已有一些治療方法可以有效地延緩早期ESRD的進展，但很難延緩晚期ESRD患者的疾病進程[2]。不論是接受血液透析還是腎臟移植，ESRD患者都需要承受巨大的心理和生理壓力，早期ESRD患者可無明顯不適，但隨著腎功能的進行性下降，毒素在體內進一步蓄積，患者可出現惡心、嘔吐、納差、皮膚瘙癢、水腫等表現，并出現認知障礙等一系列并發癥[3]。

ESRD在中醫學中屬“關格”“癃閉”“虛勞”等范疇，病因病機較為冗雜，多屬虛中夾實，最后進展為陰陽兩虛、臟腑氣血受損。腎位于人體下焦，內蘊元陰元陽，是先天之本?！端貑枴に疅嵫ㄕ摗吩啤澳I何以能聚水而生??？岐伯曰：腎者胃之關也，關閉不利，故聚水而從其類也”。飲食水谷入于胃，胃受納之，其中糟粕的部分皆由腎蒸騰氣化而轉輸膀胱，排出體外。腎居于下焦，內蘊真陰真陽；胃為水谷之海，主腐熟水谷。若腎陽虛弱，元陽虧損，則命門火衰，腎氣化生乏源，腎氣不足則不能推動水液運行，水液停聚，發為水腫。胃在中焦，其氣主降，水液停聚于內，水道不利，則胃氣運行受阻，不得其降，必夾腎之聚水而上逆于胃，發為嘔吐[4]。脾胃運化失職，升降失司，不能斡旋中焦，則惡心納差。濕濁毒邪犯溢肌膚，則皮膚瘙癢。臨床研究結果表明，應用中醫藥療法干預ESRD，在提高透析效果、緩解透析相關癥狀、改善患者的生活質量、降低醫療費用等方面都具有非常重要的作用[5]。

加味蘇連溫膽湯主要化裁于蘇葉黃連湯與溫膽湯，由蘇葉、黃連、半夏、萆薢、紅花等藥物組成，臨床隨證加減。方中蘇葉性辛、溫，歸肺、脾經，其氣辛溫能散，氣薄能通，上走入肺，中走脾胃，外透于肌表，一藥三功，辛、溫、行、散并用。肺主氣，司清肅，對調整氣化樞機起主導作用，氣機調達，則升降自如，胃氣乃和。黃連性寒、味苦，《神農本草經》曰“黃連主熱氣”。凡藥能去濕者必增熱，能除熱者必不能去濕，唯黃連能以苦燥濕，以寒除熱，一舉而兩得[6]。又因黃連味苦堅陰，可厚腸胃，有一定的止瀉作用。半夏燥濕化痰的同時可以和胃，與萆薢合用宣化濕濁，開通郁結；血不利則為水，濕濁毒邪充斥三焦，氣滯則水停血瘀，血瘀又會進一步加重水腫，瘀血不去，新血難生，故佐以紅花活血化瘀。諸藥合用，共奏理氣活血、通腑瀉濁之功，可以改善ESRD患者的臨床癥狀，減輕服用激素的副作用并延長患者進入透析的時間。

GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中收錄了眾多生物醫學的基因數據，內含多種疾病的原始基因表達數據集和平臺操作記錄，而網絡藥理學可以預測藥物活性成分的生物靶點[7]，二者結合可以從整體上分析加味蘇連溫膽湯治療ESRD的潛在作用機制，可為臨床上應用加味蘇連溫膽湯治療ESRD提供參考。

1 材料與方法

1.1 加味蘇連溫膽湯活性成分的篩選 將加味蘇連溫膽湯中的蘇葉、黃連、半夏、萆薢、紅花5種藥物成分，分別輸入中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中進行成分檢索[8]，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)值≥0.18作為條件篩選出加味蘇連溫膽湯的活性成分，物種限定為 “Homo sapiens”。

1.2 加味蘇連溫膽湯活性成分潛在作用靶點的獲取 利用TCMSP數據庫獲取加味蘇連溫膽湯活性成分的潛在作用靶點，借助UniProt數據庫(http://www.uniprot.org)除去沒有相應靶點的活性成分，然后應用Perl軟件(V5.24.1)為篩選出的靶點添加基因名并規范靶點的基因名。

1.3 ESRD組織與正常腎臟組織差異基因的獲取 根據樣本量及相關條件(樣本量≥20，選擇芯片的表達數據陣，選擇物種為人)，在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中選取與ESRD有關的芯片GSE37171，下載相關平臺的數據后，利用R語言軟件(V3.6.2)設定篩選條件為P值<0.05、|log2FC|>1，得到ESRD組織與正常腎臟組織的差異基因(簡稱ESRD差異基因)文件“diff”，然后運用R語言軟件中的pheatmap包，分別篩選出上調與下調最顯著的20個基因，繪制ESRD差異基因的熱圖，運用R語言軟件中的plot包繪制火山圖。

1.4 藥物靶點與ESRD差異基因的韋恩圖的繪制 利用R語言軟件(V3.6.2)對加味蘇連溫膽湯活性成分的潛在作用靶點與ESRD差異基因取交集，得到的交集基因即為加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點，將映射結果以韋恩圖的形式展示。

1.5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的調控網絡和拓撲分析 將1.4中的交集基因導入到CytoScape 3.7.0軟件中，構建活性成分-疾病靶點調控網絡圖。使用Bisogenet和CytoNCA兩個插件，構建交集基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，對交集基因設置相應參數[度中心度(degree centrality，DC)>61，中間中心度(betweenness centrality，BC)>600)]構建相應的拓撲網絡，篩選出度值最高的基因為核心作用靶點。

1.6 功能和通路富集分析 采用R語言軟件(V3.6.2)的“ggplot”和“clusterProfiler”包對得到的交集基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析(包括細胞組分、分子功能、生物過程)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05 為差異有統計學意義，繪制相應的柱狀圖和氣泡圖。

2 結 果

2.1 加味蘇連溫膽湯的活性成分及其潛在作用靶點 共篩選得到加味蘇連溫膽湯的活性成分2 763個，其中槲皮素為紅花、黃連共有的有效成分，黃芩苷元為半夏、紅花共有的有效成分。獲得有效活性成分的潛在作用靶點共457個。

2.2 ESRD差異基因 從GEO數據庫下載GSE37171芯片及平臺數據，共獲得115個樣本，其中正常腎臟組織40個，ESRD組織75個，運用R語言軟件對兩組樣本進行分析，共得到422個ESRD差異基因，其中包括98個上調基因，324個下調基因。差異基因熱圖見圖1，火山圖見圖2。

圖1 ESRD差異基因的熱圖

圖2 ESRD差異基因的火山圖

2.3 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點 利用R語言軟件取交集后共獲得10個交集基因(即加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點)，分別為Fos原癌基因轉錄因子AP-1亞基(Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，FOS)、缺氧誘導因子1α亞基(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)、保守螺旋環螺旋結構域擴散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、RAS P21蛋白激活因子1(RAS P21 protein activator 1,RASA1)、晶狀體蛋白ζ(crystallin zeta,CRYZ)、C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)、α-突觸核蛋白(synuclein alpha,SNCA)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)、E1A結合蛋白P300(E1A binding protein P300,EP300)、中鏈?；o酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase medium chain,ACADM)。映射結果的韋恩圖見圖3。

圖3 加味蘇連溫膽湯有效活性成分潛在作用靶點與ESRD差異基因的韋恩圖

2.4 加味蘇連溫膽湯活性成分-疾病靶點的調控網絡 將加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點導入CytoScape軟件中，構建出活性成分-疾病靶點的調控網絡(見圖4)，10個作用靶點對應有效成分13個，包括烏索酸、1-檸檬烯、肉豆蔻酸、肉桂醛、黃芩苷元、芹黃素、孕酮、槲皮素、薯蕷皂甙元、蛇床子素、辛酸、乙酸葑酯、迷迭香酸，其中10個來自于蘇葉，1個來自于萆薢，2個為多種藥物共有，如圖4所示。其中槲皮素(MOL000098)對應的靶點最多，可認為槲皮素是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的關鍵作用成分。

圖4 加味蘇連溫膽湯活性成分-疾病靶點的調控網絡

2.5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的拓撲網絡 將加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點導入到CytoScape 3.7.0軟件中，使用Bisogenet和CytoNCA兩個插件，構建交集基因的PPI網絡，如圖5(1)。將DC設置為>61，BC設置為>600，構建其拓撲網絡，共得到7個候選基因，如圖5(3)。其中EP300的度值最高，提示EP300是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的核心作用靶點。

圖5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的拓撲網絡構建過程

2.6 GO功能富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點共涉及399種生物過程、10種分子功能、1種細胞組分。其中生物過程包括細胞對氧化應激的反應等，分子功能包括Tau蛋白連接等，細胞組分為轉錄因子復合物。見圖6、圖7、圖8。

圖6 GO功能富集分析-生物過程分析結果

圖7 GO功能富集分析-分子功能分析結果

圖8 GO功能富集分析-細胞組分分析結果

2.7 KEGG通路富集分析結果 KEGG富集分析結果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點主要涉及脂肪酸降解通路，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路，氣泡圖見圖9。

圖9 KEGG通路氣泡圖

3 討 論

ESRD的主要病因是腎小球腎炎、慢性間質性腎炎、糖尿病腎病和高血壓腎硬化等，涉及的病理變化包括腎小球間質纖維化、局灶性和節段性腎小球硬化、腎小管萎縮等[9]。晚期ESRD患者多會進入到尿毒癥階段，即慢性腎臟病腎功能衰竭的終末階段。腎臟的濾過和代謝功能減退、毒素堆積及腎臟內分泌功能障礙均會引發電解質紊亂、酸堿代謝失衡和水鈉潴留等現象，嚴重者可危及生命。目前，除腎移植和腹膜透析治療外，維持性血液透析是延長大部分晚期ESRD患者生存期的主要方法[10]。雖然應用透析治療有助于提高ESRD患者的生存率，但與普通人群相比，這些患者的生活質量明顯降低[11]，且透析并不能解決全部問題，ESRD患者常伴有多種并發癥，如腎性貧血、皮膚瘙癢、納差、惡心嘔吐、不寧腿綜合征、高血壓等，且至后期更為明顯，嚴重影響患者的生活質量。然而，目前臨床亦缺乏有效的針對性靶向治療。

中藥復方的組合形式往往多種多樣，每一味藥物含有的有效活性成分不同，在治療疾病時具有多成分、多靶點、多通路的作用特點。中藥復方往往是治療ESRD這類受多種病理機制共同影響的疾病的重要方法，并且具有服用方便、副作用小的優勢，能有效地緩解癥狀，從而提高患者的生活質量。但由于中藥復方成分、治療靶點、作用機制均復雜，傳統藥理學方法很難從整體的角度探討加味蘇連溫膽湯的潛在生物學機制，尤其是相互關聯的生物分子網絡的調控。而生物信息學的方法可以很好地解決這一問題。因此本研究基于網絡藥理學和生物信息學的方法，尋找藥物與疾病的共同基因，探討中藥復方多途徑治療ESRD的分子靶點及作用機制，以期進一步促進其在臨床上的應用與相關機制的研究。

本研究共篩選出加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點，及其對應的13個活性成分，主要活性成分包括槲皮素、孕酮、黃芩苷元、芹黃素等，其中槲皮素對應多個作用靶點，如FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1α、EP300等，提示槲皮素很可能是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的關鍵多效活性化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎癥、抗應激反應等作用，Yang等[12]發現，槲皮素除了可預防腎小管損傷和慢性間質炎癥，還具有預防蛋白尿和改善腎功能的作用，其可劑量依賴性地抑制成纖維細胞生長因子23和甲狀旁腺激素，這兩種物質在調節腎臟的鈣和磷含量中都起著至關重要的作用，而調節血液中的鈣、磷含量對于治療腎性骨病也有一定作用。研究顯示，與其他性激素相比，內源性孕酮可增強女性對腎損害的抵抗，外源性孕酮也具有顯著的抗氧化和腎保護作用，孕酮主要通過存在于腎單位中的膜孕酮受體α和γ發揮腎保護作用，參與調節腎功能，對缺血再灌注所致的大鼠急性腎損傷起著保護腎臟的作用[13]。而黃芩苷元也被證實可減少晚期氧化蛋白產物的積累，具有下調炎癥細胞因子表達，以及保護腎小管上皮細胞免受氧化應激損傷的作用[14]。芹黃素則可在體內外發揮改善腎功能的作用，不僅可防止腎小管細胞凋亡，還能夠減輕腎缺血再灌注損傷后腎小管細胞壞死、胞漿空泡化、腎小管上皮細胞空泡化等嚴重的腎損傷表現[15]。加味蘇連溫膽湯對ESRD的治療作用可能與上述成分具有保護腎臟的作用有關。

本研究共獲得10個加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點，分別為FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1、CRYZ、CXCR4、SNCA、TLR4、EP300、ACADM；為了得到更精準的結果，在PPI網絡構建中，通過設置DC與BC兩個參數，最終確定了以EP300、BRCA1、TP53、ESR1、HSP90AA1、CUL3、NTRK1為主要基因的拓撲網絡，其中EP300的度值最高，提示EP300是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的核心作用靶點。研究表明，EP300是人類纖維化的重要調節因子，調節肌成纖維細胞的多種生物過程，并在調節細胞外基質的產生與降解過程中發揮重要作用，可以導致腎臟纖維化[16-17]。在腎細胞癌的細胞中，EP300與穩定的低氧誘導因子1形成復合物，參與調控與腎透明細胞癌進展相關的基因編碼因子的表達，如血管內皮生長因子、碳酸酐酶9和促紅細胞生成素[18]。加味蘇連溫膽湯可能是通過調控EP300來發揮抗腎臟纖維化、抑制血管內皮生長因子表達、減少細胞外基質沉積的作用。

GO富集分析結果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用與細胞對氧化應激的反應等生物過程，轉錄因子復合物等細胞組分，以及Tau蛋白連接等分子功能相關。氧化應激是指引起細胞損傷的高度反應性氧化分子的累積效應[19]，其參與了IgA腎病的發病機制[20]，也可作為炎癥機制的重要組成部分對ESRD患者發生貧血有一定影響，是導致血液透析患者尿毒癥發生率和病死率升高的主要因素[21]。復雜轉錄因子是能夠以序列特異性方式結合DNA并且調節轉錄的一系列蛋白質。例如，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α是一種控制線粒體生物發生的轉錄因子，在一些腎臟疾病中具有保護腎臟的作用，可以減輕因線粒體變化而引起的急性腎損傷[22]。血管轉錄因子ETS原癌基因1轉錄因子(ETS proto-oncogene 1 transcription factor，ETS-1)是受血管緊張素Ⅱ調控的轉錄因子，研究表明血管緊張素Ⅱ對腎纖維化、炎癥和氧化應激的誘導作用，有一部分是通過ETS-1介導的；ETS-1還參與了急性腎衰竭中腎小管再生的調控，而減少腎臟表達的ETS-1可以預防高血壓相關的腎臟損傷[23]。Tau蛋白是一種多功能蛋白，屬于與微管結合的原生未折疊微管相關蛋白家族，參與微管的組裝并維持其穩定，廣泛表達于中樞和外周神經系統，但也存在于腎臟、肺和睪丸[24]。既往有關Tau蛋白的研究多是針對阿爾茨海默病的，但本研究結果提示Tau蛋白可能也與慢性腎臟病的發生有關。

KEGG分析結果顯示，加味蘇連溫膽湯主要是通過調節脂肪酸降解通路，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路來治療ESRD。炎癥和代謝失調是腎臟疾病最重要的特征。體外實驗表明，脂肪酸氧化調節因子可以抑制腎小管上皮細胞腺嘌呤核苷三磷酸耗竭、細胞死亡、腎小管上皮細胞去分化和細胞內脂質沉積，而恢復脂肪酸代謝，可以保護小鼠免受腎小管間質纖維化的影響[25]。脂肪酸結合蛋白4在 IgA腎病患者腎小球組織中的表達水平顯著高于無內皮增生性病變的患者[26]。此外，腎臟參與了氨基酸代謝的過程，其能夠精細調控循環組織池中的氨基酸，對體內氨基酸的代謝平衡起到至關重要的作用；當腎臟功能受損時易發生氨基酸代謝紊亂，其中，腎實質發生病變時血漿中氨基酸譜亦會發生改變[27]。研究表明，2～3期慢性腎臟病患者體內瓜氨酸含量明顯升高，而色氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸，以及氨基丁酸、甘氨酸等非必需氨基酸含量均明顯降低[28]。同時，糾正患者體內的氨基酸代謝平衡，也是維持腎臟功能的重要手段。

綜上所述，加味蘇連溫膽湯中的多種活性成分可能通過與EP300、FOS、HIF-1α等10個交集基因相互作用，調控細胞對氧化應激的反應等生物過程，轉錄因子復合物等細胞組分，Tau蛋白連接等分子功能，進而單獨或者共同調控脂肪酸降解通路及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路來發揮治療ESRD的作用。但既往的研究極少涉及本研究獲得的KEGG通路，今后可進一步研究這些通路在ESRD治療中的作用。由于本研究為基于網絡藥理學和生物信息學的研究，加味蘇連溫膽湯的具體有效成分及其作用機制還有待更深入、更細化地挖掘，并需要進行相關實驗佐證。