推拿對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制▲

龍炳材 陳曉紅 唐宏亮 楊 鵬 吳娉婷 王雄將 盧棟明

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧市 530001；2 防城港市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，廣西防城港市 538000；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治未病中心，廣西南寧市 530023)

在我國(guó)，慢性疼痛發(fā)病率超過(guò)30%，并呈逐年上升趨勢(shì)[1]，而約1/5的慢性疼痛由神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)引起[2]。NPP是由軀體感覺(jué)系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的疼痛，發(fā)病率約為8%[3]。神經(jīng)損傷和炎癥導(dǎo)致的疼痛讓NPP患者在感官上深受折磨，并可能進(jìn)一步影響患者肢體的運(yùn)動(dòng)功能，甚至致殘，嚴(yán)重影響患者的身體和心理健康，增加其家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前用于治療NPP的方法的臨床療效欠佳[4]，因此，亟須尋求一種高效的NPP治療方法，以減輕患者的身心痛苦。推拿是安全性較高、副作用較少的中醫(yī)外治療法，其治療NPP的有效性和安全性已在臨床上得到驗(yàn)證[5-7]，但推拿的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究目前仍處于起步階段。自噬是細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行代謝的重要過(guò)程，具有雙向調(diào)節(jié)作用：一方面，細(xì)胞可以通過(guò)適度的自噬來(lái)清除受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8]；另一方面，過(guò)度激活的自噬則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，甚至成為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的途徑[9]。大量研究證實(shí)，自噬調(diào)節(jié)作用失衡可以產(chǎn)生大量炎癥因子，并導(dǎo)致神經(jīng)損傷，從而引起NPP的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。有文獻(xiàn)報(bào)告，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)BRAF活化的非編碼RNA(BRAF-activated non-coding RNA,BANCR)可以調(diào)控自噬和炎癥的發(fā)生[12]，因此我們?cè)O(shè)想推拿是否是通過(guò)調(diào)節(jié)BANCR的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控自噬及炎癥發(fā)揮治療NPP的作用。為此，本研究建立L5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)疼痛模型大鼠，觀察推拿對(duì)SNL大鼠脊髓背角組織BANCR、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)Ⅱ、p62蛋白及血清炎癥因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β表達(dá)水平的影響，旨在探討推拿的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：雌性SD大鼠30只，體重 250～300 g，均購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004；使用許可證：SYXK(桂)2019-0001]。老鼠在適宜環(huán)境條件下喂養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、SNL組、推拿組、假推拿組，每組6只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的有關(guān)條例。

1.1.2 藥品與試劑：Life TRIzol Reagent RNA提取試劑(美國(guó)Life Invitrogen公司，貨號(hào)：15596026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司，貨號(hào)：638313)、SYBR Green PCR熒光試劑(日本Takara公司，貨號(hào)：RR820A)、兔抗大鼠LC3Ⅱ抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：14600-1-AP)、兔抗大鼠p62抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：18420-1-AP)、二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司，貨號(hào)：P0010S)、RIPA蛋白裂解液(上海碧云天公司，貨號(hào)：P0013B)、蛋白酶抑制劑(上海碧云天公司，貨號(hào)：ST506)、TBST緩沖液(北京索萊寶公司，貨號(hào)：T1080)，ECL發(fā)光法試劑盒(上海碧云天公司，貨號(hào)：P0018S)。

1.1.3 儀器設(shè)備：低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司，型號(hào)：Sigma 3-18KS)、酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：Elx800)、NanoDrop儀器(美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)：ND-ONE-W)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司，型號(hào)：Roche LightCycler96)、電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：1658034)、凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)：ChemiDoc XRS)、按摩推拿手法模擬儀(中國(guó)人民共和國(guó)發(fā)明專利號(hào):ZL 200710187403.1)。

1.2 研究方法

1.2.1 SNL大鼠模型的制備：參照Shi等[13]的手術(shù)方法，對(duì)SNL組、推拿組、假推拿組實(shí)施手術(shù)，建立SNL大鼠模型。稱重各組大鼠后，均給予適量的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，待麻醉起效后，將大鼠固定于手術(shù)板上，定位兩側(cè)髂后上脊，并以此為中心用電動(dòng)剃刀在上下3 cm范圍剃毛備皮，常規(guī)消毒，在左側(cè)髂后上棘與脊柱之間，做一個(gè)平行于脊柱的縱行切口，長(zhǎng)度約2 cm，將皮膚、筋膜、肌肉鈍性分離，暴露L4～6脊椎左側(cè)的橫突，用咬骨鉗夾斷橫突和椎體之間的連接即可看到兩條并行的脊神經(jīng)，鈍性分離內(nèi)側(cè)脊神經(jīng)，用5-0的可吸收性羊腸線雙層結(jié)扎，最后用生理鹽水清洗傷口后逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后觀察到大鼠足跖部有明顯的外翻和避免患肢著地、跛行等異常行為，同時(shí)大鼠在熱痛測(cè)量板上出現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間舔足，不停地甩足，大部分大鼠可在無(wú)任何刺激的情況下發(fā)生自發(fā)性的抬足反射，提示SNL大鼠造模成功。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程中僅暴露L4～6但不予結(jié)扎，正常組不進(jìn)行手術(shù)和結(jié)扎。

1.2.2 干預(yù)方法：(1)推拿組。術(shù)后第1天，用布袋束縛大鼠后，采用按摩推拿手法模擬儀依次刺激大鼠雙側(cè)足少陽(yáng)膽經(jīng)的環(huán)跳、風(fēng)市、陽(yáng)陵泉三穴；手法模擬為點(diǎn)法、撥法、揉法；刺激力量為4 N。按摩推拿手法模擬儀按摩頭選用直徑為10 mm的圓形光滑接觸面。每法每穴刺激1 min，每只大鼠每日治療三穴三法，總計(jì)18 min(雙側(cè))，連續(xù)干預(yù)7 d。(2)假推拿組。術(shù)后第1天，采用布袋每天束縛并輕輕撫摸大鼠雙后肢18 min，連續(xù)干預(yù)7 d。(3)正常組、假手術(shù)組和SNL組。不進(jìn)行干預(yù)，觀察7 d。

1.2.3 熱痛閾值的測(cè)定：分別于術(shù)前、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d測(cè)定大鼠的熱痛閾值[14]。室溫設(shè)定為25 ℃，將熱板痛覺(jué)測(cè)試儀溫度調(diào)至55 ℃，將大鼠放置于測(cè)試儀的封閉且透明玻璃箱內(nèi)并啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。當(dāng)觀察到大鼠出現(xiàn)快速抬腳、頻繁舔足等行為表現(xiàn)時(shí)停止計(jì)時(shí)并做好記錄。以此作為大鼠熱痛縮足反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)，PWTL越長(zhǎng)熱痛閾值越高。各觀察點(diǎn)連續(xù)檢測(cè)每只大鼠PWTL 3次，兩次檢測(cè)之間間隔5 min，取平均值作為該觀察點(diǎn)的PWTL。

1.2.4 大鼠機(jī)械性刺激反應(yīng)閾值的測(cè)定：分別于術(shù)前、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d測(cè)定大鼠的機(jī)械性刺激反應(yīng)閾值[15]。將鐵絲網(wǎng)籠子(籠子的大小為可以讓大鼠有充分的活動(dòng)空間)置于高出臺(tái)面30 cm的實(shí)驗(yàn)桌臺(tái)上，放入大鼠，待大鼠適應(yīng)后，用不同粗細(xì)的Von Frey纖維絲(分別代表不同的刺激強(qiáng)度)，從鐵絲籠底部穿過(guò)，直接刺激大鼠后足的中心部分。選用的刺激強(qiáng)度從小至大，在同一強(qiáng)度刺激下，大鼠出現(xiàn)3次或3次以上的縮足反應(yīng)記為陽(yáng)性，反之為陰性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次刺激強(qiáng)度的平均值作為該觀察點(diǎn)的機(jī)械性刺激縮足閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)，PWMT越大機(jī)械性刺激反應(yīng)閾值越高。

1.2.5 大鼠L4～6脊髓組織BANCR表達(dá)水平的檢測(cè)：干預(yù)后第7天斷頭處死各組大鼠,迅速取出L4～6脊髓組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∑渲幸徊糠纸M織，加入1 mL TRIzol試劑將組織研磨成勻漿后，按試劑說(shuō)明書(shū)提取RNA，使用NanoDrop儀器測(cè)定RNA濃度和純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)GenBank的基因序列設(shè)計(jì)引物，由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司合成并純化，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為20 μL,包括Nuclease-Free Water 7.2 μL、上下游引物各0.4 μL、GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s、退火60.5 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析以評(píng)價(jià)PCR產(chǎn)物的特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算BANCR的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)脊髓組織中LC3和p62蛋白的表達(dá)水平：取1.2.5中的部分脊髓組織，加入適量RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑進(jìn)行研磨勻漿，以12 000 r/min離心15 min分離上清液，采用二喹啉甲酸測(cè)定蛋白濃度，把制備好的蛋白樣品放在-20 ℃冰箱中保存。配制12%的分離膠與5%的濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整蛋白上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳條件為濃縮膠采用電壓80 V，電泳40 min，分離膠采用電壓120 V，直到溴酚藍(lán)跑到膠底。電泳結(jié)束后在300 mA電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用5%的脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h后，將PVDF膜分別與LC3Ⅱ(1∶2 000)、p62(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)抗體稀釋液混合，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。滴加500 μL ECL顯影劑后放入顯影儀顯影。應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 ELISA檢測(cè)血清炎癥因子IL-1β的表達(dá)水平：斷頭處死各組大鼠并獲取脊髓標(biāo)本后，采集腹主動(dòng)脈血，室溫下以12 000 r/min 離心15 min，收集血清，采用ELISA檢測(cè)血清IL-1β的表達(dá)水平，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。所有試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠熱痛閾值的比較 術(shù)前，各組大鼠的PWTL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1 d，SNL組、推拿組、假推拿組、假手術(shù)組的PWTL均較正常組降低(均P<0.05)。術(shù)后3 d，SNL組、推拿組、假推拿組、假手術(shù)組的PWTL均較正常組降低，且SNL組、推拿組、假手術(shù)組的PWTL依次升高(均P<0.05)，而SNL組和假推拿組的PWTL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后 7 d，SNL組、推拿組、假推拿組的PWTL均較正常組降低，且推拿組的PWTL高于SNL組(均P<0.05)，但假手術(shù)組的PWTL與正常組比較，以及SNL組和假推拿組的PWTL比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠PWTL的比較(x±s，s)

2.2 各組大鼠機(jī)械刺激反應(yīng)閾值的比較 術(shù)前，各組大鼠的PWMT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后1 d、3 d，其他各組的PWMT均較正常組降低，而假手術(shù)組的PWMT高于SNL組、推拿組、假推拿組，術(shù)后3 d推拿組的PWMT高于SNL組(均P<0.05)。術(shù)后7 d，SNL組、推拿組、假推拿組的PWMT均較正常組降低，但推拿組的PWMT高于SNL組(均P<0.05)，而假手術(shù)組的PWMT與正常組比較，以及SNL組和假推拿組的PWMT比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠PWMT的比較(x±s，g)

2.3 各組大鼠術(shù)后7 d脊髓組織BANCR表達(dá)水平的比較 干預(yù)7 d后，SNL組、推拿組、假推拿組脊髓組織中BANCR的表達(dá)水平均較正常組升高，而推拿組、假推拿組脊髓組織中BANCR的表達(dá)水平低于SNL組(均P<0.05)，但假手術(shù)組脊髓組織中BANCR的表達(dá)水平與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠術(shù)后7 d L4～6脊髓組織中BANCR相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平的比較 術(shù)后7 d,與正常組相比,SNL組的脊髓組織p62蛋白表達(dá)水平升高，LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)水平降低；與SNL組相比，推拿組、假推拿組和假手術(shù)組的脊髓組織p62蛋白表達(dá)水平均降低，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。推拿組脊髓組織p62蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表5。

圖1 各組大鼠脊髓組織p62、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)情況

表5 各組大鼠脊髓組織中p62、LC3Ⅱ相對(duì)表達(dá)水平(x±s)

2.5 各組大鼠血清IL-1β表達(dá)水平的比較 術(shù)后7 d，SNL組的血清IL-1β表達(dá)水平較正常組升高，推拿組和假手術(shù)組的血清IL-1β表達(dá)水平較SNL組降低(均P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠術(shù)后7 d血清IL-1β表達(dá)水平的比較(x±s，pg/mg)

3 討 論

NPP的病理學(xué)基礎(chǔ)是神經(jīng)損傷與炎癥[16]，神經(jīng)受到損傷后產(chǎn)生的痛覺(jué)信號(hào)經(jīng)神經(jīng)傳入脊髓，刺激神經(jīng)細(xì)胞活化，誘導(dǎo)細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α等促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮的閾值降低，增加痛覺(jué)敏感[17]。IL-1β是經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子，可參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng)，在幾乎所有組織的細(xì)胞防御和組織修復(fù)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18-19]，IL-1β的表達(dá)水平可以反映炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。本研究中，術(shù)后7 d，SNL組大鼠的血清IL-1β表達(dá)水平較正常組升高，推拿組大鼠血清IL-1β的表達(dá)水平較SNL組降低；且術(shù)后3 d、7 d，SNL組大鼠的熱痛閾值和機(jī)械性刺激反應(yīng)閾值均較正常組下降，推拿組大鼠的熱痛閾值和機(jī)械性刺激反應(yīng)閾值均較SNL組升高(均P<0.05)。這說(shuō)明SNL大鼠發(fā)生神經(jīng)損傷后可導(dǎo)致IL-1β炎癥因子釋放堆積，炎癥反應(yīng)被激活從而誘發(fā)疼痛，而經(jīng)推拿干預(yù)后，IL-1β表達(dá)水平下降，炎癥減輕，疼痛得到緩解。

自噬是一種非常復(fù)雜的細(xì)胞自我保護(hù)的過(guò)程，可使機(jī)體有效地應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激狀態(tài)，幫助機(jī)體降解受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝平衡、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞正常的生理功能，但自噬受多種因素的影響，自噬被激活或抑制導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡是多種疾病(如NPP)發(fā)生的重要因素[8-9]。研究表明，當(dāng)NPP發(fā)生時(shí)，神經(jīng)損傷可導(dǎo)致細(xì)胞受損，大量受損的異常細(xì)胞堆積會(huì)刺激炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌進(jìn)而加重炎癥，這時(shí)，自噬被激活并清除損傷的細(xì)胞，減少炎癥因子的釋放從而達(dá)到抑制炎癥的目的[20-22]。BANCR是BRAF基因發(fā)生BRAF V600E位點(diǎn)突變后激活所產(chǎn)生的lncRNA，其定位于人類第9號(hào)染色體q21.11位點(diǎn)上，全長(zhǎng)693 bp。BANCR雖不編碼蛋白質(zhì)，但其通過(guò)作用于其他蛋白抑制或靶向相關(guān)信號(hào)通路，在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23]。Wang等[24]的研究表明，高表達(dá)的BRAF可以觸發(fā)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的過(guò)度激活，并通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用靶標(biāo)來(lái)啟動(dòng)自噬。盡管目前還沒(méi)有直接證據(jù)支持這一結(jié)論，但BANCR普遍被認(rèn)為是在細(xì)胞中調(diào)控自噬的關(guān)鍵。如有研究報(bào)告，BANCR參與自噬的調(diào)控，抑制BANCR會(huì)激活自噬[25]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)7 d后,SNL組、推拿組、假推拿組脊髓組織中BANCR的表達(dá)水平均較正常組升高，但推拿組脊髓組織BANCR的表達(dá)水平低于SNL組(均P<0.05)。提示BANCR可能參與了NPP的發(fā)生和發(fā)展，而推拿可能通過(guò)調(diào)節(jié)BANCR的表達(dá)起到鎮(zhèn)痛的效果。

LC3存在于自噬小體和自噬小體膜表面，參與自噬小體膜的再生和延展。其主要以LC3Ⅰ、LC3Ⅱ兩種形式存在，且兩種形式可以相互轉(zhuǎn)化，當(dāng)發(fā)生自噬時(shí)，LC3Ⅰ會(huì)與自噬小體膜表面的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合﹐從而轉(zhuǎn)換成LC3Ⅱ，參與了自噬小體膜的形成[26]。LC3Ⅱ存在于胞內(nèi)自噬小體膜上，其含量與自噬小體膜的數(shù)量呈正相關(guān)。因此,通常以LC3Ⅱ的水平作為反映自噬活化情況的重要指標(biāo)。p62作為自噬特異性底物，在細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，p62與細(xì)胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合后再與自噬小體膜上的LC3Ⅱ蛋白相結(jié)合形成復(fù)合物，細(xì)胞內(nèi)的p62水平也隨之降低，之后在自噬溶酶體中隨降解底物一同被降解[27]。因此，當(dāng)細(xì)胞自噬被抑制時(shí)，會(huì)導(dǎo)致p62在細(xì)胞內(nèi)大量堆積[28]。本研究結(jié)果顯示，SNL組的LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平低于正常組，p62蛋白表達(dá)水平高于正常組(均P<0.05),提示SNL大鼠機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞自噬受到抑制。而經(jīng)推拿干預(yù)后,大鼠的LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，p62蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示推拿可能通過(guò)激活細(xì)胞自噬來(lái)緩解疼痛。

中醫(yī)有“開(kāi)闔統(tǒng)百病，樞統(tǒng)開(kāi)闔”之說(shuō)，足少陽(yáng)膽經(jīng)為少陽(yáng)樞經(jīng)，有“四兩撥千斤”之用，可樞調(diào)經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血，消除誘發(fā)疼痛的“不通”“不榮”，是臨證治療NPP的關(guān)鍵經(jīng)絡(luò)。本研究選取足少陽(yáng)膽經(jīng)的環(huán)跳、風(fēng)市、陽(yáng)陵泉3個(gè)穴位對(duì)SNL大鼠進(jìn)行推拿干預(yù)，結(jié)果顯示，推拿可減輕SNL大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，降低脊髓組織BANCR的表達(dá)水平，上調(diào)自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)水平和下調(diào)p62蛋白表達(dá)水平，減少炎癥因子IL-1β的分泌。這提示推拿可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的相關(guān)通路，進(jìn)而達(dá)到阻斷NPP傳導(dǎo)的作用。這一結(jié)論或可從分子水平進(jìn)一步闡釋推拿治療NPP的鎮(zhèn)痛機(jī)制，為推拿在臨床治療NPP中的應(yīng)用和推廣提供更加客觀、科學(xué)的理論依據(jù)。但本研究?jī)H觀察了推拿對(duì)SNL大鼠痛閾和BANCR表達(dá)水平早期的影響，缺乏對(duì)中后期的持續(xù)觀察，未能完整地揭示推拿對(duì)不同發(fā)展階段NPP的鎮(zhèn)痛機(jī)制，在研究的深度和廣度上尚存不足，未來(lái)需進(jìn)一步完善相關(guān)研究。

綜上所述，推拿可減輕SNL大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng),其可能通過(guò)抑制BANCR的表達(dá)，以及上調(diào)自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)和下調(diào)p62蛋白表達(dá),從而激活自噬,清除促炎因子IL-1β的堆積,進(jìn)而達(dá)到阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)的作用。