高通量測序在膿毒癥患者病原學診斷中的應用價值及測序結果的影響因素▲

陳維覺 蔣玲玉 鐘永瀧 寧中心 韓 林

(1 廣西桂平市人民醫院重癥醫學科，廣西桂平市 537200；廣西壯族自治區人民醫院2 重癥醫學科，3 胸外科，廣西南寧市 530021)

膿毒癥是急危重癥醫學的重要疾病，2017年全球約有4.89千萬病例[1]。該病病情進展迅速，病死率甚至超過25%[2-3]。謝劍鋒和邱海波團隊[4]進行了多中心調查，結果顯示，我國膿毒癥患者約占ICU收治患者的20%，且90d病死率高達35.5%。膿毒癥主要表現為機體對感染反應失調所致的危及生命的器官功能障礙，盡早明確病原學后早期進行針對性的抗感染治療是治療膿毒癥的關鍵[5]，是避免“廣覆蓋、大包圍”的抗感染策略致抗生素多用、濫用的有效措施。隨著科學技術的發展，近年來病原菌的高通量測序檢查嶄露頭角，該技術又稱下一代測序，具有檢測陽性率較高及可同時檢測多種病原菌的優點，為指導臨床制定抗感染方案提供重要信息[6]。但目前有關膿毒癥患者血培養及高通量測序在臨床上應用價值的對比研究報告較少，且國內鮮見有關評估高通量測序技術病原學檢測效果影響因素的研究報告。因此，本研究分析了高通量測序技術檢查對膿毒癥患者病原學檢測的價值，并探索影響膿毒癥患者高通量測序檢查結果的臨床因素，從而提高高通量測序的臨床診斷效率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年12月至2019年12月廣西壯族自治區人民醫院ICU收治的59例膿毒癥患者作為研究對象。納入標準：(1)符合膿毒癥的相關診斷標準[7]；(2)年齡≥18歲；(3)患者家屬同意行高通量測序檢查并簽署同意書。排除標準：哺乳期患者或者孕婦。其中男性39 例、女性20例，患者年齡18～87(54.73±18.09)歲；原發感染疾病為肺部感染33例、皮膚軟組織感染9例、腹部或腹腔感染6例、血流感染4例、泌尿系感染3例、顱腦和心臟感染各2例。所有患者家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究所涉及的研究方法均符合醫學倫理學原則，并獲得廣西壯族自治區人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 治療方法 給予所有患者膿毒癥集束化治療，包括液體復蘇、針對原發病治療、臟器功能支持、維持內環境穩定、營養支持及預防應激性潰瘍等綜合治療，根據患者循環功能、氧合指數情況給予血管活性藥物支持及呼吸機輔助呼吸治療。其中55例患者在入住我科前已行經驗性抗感染治療，其余4例患者被確診為膿毒癥后由急診直接入住我科?；颊呷胱∥铱坪?診斷后24 h內)立即予病原學檢測，根據病原學結果調整抗感染治療方案。

1.3 檢測方法及檢測結果的判斷標準 在患者被診斷為膿毒癥24 h內對其進行血培養，嚴格按照采血流程及規范，同時進行2個穿刺點抽取2套血培養標本，每套標本分別放入需氧和厭氧瓶中，每瓶8～10 mL，即“雙抽四瓶”，標本在2 h內運輸至微生物實驗室。同時抽取5～10 mL血液樣本放入基因檢測專用的采血管并保存于4 ℃環境，由專業人員送至華大基因、廣州賽哲生物有限公司和金匙基因公司進行高通量測序。血培養陽性的定義：培養出病原菌，且排除污染。高通量測序陽性的定義：檢測出多種病原體，只要有1種或以上病原體符合臨床表現，并進行相應抗感染治療調整；高通量測序陰性定義：高通量測序雖檢測出病原體(包括病毒、背景菌等)，但與臨床癥狀不符，未根據高通量測序結果進行抗感染方案調整。由兩位副主任醫師結合臨床表現、感染指標(包括最高體溫、血常規、C反應蛋白、降鈣素原水平)、檢測結果共同判斷檢測結果是否可信，若出現分歧則由第3名副主任醫師再次審核決定。

1.4 觀察指標 觀察指標包括患者的一般信息(性別、年齡、最高體溫)、病原體檢測情況，診斷為膿毒癥后24 h內的序貫器官衰竭評估(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)評分、急性生理與慢性健康評估(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation,APACHE)Ⅱ評分及血常規、降鈣素原、C反應蛋白水平，以及檢測前抗感染治療情況(包括是否接受抗感染治療、抗感染治療的天數)、臟器功能支持情況。其中，臟器功能支持情況包括使用機械通氣、血管活性藥物、連續性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)的情況。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗,非正態分布資料以M(Q)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。采用Logistic回歸模型分析評估高通量測序檢測效果的影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 59例膿毒癥患者的病原學檢測結果 經高通量測序檢測，所有患者的標本均檢出病原菌，其中檢出病毒的病例數最多(40例)，細菌次之(27例)，真菌病例數最少(14例)；高通量測序檢出的病原學種類高達30種，其中細菌14種、病毒9種、真菌5種、非典型病原體2種(衣原體和恙蟲病東方體)；檢測到的細菌種類以不動桿菌屬、肺炎克雷伯桿菌及腸球菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌為主，真菌則以耶氏肺孢子蟲為主，曲霉、念珠菌次之。見圖1。僅8例患者的血培養檢出病原菌，僅檢測出4種細菌(分別為銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌及屎腸球菌)和2種真菌(念珠菌和曲霉)。

圖1 59例膿毒癥患者高通量測序檢測到的各病原菌例數

2.2 兩種方法檢測結果的比較 在所有膿毒癥患者中，34例患者血培養或/和高通量測序陽性，25例患者血培養和高通量測序均為陰性。其中血培養和高通量測序同時陽性僅4例。高通量測序檢出陽性率為50.8%(30/59)高于血培養的 13.6%(8/59)(χ2=18.787，P<0.001)。見表1。

表1 59例膿毒癥患者的高通量測序和血培養檢出陽性率的比較[n(%)]

2.3 不同高通量測序結果的膿毒癥患者的臨床資料比較 與高通量測序陰性的患者相比，高通量測序陽性的患者中女性比例更高，使用血管活性藥物的例數更少(均P<0.05)。兩者在年齡、APACHEⅡ評分、SOFA評分、最高體溫、白細胞計數、中性粒細胞比例、降鈣素原水平、C反應蛋白水平、檢測前抗感染治療情況、檢測前抗感染治療的天數、使用CRRT和機械通氣使用情況的比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同高通量測序結果的膿毒癥患者的臨床資料比較

2.4 膿毒癥患者高通量測序結果的影響因素 以高通量測序是否陽性為因變量(陰性=0，陽性=1)，以年齡、最高體溫、白細胞計數、中性粒細胞比例、C反應蛋白、降鈣素原、APACHEⅡ評分、SOFA評分、檢測前接受抗感染治療情況作為自變量(抗感染情況：是=1、否=2，其他變量均為連續變量)，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，白細胞計數、中性粒細胞比例是血高通量測序陽性的影響因素(P<0.05)，其中中性粒細胞比例升高時血高通量測序陽性的概率增加，而白細胞計數的結果與臨床實際相反，考慮可能存在多重共線性，因此不進一步分析。見表3。

表3 膿毒癥患者高通量測序結果影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

膿毒癥患者的病情危重且病死率高，抗感染治療是重中之重，而檢測到致病菌以啟動針對性治療是確?？垢腥局委熜Ч闹匾Ｕ?，同時致病菌的類型決定了抗感染治療方案的選擇。本研究中，血高通量測序可檢測到30種病原體，檢出最多的是病毒，其次是細菌和真菌；此外，還有3例患者檢測出2種非典型病原體。已有較多研究證實高通量測序可檢測到病毒[8-9]。本研究中，有10例患者的病毒基因序列數大于50條，其中2例患者人皰疹病毒5型基因序列數分別為3 420條和666條，1例膿毒癥患者僅檢測出人腺病毒基因，其序列數達1 158條。同時有研究顯示，在93%的社區獲得性膿毒癥患者中發現屬于21個科共47種病毒的相關序列[10]?？梢?，病毒亦是膿毒癥的致病菌之一，但病毒如何影響膿毒癥的發生、發展，有待進一步研究。而在膿毒癥患者中，檢測到的細菌種類以不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等為主，真菌則以耶氏肺孢子蟲為主，念珠菌、曲霉次之。這與Long等[11]在膿毒癥患者中發現的病原菌種類相似，但主要致病菌有一定差異，可能與納入的膿毒癥患者存在的基礎疾病及不同ICU常見致病菌不同有關。總之，血高通量測序在檢測病原體種類上明顯優于血培養，而且彌補了血培養不能檢出病毒和非典型病原體的局限性。

血培養檢測較容易獲得標本以及時送檢，是臨床最常用的檢測方法之一，但是耗時久，臨床檢出陽性率偏低，因此有可能會延誤患者最佳診治時機。本研究59例膿毒癥患者中，血培養陽性率僅為13.6%，而高通量測序陽性率高達50.8%，這與Grumaz等[12]的研究結果相似。但在Grumaz等[12]的研究中血培養陽性率達30%，略高于本研究，可能是因為在該研究中有60%的血培養陽性菌屬于表皮菌群。高通量測序檢測2～3 d即可得結果，在本研究中，我們根據血高通量測序結果調整了30例膿毒癥患者的抗感染治療方案，從而提高了早期臨床針對性抗感染治療的比例，使近一半的患者避免長期使用廣譜抗感染治療。我們還發現，本研究中有25例(42.4%)膿毒癥患者兩種病原學方法檢測的結果均為陰性，提示對于部分膿毒癥患者即使同時使用這兩種病原學方法檢測，也可能無法獲得令人滿意的結果。因此，臨床醫師需對具體感染部位進行病原學檢測以提高陽性檢出率。

高通量測序結果受到多種因素影響，如樣本采集運輸過程、不同的樣本前期處理等[13]。但由于檢測方法特殊，在對用于高通量測序的樣本進行數據分析時，均須對疑似背景菌和可能污染的病原菌基因及序列進行分析，同時，所檢測的病原微生物低于檢測下限時，可能難以檢出待定微生物。為此，本研究對可疑背景微生物亦進行了綜合分析和排除，最終共30例患者的血高通量測序結果為陽性。有研究顯示，患者的臨床特征可影響培養結果，例如患者年齡、白細胞計數、采血時患者體溫[14]，以及高血壓、抗感染治療情況等[15]。因此，我們根據臨床經驗并結合相關研究結果，對可能影響血高通量測序結果的患者臨床因素進行了分析。Logistic回歸分析結果顯示，中性粒細胞比例是血高通量測序陽性的影響因素(P<0.05)，表明機體對感染反應越強，血高通量測序檢測陽性率越高。本研究結果還提示，SOFA評分和APACHEⅡ評分的高低、抗感染治療情況均對血高通量測序結果無明顯影響(均P>0.05)；檢測前接受抗感染治療的55例患者中，28例患者血高通量測序檢測陽性，陽性率超過50%，與Blauwkamp等[16]的研究結果相近。因此，無論疾病狀態如何，檢測前是否接受過抗感染治療，高通量測序技術均是臨床檢測膿毒癥病原菌的有效手段。另外，女性患者的血高通量測序陽性率較男性患者更高(P<0.05)，但目前原因不明；血高通量測序陽性患者中使用血管活性藥物的例數較少(P<0.05)，這間接表明循環功能穩定、組織灌注較好的患者，其機體中的致病菌基因序列更易釋放入血并利于檢出陽性結果。

總之，相比于傳統血培養，高通量測序是一種新興的診斷工具，有助于早期有效識別膿毒癥患者的致病菌，進而指導臨床制定抗感染方案，其將可能成為對ICU患者實施精準治療時必不可少的評估工具。當患者機體對感染存在一定反應、循環功能穩定或組織灌注較好時，更利于檢出陽性結果，因此建議在條件允許的情況下，盡早對膿毒癥患者進行高通量測序檢查以明確病原學，當循環功能衰竭嚴重時再進行檢測其檢測結果可能會受到一定的影響。但本研究仍存在一定缺陷，如高通量測序分析缺乏統一的標準，不能確定檢測的細菌是否已經死亡，檢測特異性較差；測序結果與疾病之間的關系需根據臨床經驗進行判斷，存在著人為的不確定性；此外，本研究樣本量較小，有待進一步開展大樣本研究以驗證所得結論。今后隨著相關標準的制定，檢測技術的進一步發展，這些不足將會得到改善，高通量測序在重癥感染患者診斷和治療方案的制定中將發揮更大的作用。