鼻咽癌組織中NOX4、miR-421的表達水平及其與患者臨床病理特征和放療敏感性的相關性▲

陳梅林 蘇貞紹 韋霞琳 梁 丹 林栓全

(欽州市第一人民醫院1 腫瘤內科，2 呼吸內科，廣西欽州市 535000)

鼻咽癌是鼻咽部常見的惡性腫瘤，發病率較高，常見癥狀有鼻涕帶血、通氣不暢等[1-3]。鼻咽癌的發病與遺傳、環境、飲食等多種因素有關，其早期臨床癥狀隱匿，大多數患者確診時病情已發展至中晚期[4-5]。放療是目前鼻咽癌的首選治療手段，隨著放療技術的不斷進步，鼻咽癌患者的局部控制率得到不斷提高，其預后也在一定程度上得到改善，但患者體質各異，對放療的敏感性參差不齊，因此療效和預后也不盡相同[6-8]。因此，尋找評估鼻咽癌放療效果的新型標志物成為研究的熱點。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成員之一，在多種腫瘤中均有表達，與腫瘤的發生和發展密切相關[9]。miR-421是具有促癌效應的miRNA，在多種腫瘤組織中呈高表達水平，能夠抑制癌細胞的凋亡、促進癌細胞的增殖[10]。本研究探討鼻咽癌組織中NOX4表達情況、miR-421的表達水平及其與患者臨床病理特征和放療敏感性的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年1月在我院就診的50例鼻咽癌患者作為病例組。納入標準：(1)經病理活檢確診為低分化鱗狀細胞癌；(2)均為初發鼻咽癌；(3)既往未接受過放化療等抗腫瘤治療。排除標準：(1)臨床資料不齊全者；(2)精神異?；蛘J知功能障礙者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)合并嚴重感染性及心、肝、腎等臟器疾病者。另選取同期在我院治療的30例慢性鼻咽炎患者作為對照組。納入標準：患者鼻腔黏膜充血、肥厚，伴有腫物或糜爛，鼻腔內有膿痂充塞，經鼻內鏡檢查確診為慢性鼻咽炎。排除標準：(1)近1個月內接受過地塞米松等藥物治療的患者；(2)對本次研究用藥有禁忌證者；(3)合并代謝性疾病者；(4)合并心、肝、腎等臟器疾病者。兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究已獲得我院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均對本研究知情同意。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2 治療方法 鼻咽癌患者接受常規放療：在CT模擬機下定位，在定位片上勾畫靶區，靶區采用面頸聯合野+下頸切線野。面頸聯合野照射至36～40 Gy后，縮野為小面頸野，推量至60 Gy，如果患者存在顱內、顱底侵犯則進一步縮野推量至70 Gy；下頸切線野一般照射至50 Gy。放療過程中應用擋鉛減少放射線損害。每天治療1次，每周治療5次，共治療35次。鼻咽炎患者給予經鼻霧化吸入治療：經鼻吸入布地奈德混懸液(Astra Zeneca公司，批號：H20090903)，每次1 mg(2 mL)，2次/d，每側鼻腔每次吸入時間約2.5 min(0.5 mg)，共約5 min，療程5 d。

1.3 免疫組化法檢測NOX4的表達情況 兩組患者經系統治療前進行組織活檢，將取得的病變組織置于4%多聚甲醛中固定，經石蠟包埋后制作成厚度為4 μm的切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法檢測病變組織中NOX4的表達情況：將石蠟組織切片分別浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ內各10 min，再依次浸入不同濃度酒精中水化5 min，PBS沖洗3次，3 min/次；然后置入檸檬酸鈉抗原修復緩沖液中進行抗原修復。在切片上滴加50 μL 3% H2O2，室溫避光孵育10 min，PBS緩沖液洗滌3次，3 min/次；擦干組織周圍的水分，滴加5%山羊血清，于室溫下孵育10 min后甩干。NOX4一抗孵育過夜(稀釋比例為1∶5 000，上海恒斐生物科技有限公司，批號：AR133303)，TBST液洗膜3次，10 min/次，將PBS作為一抗的陰性對照，室溫下辣根過氧化物酶標記山羊抗兔多克隆二抗(稀釋比例為1∶8 000，武漢博士德生物工程有限公司，批號：A0208)孵育2 h，TBST液洗膜3次，10 min/次，二氨基聯苯胺法顯色，將組織切片用蘇木素復染15 s后用流水沖洗3 min。在尼康SMZ745光學顯微鏡下(視野×200)隨機選取5個視野(每個視野細胞數不少于200個)進行觀察，細胞核呈棕黃色為陽性細胞，取5個視野細胞數平均值，計算陽性細胞百分比，陽性細胞百分比<5%定義為NOX4陰性表達，陽性細胞百分比≥5%定義為NOX4陽性表達。

1.4 實時熒光定量PCR檢測miR-421的表達水平 兩組患者經系統治療前進行組織活檢，取適量病變組織，采用miRNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：20200513)提取組織總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,批號：K1691)將RNA反轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：SR1110)進行實時熒光定量PCR擴增。miR-421上游引物序列為5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，下游引物序列為5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物為5′-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3′，下游引物為5′-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3′。反應體系共20 μL，包括cDNA模板2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，5×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，Nuclease-free H2O 6.8 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-421的相對表達水平。

1.5 鼻咽癌臨床分期和TNM分期的評價 治療前按照中國鼻咽癌2008分期標準[11]對鼻咽癌患者進行臨床分期，并采用美國癌癥聯合委員會2010年TNM分期標準[12]進行TNM分期。

1.6 鼻咽癌療效評價 鼻咽癌患者于放療結束后3個月復查鼻咽纖維鏡、鼻咽部CT或MRI，根據實體瘤臨床療效評價標準[13]進行療效評價，分為完全緩解、部分緩解、穩定、進展4個等級。療效達到完全緩解和部分緩解定義為放療敏感，穩定和進展定義為放療不敏感。

1.7 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者病變組織NOX4表達情況和miR-421表達水平的比較 病例組患者病變組織的NOX4陽性表達率和miR-421表達水平均高于對照組(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 兩組患者病變組織NOX4的表達情況和miR-421相對表達水平的比較

圖1 兩組患者病變組織中NOX4表達情況(免疫組化染色，×200)

2.2 NOX4、miR-421表達情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系 T3～4期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率及miR-421表達水平高于T1～2期患者(P<0.05)；N2～3期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率及miR-421表達水平高于N0～1期患者(P<0.05)；M1期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率和miR-421表達水平均高于M0期患者(P<0.05)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率及miR-421表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。見表3。

表3 NOX4、miR-421表達情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系

2.3 NOX4、miR-421表達情況與鼻咽癌患者放療敏感性的關系 根據實體瘤臨床療效評價標準將患者分為放療敏感組22例與放療不敏感組28例。放療敏感組鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率、miR-421表達水平均低于放療不敏感組鼻咽癌患者(均P<0.05)。見表4。

表4 NOX4、miR-421表達情況與鼻咽癌患者放療敏感性的關系

3 討 論

放療是鼻咽癌的主要治療手段，但不同患者體質存在差異，放療敏感性也參差不齊，放療敏感性較好的患者在放療后癌細胞增殖及轉移得到有效控制，病情緩解，預后得以改善，而放療敏感性較差的鼻咽癌患者在放療后仍存在癌細胞殘留、癌細胞轉移、病情復發等情況。NOX4是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成員之一，在多種腫瘤如膠質母細胞瘤、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等中呈高表達水平[14]。研究表明，結腸癌病灶中NOX4的表達水平升高與患者臨床特征和預后密切相關[15]；NOX4過表達是口腔鱗狀細胞癌患者手術切除病灶后預后較差的影響因素[16]。miR-421是與多種惡性腫瘤發生相關的miRNA，其在肺癌、乳腺癌、胃癌中均呈高表達水平[17-19]。目前，NOX4、miR-421在鼻咽癌中的作用機制尚不完全明確，故本研究探討鼻咽癌組織中NOX4、miR-421的表達水平及其與鼻咽癌患者臨床病理特征和放療敏感性的相關性。本研究對兩組研究對象的病變組織進行免疫組化檢測，發現NOX4主要定位于細胞核，并且病例組患者病變組織中的NOX4陽性表達率高于對照組，實時熒光定量PCR結果顯示病例組病變組織中的miR-421表達水平高于對照組(P<0.05)，這說明NOX4陽性表達及miR-421高表達水平與鼻咽癌的發生密切相關。本研究結果顯示，T3～4期、N2～3期、M1期、Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者病變組織中的NOX4陽性表達率和miR-421表達水平均分別高于T1～2期、N0～1期、M0期、Ⅰ～Ⅱ期患者(均P<0.05)，說明鼻咽癌患者病變組織中的NOX4陽性表達率及miR-421的表達水平與其臨床病理特征密切相關，這提示NOX4、miR-421可能參與了鼻咽癌的進展，兩者或許可作為評估鼻咽癌患者病情的標志物。

研究表明，鼻咽癌細胞對放療的敏感性與患者的預后密切相關[20-21]。目前臨床上尚缺乏可以反映鼻咽癌放療敏感性的敏感指標[22]。病理特征可以在一定程度上判斷鼻咽癌的惡性程度，但其對放療敏感性的預測價值有限[23-24]。有學者發現，NOX4能夠抑制腫瘤對放療的敏感性[25]。有研究顯示，NOX4的表達下調可以抑制膠質母細胞瘤的增殖、侵襲及腫瘤相關血管生成，提高其體外放射的敏感性[14]，使用 NOX4 抑制劑處理人類腎癌細胞可增強癌細胞對放療的敏感性[9]。本研究在放療后對鼻咽癌患者放療敏感性進行評價，并分析NOX4、miR-421與患者放療敏感性的關系，結果顯示，放療敏感的鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽性表達率、miR-421表達水平均低于放療不敏感的鼻咽癌患者(均P<0.05)，表明鼻咽癌患者病變組織中的NOX4及miR-421的表達情況與鼻咽癌細胞的放療敏感性具有相關性。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中NOX4、miR-421表達水平升高，NOX4、miR-421表達水平與鼻咽癌患者的臨床病理特征、放療敏感性密切相關。因此，靶向調控NOX4、miR-421表達水平或有可能改善鼻咽癌患者對放療的敏感性，進而減少放療后腫瘤的殘留和復發，改善鼻咽癌患者的生存預后。