酶法輔助乙醇提取廢次煙葉綠原酸的工藝研究

陳月星，黃金輝，閻佩云，張曉虎

（1.商洛學院生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西 商洛 726000；3.陜西省煙草公司商洛市公司洛南縣分公司，陜西 商洛 726100）

綠原酸在國際上被公認為“植物黃金”［1］，具有多種生物活性與藥理活性［2-4］，廣泛應用于醫藥保健和食品加工等各個領域。綠原酸（Chlorogenic Acid）分子式為C16H18O9，分子質量為354.30 Da，含有羥基和鄰二酚羥基，由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，又名咖啡鞣酸或咖啡單寧酸［5］，廣泛存在于各類植物組織中［6-9］。

煙葉綠原酸主要包含綠原酸（3-O-咖啡酰奎尼酸）、隱綠原酸（4-O-咖啡酰奎尼酸）、新綠原酸（5-O-咖啡酰奎尼酸）［4，10］。中國是煙草大國，煙草栽培、烘烤及卷煙生產過程中會產生大量的低廢次煙葉，目前主要采用就地焚燒、掩埋或堆棄等方法進行處理，導致嚴重的環境污染和資源浪費等生產生態問題［11］。以往科研工作者對煙草綠原酸的基因表達進行了較深入的研究，取得了一定的進展［12-15］，但是有關綠原酸的提取和純化工藝研究還較少。

目前，植物中綠原酸的提取方法主要包括微波輔助提取法、溶劑提取法和超聲波輔助提取法［16-18］，對于同一植物材料，如何快速而高效地提取其中所含綠原酸是提取的關鍵問題。細胞壁是植物細胞外圍的一層特殊組織，主要成分為纖維素和果膠。選用適量的纖維素酶和果膠酶等可以破壞細胞壁的構造，從而使得細胞壁內的有效成分溶出，王軒等［6］采用水提法和生物酶解法比較蒲公英中綠原酸的提取效果，發現酶解法較水提法更好。鄧愛華等［19］采用酶法輔助法提取杜仲中的綠原酸，發現適量應用纖維素酶可顯著提高綠原酸的提取率。基于此，本研究以廢次煙葉為原料，在溶劑提取法基礎上添加適量的纖維素酶，并通過單因素試驗分析各因素對綠原酸提取率的影響，選取影響較大的因素進一步通過響應面試驗對提取工藝進行優化，以期利用纖維素酶對細胞壁的分解作用提高綠原酸提取效率，推動廢次煙葉的再利用，促進煙草產業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

材料：廢次煙葉（商洛市煙草公司提供）。

試劑：無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、纖維素酶（食品級）等。

儀器：BS-15A型電子秤，YB-500A型粉碎機；HH-4型數顯恒溫水浴鍋；R-501型旋轉蒸發器；7225B型紫外可見分光光度計；DZF-6020型真空干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理將適量的廢次煙葉，首先沖洗干凈，把水控干，置于68℃烘箱中干燥2.0 h，然后取出粉碎過60目篩，保存于標記好的密封塑料袋備用［20］。

1.2.2 綠原酸的提取稱量10 g預處理后的煙葉粉末放入燒杯中，邊攪拌邊加入250 mL的去離子水，攪拌0.5 h，攪拌均勻后加入2%的纖維素酶，在55℃水浴鍋中恒溫加熱1.5 h進行酶解反應，真空抽濾，稱取殘渣5 g于250 mL錐形瓶中，加入一定比例的無水乙醇，設置溫度，在超聲波清洗儀中溶解浸泡一段時間，將樣液在4 000 r/min條件下離心30 min，取上清液于旋轉蒸發儀蒸發濃縮至無乙醇味，即為綠原酸粗品［7］。

1.2.3 綠原酸標準曲線的繪制準確稱取綠原酸標品，將其配置成1 mg/mL的標準溶液進行待測，分別吸取標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于50 mL的圓底燒瓶中，使用移液管將去離子水加入至刻度線附近，再滴入3 mL的3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液，將配置好的溶液放于沸水中顯色處理5 min后取出，然后在冷水中迅速冷卻至室溫狀態，加去離子水至刻度線，振蕩混勻后在330 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，綠原酸濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線并進行驗證試驗。

1.2.4 綠原酸提取率的測定按照標準曲線回歸方程，在波長330 nm的條件下進行測定，通過以下公式計算提取率［19］。

式中，C為樣品中綠原酸含量（mg/mL）；N為稀釋倍數；V為綠原酸提取樣液體積（mL）；M為原料的質量（g）。

1.2.5 單因素試驗在“1.2.2”方法的基礎上，對以下因素進行考察，控制其他條件不變，分別考察浸泡溫度（50、55、60、65、70℃）、浸泡時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、浸提溫度（70、80、90、100、110℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，m/V，下同）對煙葉中綠原酸提取率的影響，利用紫外分光光度計進行比色測定含量，計算得出綠原酸提取率。

1.2.6 響應面試驗根據單因素的試驗結果與分析，選擇對綠原酸提取率影響顯著的因素進行響應面優化試驗，依據Box-Behnken中心組合試驗設計的原理，以綠原酸提取率為響應值，進行響應面優化試驗，確定最優的提取工藝參數［21］。

1.2.7 驗證試驗對模型預測的最佳工藝條件進行驗證，重復3次取平均值，與模型預測值進行比較，驗證所得工藝的準確性和可重復性。

2 結果與分析

2.1 綠原酸標準曲線

以吸光度值（A）為縱坐標，綠原酸濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制綠原酸標準曲線（圖1），得到線性回歸方程為y=0.111 5x-0.010 9，R2=0.989 1，表明在0? 18 μg/mL水平上綠原酸質量濃度和吸光度具有良好的線性關系。

圖1 綠原酸標準曲線

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 浸泡溫度浸泡溫度對廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖2所示，浸泡溫度為55℃時，綠原酸提取率最高，此后隨著浸泡溫度的升高，提取率逐漸下降，因為酶的催化作用受溫度的影響，當溫度超過酶的最適反應溫度時，其空間構象會發生改變，使得酶活性降低，影響酶促反應速率。在55℃時綠原酸提取率最高（25.4 mg/g），且極顯著高于其他處理（P＜0.01），故考慮選用浸泡溫度50?60℃為響應面的優化條件。

圖2 浸泡溫度對廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.2 浸泡時間浸泡時間對廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖3所示，結果表明，隨著浸泡時間的延長，廢次煙葉中綠原酸提取率呈逐漸增加的趨勢，但是當浸提時間超過1.5 h時綠原酸提取率增加緩慢，且當浸泡時間為2.0、2.5 h時，其綠原酸提取率與浸提時間1.5 h差異不顯著（P＞0.05），故選用浸泡時間1.0?2.0 h為響應面的優化條件。

圖3 浸泡時間對廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.3 浸提溫度浸提溫度對廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖4所示，結果表明，在70?90℃時，隨著浸提溫度的升高，廢次煙葉中綠原酸提取率逐漸增加，當浸提溫度為90℃時，綠原酸提取率最高為25.2 mg/g，且極顯著高于其他處理（P＜0.01），當提取溫度為80、100℃時，綠原酸提取率之間的差異未達到顯著水平，故選用浸提溫度80?100℃為響應面的優化條件。

圖4 浸提溫度對廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.4 料液比料液比對廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖5所示，結果表明，隨著提取液比例的增大，廢次煙葉中綠原酸提取率呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶25時，綠原酸提取率最高為25.1mg/g，且與其他處理差異極顯著（P＜0.01），故選用料液比1∶20?1∶30為響應面的優化條件。

圖5 料液比對廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計單因素試驗結果分析顯示，所考察的4個單因素均顯著影響廢次煙葉綠原酸提取率，因此這4個因素全部進入響應面試驗進行優化，響應面試驗因素和水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素和水平

2.3.2 響應面試驗結果及分析響應面試驗結果如表2所示，其中第29處理組合（A0B0C0D0）綠原酸提取率最高，為25.87 mg/g。

表2 響應面試驗結果

對響應面試驗結果進行回歸分析，以綠原酸提取率作為響應值，采用Design-Expert 8.0軟件對各試驗因素進行回歸擬合，得到回歸方程式為Y=25.70+0.62A-0.14B+0.74C+0.47D-0.33AB-0.077AC-0.26AD-0.79BC-1.08BD-0.14CD-1.24A2-2.47B2-2.85C2-7.13D2。

對回歸方程進行顯著性檢驗，結果如表3所示，P＜0.01，失擬項P＞0.05，說明回歸方程顯著，具有統計學意義。此外，浸泡時間（A）和料液比（D）對對綠原酸提取率影響顯著（P＜0.05），浸提溫度C、A2、B2、C2和D2對綠原酸提取率影響達到極顯著水平（P＜0.01），浸泡溫度B和料液比D的交互作用達到顯著水平（P＜0.05）。各因素對廢次煙葉中綠原酸的提取率的影響程度為浸提溫度（C）＞浸泡時間（A）＞料液比（D）＞浸泡溫度（B）。

表3 回歸模型方差分析

響應面分析結果顯示，最佳工藝條件為浸泡時間1.46 h，浸泡溫度55.68℃，浸提溫度92.5℃，料液比為1.00∶25.16，預測提取率為25.809 mg/g。

2.4 驗證試驗

為了便于試驗操作，將響應面優化工藝參數設置為浸泡時間1.5 h，浸泡溫度55℃，浸提溫度92℃，料液比1∶25，此結果與響應面試驗第29處理組合基本一致。依此工藝參數進行3組驗證試驗，取其平均值，綠原酸提取率為25.863 mg/g，與預測值（25.809 mg/g）基本一致。

3 討論與結論

縮酚酸中咖啡酸的羧基和奎尼酸的羥基是構成綠原酸的主要成分，也是植物組織細胞中通過莽草酸過程組合的一種名為苯丙素類的物質，其中結構式中含有鄰二酚羥基、酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚［17］，因此，在進行單因素的提取試驗中，綠原酸的化學性質不穩定，導致浸提溫度的控制需掌握到最佳，長時間的高溫環境致使分解嚴重，損失率逐步上升。在熱提過程中，由于綠原酸屬于多酚，而多酚可能會和蛋白質、多糖、果膠等物質形成沉淀物析出［18］。因此，在浸提溫度上要嚴格把控，試驗證明，浸提溫度在90℃將達到最佳狀態。進一步通過響應面試驗對4個因素進行優化，得到最佳工藝參數為浸泡時間1.5 h，浸泡溫度55.5℃，浸提溫度92℃，料液比1∶25，該條件下綠原酸提取率為25.863 mg/g，本試驗的工藝條件提取綠原酸簡便快速、綠色環保、效率高，可為廢次煙葉的綜合利用提供理論依據。

此外，綠原酸與煙草質量和抗逆性緊密相關，已引起許多研究者的重視［22］，但是煙株各組織部位綠原酸含量各不相同，提取方法也不同，如何高效快速地提取煙株中的綠原酸，以及如何提高其純度有待進一步研究。