金黃疏肝應激散對靶動物草魚的安全性試驗

肖飛

（武漢華揚動物藥業有限責任公司，武漢 430205）

魚類抗應激能力是衡量魚類健康水平的重要標志之一，而魚類健康水平是依賴于機體諸器官的正常運轉，其中肝膽功能與魚體代謝密切相關。開發金黃疏肝應激散的目的是通過飼料中添加適量的藥物，保護魚體肝臟及解除機體內毒性物質的積累，促進機體正常代謝，以提高其抗應激能力。

該中藥制劑對非病原性疾病的癥狀治療針對性較強，主藥郁金具行氣化瘀、疏肝利膽、增強肝酶活性、降血脂、抗氧化等作用；姜黃作為平肝藥，具改善肝膽實質細胞病損、利膽促代謝功能；輔藥刺五加益氣安神、抗應激、改善內分泌，具適應原樣作用和對病理過程起調節作用。

為證明金黃疏肝應激散在推薦使用條件下對靶動物的安全性，了解草魚與金黃疏肝應激散可能出現毒性有關的臨床反應特征，確定金黃疏肝應激散對靶動物的安全范圍，指導臨床用藥，有必要評價金黃疏肝應激散對靶動物草魚的安全性。為此，本研究將從增重率［1，2］、血液學［3］和組織學等3方面來評價其安全性。

1 材料與方法

1.1 受試藥品

金黃疏肝應激散（主要成分：郁金、姜黃、刺五加，批號為20200125），由武漢華揚動物藥業有限責任公司提供。

1.2 試驗動物及飼養管理

健康草 魚360尾，尾重50?70 g，試驗 前，用50 mg/L高錳酸鉀對水族箱、試驗用具和水體進行徹底消毒，然后再徹底沖洗。先將受試魚在室內2個大型水族箱（每個水箱水量1.5 m3）中暫養2周左右，水溫為（28±2）℃，pH 6.8?7.4，持續充氧，溶氧量5.0? 8.0 mg/L。保持恒定的水流，每天換水率約為30%，光照周期為12 L∶12 D。馴化期間每日于上午9點左右投喂1次顆粒餌料（其組成及成分見表1），投喂量為魚體重的2%。受試魚暫養后期活動正常，無病，無死亡，暫養結束后選擇體質健壯、無病無傷的個體進行分組試驗。試驗箱為圓筒形水箱，水體積約為120 L。

表1日糧組成及營養成分

1.3 試驗方法

暫養后試驗魚禁食24 h后，將試驗魚共分為4組進行養殖試驗，分別為對照組和低劑量（L）、中劑量（M）、高劑量（H）試驗組，每組3個重復箱，每箱30尾魚。藥物組劑量分別為100、300和500 mg/kg體重（推薦劑量為100 mg/kg體重），折算到飼料中添加分別為0.5%、1.5%和2.5%。將粉狀試驗藥物摻入到粉狀飼料中，并加入適量黏合劑，充分拌勻后，自配成顆粒狀飼料，晾干，飼養3周，每周對每組魚進行稱重，依此調整投餌量。

1.4 指標測定

1.4.1 一般狀況觀察每天對魚的攝食、呼吸、游動及外觀狀況進行觀察。若出現明顯中毒癥狀或死亡，對魚進行剖檢，觀察臟器的病理變化［4］。養殖試驗結束時，禁食24 h，稱量魚體總質量，計算各劑量組草魚的增重率。增重率=100%×（末均重－初均重）/初均重。

1.4.2 血液生理生化指標隨機撈取15尾魚，用一次性注射器從尾靜脈采血，分裝于普通和加有抗凝劑的EDTA-K2采血管中，分別用于制備血清和全血。由于有的魚個體不夠大，或采血不夠順利，采集的血量有限，部分指標為2?3尾魚血樣混合后測定的結果。

1.4.3 病理組織觀察采血前測定試驗魚的體重。然后，取肝胰臟、腎臟和脾臟［5，6］放入Bouin’s液中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，組織切片機切片，厚度為4?5 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學特征。

1.5 數據統計分析

利用SPSS軟件進行數據顯著性檢驗。采用t檢驗比較試驗組與對照組間均增重、血液學和血液生化學等各項指標的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 外觀表現

與對照組比較，試驗期間各給藥組游動、集群、棲息水層、食性、外觀均無異常變化。此外，各試驗組在3周試驗時間均未出現因病死亡，只有低劑量和高劑量試驗組各1尾跳出魚箱未及時發現而死。

2.2 各組草魚特定生長率、飼料效率

試驗期間，各組草魚初均重、末均重、平均增長率見表2。與對照組相比，低劑量和中劑量試驗組的平均增重率比對照組有所增加，但差異不顯著（P＞0.05），高劑量試驗組的增長率雖有所下降，但與對照組相比也沒有顯著差異（P＞0.05），表明投喂金黃疏肝應激散不影響魚的攝食與生長，而且中低劑量甚至具有一定的促生長作用。

表2 試驗各組草魚的增長率（n=15）

2.3 血液生化指標變化

各試驗組草魚血液生理生化指標檢測結果見表3。投喂常規劑量的金黃疏肝應激散3周對草魚的健康沒有產生影響，肝腎功能和血球蛋白含量都未受影響。與對照組相比，各試驗組血清中總膽固醇含量均有下降，其中低劑量和中劑量試驗組顯著下降（P＜0.05）。此外，低劑量試驗組AST、總膽紅素水平明顯低于對照組。高劑量試驗組的白蛋白含量比對照組有顯著下降（P＜0.05），總蛋白含量也有一定程度下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 各組草魚血液生理指標情況（n=15）

2.4 金黃疏肝應激散對草魚組織病理學影響

2.4.1 肝臟組織病理變化對照組在試驗過程中形態結構變化不大［7，8］，清晰可見肝細胞以中央靜脈為中心向四周排列呈索狀，肝細胞呈多邊形，邊緣清晰，核清晰可見，基本位于中央，肝細胞索之間有竇狀隙。金黃疏肝應激散不同添加量試驗組的草魚肝臟組織均未發生明顯病理變化（圖1），與對照組基本相似。

圖1 對照組和試驗組草魚肝臟的組織學切片

2.4.2 腎臟組織病理變化對照組草魚腎臟組織無明顯病理變化，腎小體頸段由單層立方上皮構成，細胞呈矮棱柱狀，細胞核為圓形，中位。近曲小管由單層柱狀上皮細胞構成，細胞呈高棱柱狀，細胞核大，基位，多為圓形或橢圓形，細胞間界限模糊。遠曲小管由單層立方上皮細胞構成，細胞呈矮棱柱狀，細胞核為圓形，中位，細胞間界限較為清晰。收集管連接腎單位與集合管，管道外有少量結締組織，細胞呈立方形，細胞核中位（圖2）。金黃疏肝應激散不同添加量試驗組草魚的肝臟組織均未發生明顯病理變化。

圖2 對照組和試驗組草魚腎臟的組織學切片

2.4.3 脾臟組織病理變化對照組腸道黏膜上皮細胞排列整齊，紋狀緣發達，黏膜層杯狀細胞較多，黏膜下層較薄（圖3）。金黃疏肝應激散不同添加量試驗組草魚脾臟組織均未發現明顯病理變化。

圖3 對照組和試驗組草魚脾臟的組織學切片

3 討論與結論

3.1 金黃疏肝應激散對草魚增重率、血液生理指標的影響

中草藥作為飼料添加劑在魚類應用的研究表明，姜黃和含有姜黃的復方中草藥能較好地提高魚類的生長性能。本研究發現采用含有郁金、姜黃和刺五加的中藥復方制劑金黃疏肝應激散進行靶動物安全性試驗，連續飼喂草魚3周，各試驗組均未發生因疾病而導致的死亡，表明不同劑量的金黃疏肝應激散不會影響魚類的存活率，具有潛在的提高草魚生產的趨勢，與相關研究報道一致［9-12］。

ALT、AST是反映肝細胞線粒體和胞漿健康狀況的重要轉氨酶，通常血液中含量較少。當肝臟受損傷時，會引起細胞通透性增加，轉氨酶會轉移到血液中。因此，血清中ALT、AST活性的高低可以反映肝功能的健康狀況［13］。本研究中各試驗組血液中的ALT和AST均沒有影響，表明金黃疏肝應激散未對草魚造成肝腎損傷。高劑量試驗組的白蛋白含量低于對照組（P＜0.05），而且血紅蛋白和血清總蛋白含量也略低于對照組，可能是由于添加的藥物比例過高，降低了餌料中蛋白質含量。試驗組的總膽固醇水平低于空白組，而且低劑量和中劑量試驗組有顯著差異（P＜0.05），說明金黃疏肝應激散有改善脂質代謝的作用，有利于防治肝膽綜合征。

3.2 金黃疏肝應激散對草魚組織病理學影響

研究表明，姜黃素的小鼠單次給藥最大量為20 g/kg，SD大鼠重復給藥最大無毒反應劑量（NOAEL）為4 g/kg［14］。陳嬌嬌等［15］研究發現姜黃素對斑馬魚胚胎及幼魚有一定的急性毒性及致畸作用，作用于胚胎和幼魚的最大安全濃度分別為1.86和4.0 μmol/L。本研究中未表現出金黃疏肝應激散對草魚的毒性作用，可能與試驗靶動物和劑量有關。徐道修［16］采用郁金散水煎劑進行了最大濃度、最大體積給小鼠一次性灌胃試驗，試驗過程中未發現小鼠有死亡的現象，表明郁金散水煎劑具有良好用藥安全性。孫蘭等［17］采用小鼠經口灌胃給予刺五加口服液，結果發現雌、雄小鼠經口急性毒性MTD均大于24.0 g/kg BW，屬于無毒級；在2.5?10.0 g/kg BW劑量范圍內，小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗結果未見異常，屬于陰性，表明刺五加口服液無毒且未顯示有遺傳毒性。本研究設置對照組、低劑量試驗組、中劑量試驗組、高劑量試驗組，其中對照組投喂正常日糧，試驗組按劑量添加金黃疏肝應激散，通過長達21 d的連續投喂，即使高劑量金黃疏肝應激散也未導致試驗魚的肝功能異常，甚至還有降低轉氨酶活性的作用。尿素氮和肌酐水平也都沒有差異，說明即使高劑量金黃疏肝應激散也不影響腎功能。組織學切片也沒有發現肝、腎和脾臟有明顯的病變發生。試驗組草魚肝臟、腎臟和脾臟與對照組相比均無顯著變化，表明金黃疏肝應激散在組織水平上對草魚不存在明顯毒性［18］。