基于GC-MS和網絡藥理學探討當歸-肉桂藥對的抗炎作用機制

曾格格，劉毅，劉天琪，黃振陽，丁晨薇

（湖北中醫藥大學藥學院/湖北省藥用植物研發中心，武漢 430065）

按照中藥配伍“相須、相使、相畏、相殺、相惡、相反”的原理，體現四氣五味、升降浮沉、歸經等中藥藥性理論，藥對已經成為現代中醫臨床常用的配伍組合［1］。中藥當歸（Angelica sinensisRadix）來源于傘形科植物當歸（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）的干燥根，當歸甘、辛、溫，歸肝、心、脾經。現代藥理學研究發現，當歸不僅養血活血，其有效成分當歸多糖、藁本內酯還具有抗炎、抗血小板凝集以及抗氧化等藥理作用［2］。中藥肉桂（Cinnamomi cortex）來源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥樹皮。肉桂辛、甘、大熱，歸腎、脾、心、肝經。肉桂中所含的肉桂醛等成分具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗寄生蟲等藥理作用。現代研究證實，當歸、肉桂合用可以擴張周圍血管，改善微循環，增加局部血液循環，促進炎癥吸收和局部消腫作用［3］。炎癥作為一種保護性免疫反應，炎癥反應不足會導致病原體持續感染，而過度炎癥則導致慢性或系統性炎癥性疾病［4］。許多疾病的本質均為炎癥反應。因此，挖掘新型抗炎藥物對于解決炎癥性疾病具有重要作用。在《景岳全書》《備急千金要方》等相關著作中，當歸-肉桂作為藥對制備出的各種復方制劑，常用于治療月經不調、寒濕痹痛、肌膚麻木及關節不利等癥［5］，療效顯著，但目前關于當歸-肉桂藥對抗炎活性成分相關研究較為鮮見。因此，本研究采用GC-MS（氣相色譜-質譜）對當歸、肉桂及其藥對進行比較分析，再借助網絡藥理學篩選出抗炎主要活性成分、關鍵靶點及潛在信號通路，從系統生物學角度探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器手動固相微萃取（SPME型）進樣裝置，德國IKA公司；氣相-質譜-計算機聯用儀（Agilent 6890/5973型），美國Hewlett-Packard公司；頂空瓶（15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭，美國Supelco公司；電子天平（ALC-210.2型），北京賽多利斯天平有限公司。1.1.2藥材當歸、肉桂藥材均購于湖北辰美中藥有限公司，經湖北中醫藥大學藥學院生藥教研室鑒定，分別為傘形科植物當歸的干燥根及樟科植物肉桂的干燥樹皮。

1.1.3 藥材的前處理將當歸、肉桂藥材分別用粉碎機打成粉末并過16目篩，取出備用。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS色譜與質譜條件

1）GC條件。色譜條件HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：從50℃開始，以10℃/min升溫至230℃，保留3 min；載氣：高純度He（99.999%），柱流速：0.8 mL/min，進樣口溫度：230℃。

2）MS條件。EI源；離子源溫度230℃，電離能70 eV；四級桿溫度150℃；掃描質量范圍35? 550m/z。

1.2.2 頂空固相微萃取條件將當歸-肉桂藥對粗粉混合，以萃取吸附量多少、能否達到最佳萃取效果、總峰面積盡可能大作為參考要求。將樣品量、萃取溫度、萃取以及解析時間分別進行單因素考察。最終確定GC-MS的最佳條件：精密稱取當歸-肉桂藥對粉末0.6 g（當歸、肉桂各0.3 g），置于15 mL頂空瓶中，插入裝有65 μm PDMS/DVB型萃取纖維頭的手動進樣器，100℃預平衡20 min，再伸出萃取頭頂空萃取15 min，取出后立即插入色譜儀進樣口（溫度230℃），解吸3 min。

1.2.3 網絡藥理學研究

1）成分數據收集與獲取。將當歸-肉桂藥對揮發性成分CAS號輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）［6］搜索欄進行檢索，獲取化合物的相關靶點信息。并在Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［7］搜索欄輸入成分的CAS號，得到其分子結構，并保存為Canonical SMILES格式。將下載的SMILES格式文件導入Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）［8］，選定研究物種為“Homo sapiens”，得到成分的對應靶點，整合TCMSP和Swiss Target Prediction靶點結果，刪去重復的作用靶點，得到組分潛在作用靶點。

2）疾病靶點獲取。搜索GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）［9］和TTD數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）［10］，以inflammation為關鍵詞進行檢索，獲得作用靶點，將上述數據庫所獲取的靶點，刪除重復值后進行合并。

3）潛在作用靶點獲取。使用UniProt蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org）［11］將疾病靶點與藥物成分的潛在靶點統一規范為Gene Symbol，其后將化合物、疾病的靶點錄入Venny 2.1.0軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線作圖工具平臺，繪制韋恩圖，得到兩者交集（即共同靶標），作為潛在作用靶點。

將TCMSP和Swiss Target Prediction數據庫收集的潛在作用靶點及其對應成分分別導入Cytoscape 3.7.2軟件［12］，構建“藥物-成分-靶點”網絡圖，使用Network Analyzer功能對網絡進行分析，根據節點Degree、Betweenness、Closeness篩選出其抗炎的主要活性成分。

1.2.4 PPI網絡構建及分析將疾病與藥物的交集靶點輸入STRING數據庫［13］獲取靶標蛋白互作網絡關系，構建蛋白相互作用網絡模型，設置minimum required interaction score為0.4，刪除孤立點；獲得蛋白相互作用信息，并將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡并進行拓撲指標分析，篩選出關鍵靶點。

1.2.5 富 集 分 析利 用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）［14］對疾病與藥物的交集靶點進行生物信息富集分析，包括GO分析以及KEGG通路分析。

2 結果與分析

2.1 當歸-肉桂藥對揮發性成分分析

通過選定的萃取條件對當歸-肉桂藥對進行試驗，得到當歸-肉桂藥對GC-MS總離子流。通過質譜數據庫檢索及文獻比對，從當歸-肉桂藥對中共檢測出51個峰（圖1），初步鑒定出35種成分，占總揮發性成分的70.53%。其中，揮發性成分含量較高的有α-蒎烯（29.80%）、Δ-杜松烯（8.59%）、（3E）-3，7-二甲基辛-1，3，6-三烯（7.97%）、（-）-菖蒲烯（6.64%）、β-欖香烯（4.17%）、β-石竹烯（2.87%）、α-律草烯（2.42%）等（表1）。

表1 當歸-肉桂藥對揮發性成分分析結果

圖1 當歸-肉桂藥對揮發性成分的總離子流

2.2 潛在靶點收集

根據藥對的CAS號，在TCMSP及Swiss數據庫中得到的預測靶點，合并且刪掉重復的作用靶點，共得到靶點398個。通過Therapeutic target datebase數據庫、GeneCards數據庫得到炎癥相關基因靶點1 639個，在Venny 2.1.0軟件在線作圖工具平臺上輸入成分、疾病的靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后得到共同靶點184個（圖2）。

圖2 成分、疾病靶點的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點”網絡構建及分析

將化學成分及184個潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，進行網絡繪制（圖3），此網絡由219個節點和659條邊構成，并通過Network Analyzer對網絡圖進行分析。結果顯示，當歸-肉桂藥對重要的抗炎活性成分包括α-蒎烯、β-欖香烯、β-石竹烯、α-律草烯、（-）-異灑剔烯、肉桂醛、二正戊基酮、別羅勒烯、苯乙烯、（-）-菖蒲烯、鄰甲氧基肉桂醛等，均能與多個靶點相連接。同時，又可共同作用于一些靶點，體現了揮發油多成分、多靶點、多途徑的綜合調節特點。

圖3 藥物-成分-靶點網絡

2.4 PPI網絡構建

在STRING數據庫中輸入184個潛在作用靶點，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape 3.7.2軟件對上述數據進行可視化分析，構建PPI網絡，并對網絡進行篩選，以高于介度（Betweeness）、緊密度（Closeness）的中位數且連接度（Degree）大于2倍中位數為標準，篩選出35個關鍵靶點（表2），其中度值（Degree）最高的為TNF，能與128個蛋白發生相互作用，其 次 是IL-6、IL-1β、AKT1、STAT3、MAPK3、TLR4等，分別能與125、107、104、84、83、79個蛋白發生相互作用。PPI網絡見圖4，圖形顏色越深、圖形越大，靶點度值越高，說明其對應的節點在網絡中越重要，反之，顏色越淺，節點越小，代表度值越低。

表2 關鍵靶點信息

圖4 當歸-肉桂藥對蛋白質相互作用網絡

2.5 靶點通路分析

利用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）對疾病與藥物的交集靶點進行GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析。得到1 296個生物學過程（Biological process，BP）、31個細胞組成（Cellular component，CC）、89個分子功能（Molecular function，MF），設定P＜0.05，將每一類按照顯著性進行排序，將排在前10的GO富集條目和排在前20的KEGG富集條目通過氣泡圖的形式進行展示，圓圈大小或線條長度表示富集在GO和KEGG的基因數目，顏色代表富集的顯著性。

由圖5可知，當歸-肉桂藥對發揮抗炎作用主要涉及的生物學過程（BP）包括對脂多糖的反應（Re-sponse to lipopolysaccharide）、對細菌來源分子的反應（Response to molecule of bacterial origin）、對營養水平的反應（Response to nutrient levels）等；細胞組成富集分析（CC）包括膜筏（Membrane raft），膜微區（Membrane microdomain），膜區（Membrane region）等；分子功能富集分析（MF）包括細胞因子受體結合（Cytokine receptor binding）、血紅素結合部位（Cytokine receptor binding）、類固醇結合（Steroid binding）等。

圖5 GO功能富集分析

KEGG通路分析結果（圖6）顯示，當歸-肉桂藥對發揮抗炎作用排名前20的信號通路，關鍵通路包括脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、點樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）等，表明揮發油可通過作用于不同的生物過程和通路協同發揮抗炎作用。

圖6 KEGG通路富集分析

3 小結與討論

本研究采用GC-MS對當歸-肉桂藥對的揮發性成分進行比較分析，從當歸-肉桂藥對中鑒定出35個成分，占總揮發性成分的70.53%。將藥對與炎癥潛在作用靶點及其對應成分分別導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物-成分-靶點”網絡，篩選出其主要的活性成分，發現α-律草烯，α-蒎烯、正丁烯基苯酞、β-石竹烯、β-欖香烯、Δ-杜松烯等揮發性成分，有研究表明其均具有良好的抗炎、抗癌、鎮痛等作用，具有較高的保健和醫療應用價值，還具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保護心血管、防治腫瘤、改善免疫功能等作用［15-18］。α-蒎烯能抑制大鼠巨噬細胞中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、NO的生成及核轉錄因子-κB信號通路（NF-κB通路），從而具有抗炎作用［19］；β-石竹烯、β-欖香烯通過對PPARA-RXRA-NCOA2信號軸與PTGS2、PTGS1、IL-6等炎性因子的潛在作用，從而發揮產熱、減脂、抗炎作用［20］。PPI網絡分析結果表明，從184個潛在作用靶點中篩選出35個關鍵靶點。當歸-肉桂藥對主要通過TNF、IL-6、IL-1β、AKT1等炎癥因子相互作用協同發揮抗炎作用。腫瘤壞死因子（TNF）［21］在抑制炎癥反應之外可以誘發降壓以及腎臟利尿排鈉反應；IL-6作為一種由T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等細胞分泌出來的炎性細胞因子，具有較突出的調節細胞增殖及分化、免疫抑制等功能；白細胞介素-1β（IL-1β）作為目前臨床工作中第一個被發現的白細胞介素，主要功能在于參與內源性致熱源與炎癥反應［22］。KEGG通路結果表明，當歸-肉桂藥對主要通過調節脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、點樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、弓形體病（Toxoplasmosis）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、耶爾森菌感染（Yersinia infection）、Toll樣受體（Toll-like receptor）、TNF等信號通路發揮抗炎作用。其中，IL-17信號通路被認為可影響mRNA轉錄，在炎癥反應中起關鍵作用，IL-17是一種強有力的炎癥性白細胞介素，能激活其他促炎細胞因子的表達［23］，其主要由輔助性T細胞（Th17細胞）和其他來源產生，包括自然殺傷細胞、肥大細胞和中性粒細胞。TNF信號通路可通過CD14+巨噬細胞共同刺激和激活固有層T淋巴細胞（CD14+細胞膜結合的TNF與固有層T細胞上的TNFR2相互作用）來調節腸道炎癥。總之，本研究采用GC-MS對當歸-肉桂藥對進行分析，并運用網絡藥理學方法揭示了抗炎活性成分及其作用機制，結果表明，當歸-肉桂藥對通過多種成分、多靶點共同調控炎癥信號通路及炎癥疾病通路，影響炎癥生物學過程，發揮抗炎作用，從而治療疾病，為當歸-肉桂藥對后續研究及臨床應用提供理論依據和方向。