廣西莪術優良種質單株產量和揮發油含量的聚類分析

楊妮，謝巍，王建

（1.柳州市婦幼保健院（廣西科技大學附屬婦產醫院、兒童醫院），廣西 柳州 545001；2.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

廣西莪術（Curcuma kwangsiensis）為姜科姜黃屬植物，以干燥根莖入藥，其味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的作用［1］。現代研究發現，廣西莪術中可分離得到多種化學成分，主要包括揮發油類和姜黃素類化合物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗血栓、調血脂、抗炎鎮痛、降血糖、抗氧化等多種藥理作用，具有良好的臨床應用前景［2，3］。目前國內外學者對廣西莪術的研究主要包括藥用良種選育、藥用栽

培、化學成分、藥材質量控制、藥理作用、觀賞園藝等方面［4-9］。楊妮等［4］、王建等［5］對廣西莪術良種選育、植株形態學、藥材性狀、成分分析進行了研究。為進一步選育優良廣西莪術種質資源，本研究以不同種質廣西莪術的產量、揮發油含量及成分為評價指標，采用系統聚類法對產量及揮發油含量高的種質進行分析，為建立廣西莪術品種選育提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

FA1004型電子天平（上海精科天平儀器廠），98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），揮發油提取器，Agilent 7890N/5975NGC-MS型聯用儀（美國安捷倫）；超聲儀；LG16-W型離心機（北京京立離心機有限公司）；試劑均為國產分析純。藥材采自廣西玉林、興業、欽州、靈山、貴港、桂平、平南、青塘、橫縣、邕寧、金秀等地，經廣西中醫藥大學王建教授鑒定為姜科植物廣西莪術，不同種質材料共計150份，按照植物學性狀（株高、葉長、葉寬、葉面有無被毛）及藥材性狀進行分類編號，集中種植于廣西南寧市仙葫種植基地，并統一栽培管理，保證了除種質本身存在差異外其他條件（栽培基地條件、氣候條件、田間管理、施肥種類、施肥時間與數量等）完全一致，連續種植繁育6年，保證非處理因素的一致性。

1.2 方法

1.2.1 產量測定將成熟后采收的不同種質的廣西莪術材料共150份，置于通風庇蔭處存放2 d，風干表面泥沙，防止發霉變質。用枝剪剪去須根，分離出莪術（Curcuma aeruginosaRoxb.）和郁金（Curcuma rcenyujinY，H.Chenet C.Ling），其次用刷子刷去莪術和郁金表面的泥沙及頂端枯葉，為準確測量數據做準備，并對每個材料的藥材性狀進行詳細記錄。將上述清理干凈的藥材進行準確稱量，天平稱定單株莪術藥材重量。

1.2.2 揮發油提取將上述稱重后材料中單株莪術重量大于150 g的材料取出備用。提取試驗方法參照《中國藥典》（2015版）四部通則中揮發油測定法，分別取不同種質廣西莪術當選株系的根狀莖洗凈、晾干，每份取鮮品100.0 g，切碎。置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱煮沸并保持微沸7 h，待冷卻靜置分層后讀取揮發油體積，并收集揮發油置于2 mL離心管中保存，計算得油率，揮發油得油率=（V/m）×100%，其中，V為提取揮發油體積（mL）；m為藥材質量（g）。含油量≥0.5 mL/100 g的種質被認定為含油量高種質。1.2.3揮發油成分GC-MS分析樣品預處理：取揮發油約0.05 mL，加入甲醇稀釋至約1.5 mL，超聲5 min后取出，加入無水硫酸鈉適量除去水分，離心10 min，取出備用。

GC-MS測定條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。升溫程序為初始60℃（4 min），以10℃/min升溫至100℃，再以4℃/min升溫至108℃，保持2 min，以4℃/min升溫至156℃，保持10 min，以20℃/min升溫至280℃，保持2 min；氣化溫度250℃，檢測器溫度280℃；載氣為高純氦氣；載氣流量1.5 mL/min；進樣量1 μL；分流比50∶1；溶劑延遲3 min。質譜條件：電子轟擊（EI）電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃；圖譜庫為NIST08。

1.2.4 揮發油成分聚類分析系統聚類分析，可以將多個樣本按照設定的距離聚成新的一類，操作較為簡便且結果直觀。利用SPSS 22.0統計軟件包中的聚類分析程序分別以莪術揮發油產量及顏色、莪術揮發油成分為指標對篩選出的優質藥材進行聚類分組。采用Z-score法對原始數據進行標準化轉換。其中，式中，為各變量的算術平均值1，2，…，p），Sj為標準差，n為樣本點個數，p為自變量的個數；Zij為標準化后的變量值；xij為實際變量值。經過標準化處理的變量權重相同，均值為零，方差為1。

2 結果與分析

2.1 高產量種質材料統計

對150份材料產量數據進行分析，其中有39個材料單株莪術重量＞200 g，被初步認定為產量高的優良種質材料。其中，玉9/B56的產量最高，單株莪術重量達1 343.0 g，玉8/A81產量次之，單株莪術重量達916.0 g。莪術單株重量＞500 g的材料有13個，這些材料在產量方面表現出其種質的優越性（表1）。

表1 39個高產量種質材料含油量及產量統計

2.2 高油量種質材料統計

篩選單株莪術重量大于150 g的種質材料共51份，進行揮發油提取，統計揮發油出油率。51份材料中發現有21份材料揮發油的含量≥0.5 mL/100 g，研究認定為含油量高的材料，其中，玉18/B97揮發油含量最高，達1.41 mL/100 g，玉11/A28含油量次之，為1.32 mL/100 g，含油量≥0.90 mL/100 g的材料有10個，這些種質在含油量方面表現出種質的優越性（表2）。

表2 21個高油量的種質材料含油量及產量統計

2.3 高產量和高油量材料統計

選取揮發油含量≥0.5 mL/100 g，且單株莪術重量≥400 g以上的種質材料，認定為產量和含油量均高的材料。產量和揮發油均高的材料有18個，其中，玉18/B97、玉11/A28的揮發油含量較高，分別達1.41、1.32 mL/100 g，同時其單株莪術藥材重也較高，分別達416.5、307.0 g，是表現優良的種質（表3）。

表3 18個高產量和高油量種質材料含油量及產量統計

2.4 GC-MS檢測結果

對“2.3”篩選的18個高產量和高油量種質材料進行揮發油成分分析，吸取離心后的揮發油1 μL進行分析測定。通過GC-MS分析，得出18個優良種質廣西莪術鮮品揮發油的質譜圖，通過化學工作站數據系統分析，按峰面積歸一化法進行計算求得各化學成分在揮發油中的相對百分含量。通過NIST08標準圖庫進行檢索，選取匹配度SI＞90%的化合物，結合有關文獻進行人工檢索和解析，確認各化合物，共鑒定出36個化合物（表4）。

表4 18個高產量和高油量材料揮發油成分GC—MS分析

2.5 廣西莪術揮發油產量及顏色聚類分析

以揮發油產量及顏色為變量，對18個種質進行聚類，可分為3類（表5），其中1類有8個品種，單株重量為500 g，揮發油多為紫褐，偶有紫灰色；Ⅱ類有7個品種，單株重量為800?900 g，揮發油多為黃色，偶有淺黃色；Ⅲ類有3個品種，單株重量為400?600 g，揮發油多為淺黃色和黃色。

表5 18個高產量和高油量材料揮發油產量及顏色聚類分析

2.6 揮發油成分的聚類分析

利用SPSS 22.0聚類分析軟件，先對全部數據進行統一標準化處理，再利用標準化后的數據進行聚類分析。分別篩選特征性組分，以不同的成分為變量進行分析。由圖1可以看出，以全部成分為變量時所得成分聚類分為2類，玉14/C29、C108、玉11/A28、玉13/C106、玉18/B97、藥用2、A28聚為一類；廣城1、玉10/A12、藥圃、C39、C105、C16、玉6/C84、玉22、玉1/C59、玉17/B6、玉4/B81聚為一類。

圖1 以揮發油所有成分為變量所得成分聚類分析

3 小結與討論

3.1 不同種質廣西莪術藥材產量及揮發油含量比較

150份研究材料產量及揮發油含量統計結果顯示，不同種質產量及揮發油含量均存在一定差異，其中，玉9/B56、玉8/A81等13個材料在產量方面表現出其種質的優越性，莪術單株重量＞500 g；揮發油提取數據可得出21份材料揮發油的含量≥0.5 mL/100 g，其中，玉18/B97、玉11/A28的材料含油量較高，后期應繼續關注成分分析研究。

3.2 產量及揮發油均高的廣西莪術優良種質篩選

根據2015年版《中國藥典》規定，莪術干品含揮發油≥1.5%（mL/g）。莪術折干率5∶1，因此莪術鮮品揮發油應≥0.3%（mL/g），故認為廣西莪術鮮品每100 g中揮發油提取量≥0.3 mL的樣品為優質品種。研究發現，產量及揮發油含量均高的種質共18種，主要包括玉18/B97、玉11/A28、藥圃等。其中，玉11/A28為長勢好、含油量及產量高的優質品種，與其歸為一類的莪術具有以下特征：揮發油顏色多為紫褐，偶有紫灰色；揮發油含量較高，可達1.2 mL/100 g，藥材單株質量500 g。

3.3 揮發油成分差異比較

對產量及揮發油均高的18個廣西莪術種質進行GC-MS揮發油成分分析，發現共有成分樟腦、β-欖香烯、莪術烯、龍腦含量差異較大，各樣品色譜圖的有效成分出峰時間基本相同，但因所含的成分各不相同，每個樣品的色譜峰均有差異。其中有效成分莪術烯、β-欖香烯均能檢測到，而重要有效化學成分吉馬酮，依據匹配度SI＞90%進行檢索，并未檢索到吉馬酮，可能由于揮發油提取過程中保存不當損失所致。根據以上結果分析，綜合單株產量、揮發油得油率、有效成分相對含量3個方面考慮，A28、玉14/C29、玉18/B97、玉11/A28、藥用2、C39在所有樣品中品質較優，該分析結果可為后期選育優良種質試驗提供依據。

3.4 聚類分析在優良種質篩選研究中的可行性

選育優良種質資源時，需對所有樣本進行初步梳理與確認，本研究涉及樣本較多，聚類分析法可進行品種的歸類，從而選育出每一類中的優良品種，同時綜合多個不同側重點的數據篩選出長勢好、產量高、含油高的品種；成分聚類分析是中藥材質量標準制定的有力手段，通過聚類分析的方法可初步篩選出含有不同有效成分的廣西莪術品種，臨床應用時可選擇有效成分含量高的種質材料，保障臨床治療效果，減少藥材損耗量；同時聚類分析結果可為良種選育提供必要的參考依據，可初步判定不同種質廣西莪術親緣關系的遠近，進行良種選育時可選擇親緣關系較遠的品種進行雜交，提高種內變異，有助于在種內傳遞性狀優良的遺傳基因。