九阡李果實發育期主要有機酸及氨基酸含量變化

崇慧影，潘紹佐，李冰晶，劉國華，王代波

（1.貴州省生物研究所，貴陽 550009；2.三都水族自治縣九阡鎮農業技術綜合服務中心，貴州 黔南 558113）

九阡李（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科（Rosaceae）李亞科（Pnmoideae）李屬（PrunusLinn.）李［1］，是貴州省獨有的地方早熟優良李品種［2-4］，因產地九阡鎮而得名［5］。其因果實色澤鮮艷［6］、風味獨特［7］、早熟而聞名省內外［8］。地方政府于2000年開始重視九阡李種植產業的發展［9］，種植面積曾達933 hm2，后由于缺乏科學的育苗及栽培管理技術［10］，經濟效益沒有達到預期，面臨低產低效問題，目前種植面積減至400 hm2。果實中的有機酸［11］及氨基酸是決定果實風味和品質的重要指標，它的組成類型、比例與果實酸味、口感密切相關［12］。有學者指出李屬果實含有多種有機酸和氨基酸，多以蘋果酸［13］、奎寧酸［14］、琥珀酸［15］中的1種或2種為主要有機酸［16］，氨基酸以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸［17，18］為主，但九阡李果實中有機酸及氨基酸在發育期的變化規律鮮見相關報道。筆者以九阡李為試驗材料，研究其果實發育期有機酸及氨基酸的變化規律，旨在為今后九阡李果實品質及其風味的形成機制研究奠定基礎，為科學栽培管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料取自九阡李產地貴州省三都縣九阡鎮水昔村山地果園10年生九阡李樹，果園面積0.67 hm2，海拔660 m，隨機選定3株果樹，從樹冠外圍的東、南、西、北、中5個方位各選取形態和成熟度相近的果實5枚［19］，自幼果期3月10日開始采樣到果實成熟，15 d采樣1次，至果實成熟，共采樣5次。1.1.2主要試劑有機酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；氨基酸混標標準品，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司（Sigma-Aldrich）；色譜級乙腈，德國默克公司；醋酸鈉、三乙胺等試劑為分析純。

1.1.3 儀器與設備TG-16G型臺式高速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；FA1204型電子天平，上海衡際科學儀器有限公司；CHA-2型氣浴恒溫搖床，蘇州威爾實驗用品公司；PS40A型超聲清洗儀，深華泰科學儀器有限公司；高效液相色譜儀：美國Waters 2695，配置Waters2998檢測器、安捷倫1260液相色譜串聯AB4000型質譜儀、水浴氮吹儀，上海那艾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法檢測九阡李果實發育期有機酸的含量準確稱取樣品約1 g，加入4倍體積的0.2 mol/L偏磷酸溶液；冰水浴超聲30 min，12 000 g離心5 min，取上清液，定容至5 mL；取1 mL提取液，過0.22 μm水相濾膜，待上機檢測。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250.0mm×4.6 mm，5 μm）；流動相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為210 nm。

1.2.2 LC-MS法檢測九阡李果實發育期氨基酸的含量準確稱量0.5 g樣品；加入0.001 mol/L HCl的20%乙 醇 溶 液3 mL；低 溫 水 浴 超 聲30 min，4℃12 000 g離心5 min，取上清液，沉淀加入1 mL提取液重新提取2次；合并3次上清液，定容至6 mL；吸取1 mL液體，過0.22 μm水相濾膜，置于-20℃冰箱待上機檢測。

色譜條件：色譜柱為Polaris 180A C18-A（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL；檢測波長為210 nm。

2 結果與分析

2.1 發育期主要有機酸的含量變化

2.1.1 發育期有機酸的檢測分析采用HPLC法對九阡李果實樣品進行有機酸檢測，共檢測出5種有機酸，分別是琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、富馬酸、蘋果酸。在九阡李5個發育時期內，有機酸平均含量最高為奎寧酸，達93.56 μg/g，其次為琥珀酸，平均含量為44.61 μg/g。莽草酸、蘋果酸、富馬酸平均含量較低，分別為2.03、0.64、1.40 μg/g（表1）。從有機酸平均含量來看，奎寧酸占總有機酸含量的65.78%，琥珀酸占總有機酸含量的31.36%。從有機酸積累量來看，成熟期果實5種有機酸積累量含量高低表現為奎寧酸＞琥珀酸＞富馬酸＞莽草酸＞蘋果酸，奎寧酸占總有機酸含量的64.35%，琥珀酸占總有機酸含量的33.16%，含量明顯高于富馬酸、莽草酸、蘋果酸，這3種有機酸僅占總有機酸含量的2.49%。

表1 有機酸含量測定

2.1.2 發育期主要有機酸的含量變化分析如圖1所示，在九阡李果實發育初期到中期奎寧酸含量逐漸減少，發育后期奎寧酸含量急劇增高達到峰值，至成熟期其含量減少至發育初期含量水平，奎寧酸含量在果實發育期有明顯變化，但成熟期奎寧酸含量與幼果期含量無明顯變化。琥珀酸在九阡李果實發育期內含量變化整體呈先緩慢降低再緩慢升高再緩慢降低的趨勢，與奎寧酸不同，琥珀酸在整個果實發育期雖有變化，但整體波動不大，同樣在發育后期含量達到峰值（圖2）。

圖1 奎寧酸含量變化

圖2 琥珀酸含量變化

2.2 發育期氨基酸的含量變化分析

九阡李發育過程中的氨基酸含量變化如表2所示，九阡李供試樣品中共檢測出22種氨基酸，包括8種必需氨基酸。這22種氨基酸在九阡李發育過程中呈5種變化趨勢：同型半胱氨酸在九阡李果實整個發育期內含量基本沒有變化，S-腺苷甲硫氨酸在發育期內含量呈先升后降的趨勢，谷氨酸在發育期內呈升-降-升-降的變化趨勢，纈氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸5種氨基酸在發育期內呈升-降-升的變化趨勢，其余14種氨基酸呈升-降的變化趨勢。22種氨基酸在九阡李整個發育期內，平均含量高低表現為天冬酰胺＞谷氨酰胺＞脯氨酸＞纈氨酸＞異亮氨酸＞絲氨酸＞γ-氨基丁酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞組氨酸＞谷氨酸＞丙氨酸＞色氨酸＞蘇氨酸＞苯丙氨酸＞酪氨酸＞精氨酸＞賴氨酸＞甘氨酸＞S-腺苷甲硫氨酸＞甲硫氨酸＞同型半胱氨酸，其中，前8種氨基酸含量＞100 μg/g，中間11種氨基酸含量處于10?100 μg/g，后3種氨基酸含量＜10 μg/g。天冬酰胺在整個發育周期內平均含量遠高于其他21種氨基酸，平均含量達1 797.30 μg/g。九阡李成熟期氨基酸含量達100 μg/g以上的有天冬酰胺（641.62 μg/g）＞脯氨酸（396.62 μg/g）＞絲氨酸（151.86 μg/g）＞天冬氨酸（116.98 μg/g）＞纈氨酸（100.51 μg/g）。天冬酰胺、脯氨酸在總氨基酸中占比分別為33.69%、20.82%，為主要氨基酸。

表2 氨基酸含量測定 （單位：μg/g）

3 小結與討論

果實有機酸組成與含量受基因控制［20］及果實發育的調控［21］，還與其他環境因子有關。李屬果實大部分以蘋果酸為主要有機酸，而在歐洲李（Prunus domesticaL.）果實中奎寧酸含量最高，本試驗采用HPLC法在九阡李果實中檢測出5種有機酸，其中奎寧酸、琥珀酸含量遠高于其他3種有機酸，奎寧酸含量占總有機酸含量的64.35%，確定九阡李是以奎寧酸、琥珀酸為主要有機酸，這可能是導致九阡李相較于其他李品種具有獨特風味的主要原因，例如貴州省優異李品種蜂糖李為蘋果酸型。奎寧酸和琥珀酸含量總體都呈降-升-降的變化趨勢，皆在果實發育后期達到峰值，成熟期有機酸含量降低是由于有機酸作為糖酵解、三羧酸循環（TCAC）及糖異生作用的基質被消耗［22］，有機酸在果實發育過程中是果實品質形成的基礎物質和代謝能量保障［23］。通過LCMS法檢測九阡李果實在發育期內的氨基酸含量，測出22種氨基酸，這些氨基酸在九阡李發育期內含量變化差異明顯，共出現5種變化規律。其中，天冬酰胺、脯氨酸含量豐富，占總氨基酸含量的54.51%，證明九阡李區別于大多數以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸為主要氨基酸的果樹品種，天冬酰胺含量呈現出在果實發育前期快速增長，之后逐漸降低的變化趨勢，這可能是因為果實發育中期受有機酸快速積累的影響。而脯氨酸也在發育前期迅速積累，發育中期急劇降低后又迅速積累至果實成熟。