微生物源生防殺菌劑的篩選方法研究

張志剛，王開梅，吳兆圓，萬中義，方偉

（湖北省生物農藥工程研究中心/湖北省農業科技創新中心生物農藥分中心，武漢 430064）

微生物源生物殺菌劑（或微生物源提取物）的篩選和化學殺菌劑的篩選相比，生物殺菌劑樣品中不僅包括微生物代謝產物（化合物），而且還含有微生物菌絲（或孢子）。在篩選培養過程中，這些菌絲（或孢子）會持續擴張生長。同時，作為防治目標的模式靶標——植物病原真菌也會持續生長。由于樣品中的微生物和模式靶標同時生長，所以常用的應對措施是把2個微生物接種到同一培養基（例如PDA培養基）中，并且兩者之間有一定的空間間隔，通過觀察生長交匯區域的菌絲生長狀況來確定這2種微生物之間是否存在抑制作用。由于樣品微生物的代謝產物因培養基不同，其產量及種類有很大差異，所以這種方法不足以反映生防菌發酵液樣品全部成分的活性，只能比較2種菌在測試培養基中是否形成抑制［1，2］。在微生物源生物殺菌劑的篩選培養過程中，樣品微生物和靶標微生物均會持續擴張生長，形成對營養及空間的競爭，活性反應可能源于樣品微生物代謝產物的殺菌作用，也可能源于2種微生物之間的競爭。因此，為了明確篩選中的活性反應來源，準確反映發酵液樣品的真實活性，有必要對微生物源生物殺菌劑樣品進行分類后測試。按照菌體和化合物分開測試的原則，把發酵液分解成以下4類，即發酵液、離心后的上清液、過濾除去菌體的上清液、活菌體（菌絲或孢子）。與直接使用發酵液或菌體進行殺菌活性篩選相比，進行樣品分類后的篩選不僅簡化了活性反應，而且能測試出菌體和發酵液中代謝產物的真實活性，減少漏篩［3，4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 模式靶標膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeobosporioides）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜猝倒病菌（Pythium aphanidematum）由湖北省生物農藥工程研究中心微生物資源室提供，試驗所用菌種保存在菌種庫中，保存溫度為-80℃，使用前用PDA培養基進行活化。

1.1.2 培養基PDA培養基、PDB培養基，瓊脂粉（DH010-4型），由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產。

1.1.3 試劑及標準樣品和標準菌株溶劑為無菌水、吐溫-80，均為市售分析純試劑；微生物源生物殺菌劑標準菌株：放線菌A17815、A18851、A19053、A20939、A20946、A65560，真 菌F0006、F0206、F0835、F0836、F1669、F2353。

1.1.4 發酵液放線菌和真菌發酵液由湖北省生物農藥工程研究中心微生物資源研究室提供。培養基配方編號為HB-M-15。

1.1.5 主要儀器、設備儀器、設備主要有臺式高速攪拌機（0?7 000 r/min）、血球計數板、光學顯微鏡、高壓滅菌鍋、超聲波振蕩器、DH-S10型手持式組織勻槳機、0.22 μm細菌濾器、5 mL無菌注射器、旋轉振蕩器、移液器、96孔組織培養板（淺孔）、96孔組織培養板（深孔）、90 mm培養皿、生化培養箱、無菌操作臺、酶標儀（THERMO MK3型）、臺式離心機（EPPENDORF 5418型）、游標卡尺。

1.2 方法

1.2.1 培養基、篩選用培養板及培養皿準備PDA培養基滅菌后分裝到培養皿，每個培養皿加入18? 20 mL，冷卻備用。PDB培養基加入瓊脂粉（0.3%），滅菌后備用。

1.2.2 發酵液及其他微生物源樣品準備根據試驗需要，把發酵液樣品進行不同處理［5，6］，離心后得到上清液、無菌上清液、菌絲和發酵液4類樣品。取1.5 mL發酵液進行離心，速度14 000 r/min，取0.8 mL上清液，作為離心后上清液移入96孔組織培養板（深孔）中備用。濾渣加無菌水清洗、離心3次后，加入0.8 mL無菌水，混勻后取0.8 mL，作為菌絲樣品移入96孔組織培養板（深孔）中備用。取1.5 mL發酵液使用0.22 μm細菌濾器過濾得到無菌上清液，取0.8 mL無菌上清液移入96孔組織培養板（深孔）中備用。取0.8 mL發酵液移入96孔組織培養板（深孔）中備用。

1.2.3 供試病原真菌培養物準備參考已有資料制備供試病原菌培養物［7，8］。①灰霉病菌孢子懸浮液制備。取培養3周后的純培養物（半徑為45 mm的培養皿），在培養皿中加入10 mL無菌水，用刮鏟輕刮培養物表面，洗下孢子，制成孢子懸浮液。用細胞計數板進行孢子計數。如其中混有部分菌絲，用滅菌的醫用紗布將菌絲過濾掉。②膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌、西瓜猝倒病菌菌絲懸浮液制備。將擴大培養1周后的純培養物（300 mL三角瓶，加入100 mL PDB培養），加入高速攪拌機，以5 000 r/min的速度攪拌，攪拌累計60 s，以尼龍網過濾，濾液為菌絲懸浮液。用細胞計數板進行菌絲計數。灰霉病菌孢子懸浮液濃度為10 000個孢子/mL，膠孢炭疽菌、番茄枯萎病菌、西瓜猝倒病菌菌絲懸浮液濃度為30 000個孢子/mL。

1.2.4 平板對峙法中樣品和靶標的距離及培養時間與活性反應的關系試驗

1）活性評價指標［9，10］。測量對照組中靶標菌落面積和樣品組中靶標菌落面積，比較面積差值，計算靶標菌菌落缺損率，菌落缺損率=（1-樣品組菌落面積平均值/對照組菌落面積平均值）×100%。按缺損率進行梯度分級統計，分級梯度為0、1、3、5、7、9。梯度分級標準：0表示缺損率＜5%；1表示缺損率為［5%，20%］；3表示缺損率［21%，40%］；5表示缺損率［41%，60%］；7表示缺損率［61%，80%］；9表示缺損率＞80%。

2）平板對峙法中樣品和靶標的距離及培養時間與活性反應的關系。移取5 μL發酵液樣品和5 μL靶標菌菌絲懸液（或孢子懸液），接種到“1.2.1”中提前制備的PDA培養基表面，樣品菌和靶標菌接種點以培養皿中心位置為對稱點，相距一定的距離接種。樣品菌和靶標菌的接種距離為2個接種物外沿距離。接種距離分別為2、7、15、25 mm。其中最大距離（25 mm）的確定是以生長最快的西瓜猝倒病菌的菌落培養24 h為依準。接種點樣品面積半徑不超過1.5 mm。每個接種距離重復接種3個培養皿，空白對照為無菌培養基HB-M-15。培養條件：溫度20℃，相對濕度70%?80%，黑暗。每天記錄所有靶標菌菌落面積，持續6 d。

1.2.5 不同樣品類型在平板對峙法和半固體法中對西瓜猝倒病菌的敏感性試驗

1）活性評價指標及方法［11，12］。平板對峙法的活性評價指標及測度方法同“1.2.4”。樣品和西瓜猝倒病菌菌絲懸液接種點以培養皿中心位置為對稱點，相距2 mm。設2個重復。空白對照為無菌培養基HB-M-15。培養條件：溫度20℃，相對濕度70%? 80%，黑暗。記錄培養1 d和3 d的靶標菌菌落面積。

2）半固體培養基法的評價指標及方法。根據活性反應的不同，使用分級指標數（0、1、3、5、7、9）標記殺菌活性；96孔組織培養板中感染培養基加入量為0.095 mL/孔，樣品加入量為0.005 mL/孔。每個樣品用1個濃度，設2次重復。空白對照為無菌培養基HB-M-15。培養條件：溫度20℃，相對濕度70%? 80%，黑暗。記錄培養3 d的活性反應。

2 結果與分析

2.1 平板對峙法中樣品菌及靶標菌在測試培養基上菌落半徑的增長速率

4個靶標病原真菌、真菌發酵液樣品和放線菌發酵液樣品在測試培養基中菌落的增長速度存在差異，如圖1a、圖1b所示。4個病原真菌和6個供試真菌在測試培養基中菌落增長速度相近，除西瓜猝倒病菌在培養2 d后就長滿培養皿外，其余真菌菌落在培養6 d時達30 mm左右。而放線菌在測試培養基中菌落半徑增長速度相對較慢，菌落半徑在培養6 d時僅達1.62?2.81 mm（圖1c）。靶標菌、真菌樣品和放線菌樣品在測試培養基中菌落擴張速度相差近10倍，如此大的差異在平板對峙法中勢必影響抑菌圈的形成和大小變化。

圖1 真菌和放線菌在測試培養基中菌落半徑的增長速率

2.2 平板對峙法中樣品與靶標的距離及培養時間與活性反應的關系

發酵液接種到培養基表面后，一方面樣品中的殺菌活性化合物會向四周擴散，當抑菌化合物接觸到靶標菌時，靶標菌的菌絲生長受到抑制，菌落因此形成缺損。同時，樣品中菌絲和靶標菌的菌絲也在持續擴張生長。從表1可以看出，平板對峙法中樣品與靶標的距離越近，樣品的活性越強；除了靶標菌完全被抑制（梯度分級為9）的情況，隨著培養時間的延長，樣品引起的靶標菌落缺損率遞減；由于真菌樣品中活菌隨培養時間延長擴張生長，真菌樣品的菌絲和靶標菌絲出現重疊交叉，最后抑菌圈分界區域被完全覆蓋。而放線菌樣品的菌落擴張速度慢，因此，抑菌圈的分界區域在6 d內一直存在，且該區域面積相對穩定，樣品和靶標菌絲也無重疊交叉。

表1 不同接種距離和不同培養時間4個靶標菌菌落平均缺損率梯度分級

2.3 不同類型樣品在平板對峙法和半固體培養基法中對西瓜猝倒病的敏感性

通過對4種樣品的含菌量計數發現，發酵液和菌絲樣品中含有大量活菌（100萬?300萬個菌絲或孢子/mL），離心上清液中含有少量活菌（500?1 000個菌絲/mL），無菌上清液中無活菌存在。結果（表2）表明，在平板對峙法中，發酵液活性反應最強，無菌上清液和離心上清液活性反應次之，菌絲樣品活性反應最弱。當培養時間延長到3 d后，所有樣品的無菌上清液活性全部消失，而其他含有活菌的樣品中有部分還保持活性。可見，在平板對峙法中活菌存在對保持樣品的活性反應有一定作用。在半固體培養基法中，無菌上清液樣品表現出最強活性，離心上清液活性反應次之，含有大量菌絲的2類樣品由于樣品菌絲和靶標菌絲的同時生長，不能進行正常活性分級評價。可見，在半固體培養基法中，非靶標菌的活菌存在會引起類似雜菌污染的假陰性結果。

表2 不同類型樣品在平板對峙法和半固體培養基法中對西瓜猝倒病菌的活性

續表

3 小結與討論

生防菌在防治過程中，存在著2種主要的抑菌方式：其一是源于樣品中抑制病原菌的化合物，這類化合物隨著時間的延長，因被環境稀釋或分解而活性降低；其二是隨著培養時間的延長，樣品菌在環境中不僅會持續擴大生存空間，同時也會持續產生抑制病原菌生長的活性化合物。這是生防菌應用的優勢，在生防菌的篩選中可利用起來。半固體培養基法是一種比較成熟的化合物或提取物的殺菌活性篩選方法。平板對峙法由于操作比較復雜，而且測試需要的空間也比較大，在化合物或提取物的殺菌活性高通量篩選中應用較少。在生防菌活性測試樣品中，單純測試生防菌中化合物的活性不能完全反映防治環境條件下生防菌的真實防效。如果能讓活菌與靶標菌同時生長，就與生防菌在實際應用環境中的情況相似，可以更準確地反映生防菌在實際應用中的真實防效。因此，在生防菌的活性測試中應該綜合考慮抑菌活性化合物及活菌的單一和協作效果。