中國荷斯坦奶牛RPL23A、ACACB 基因3個SNPs檢測及其與產奶性狀的關聯分析

呂小青，楊宇澤，趙 鳳，焦 洋，李艷華，楊 超，路永強，孫東曉，麻 柱，劉 林*

(1.北京奶牛中心，北京 100192； 2.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點實驗室，北京 100192；3.農業農村部奶牛遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100192；4.北京市畜牧總站，北京 100107； 5.中國農業大學動物科技學院，北京 100193)

產奶性狀是奶牛最重要的經濟性狀，包括產奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率，屬于受大量基因和諸多環境因素共同影響的數量性狀。在過去的幾十年里，數量性狀位點(QTL)、候選基因分析和全基因組關聯研究(GWAS)被廣泛用于鑒定奶牛的產奶性狀基因，例如1、和2等基因已被證實與產奶性狀顯著相關。

RNA測序(RNA-seq)通過高通量技術進行測序分析，已成為分析基因表達模式的一種全面、準確的工具。通過對具有極端高、低乳蛋白率和乳脂率的4頭中國荷斯坦牛乳腺組織進行RNA-seq轉錄組測序，結果共鑒定出31個差異表達基因，有14個基因既位于奶牛乳蛋白、乳脂性狀QTL區段又臨近顯著SNP位點，其中包括23A等基因。牛核糖體蛋白L23A(ribosomal protein L23a,23A)基因位于19號染色體上，全長2 871 bp，由5個外顯子和4個內含子組成，mRNA全長614 bp，共編碼156個氨基酸。RPL23A是一種核糖體蛋白，是60S亞單位的一個組成部分，在細胞分化、分裂和凋亡等功能蛋白合成過程中起重要作用。所以，23A基因可以作為影響產奶性狀的候選基因進行遺傳效應分析。

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰單酰輔酶A，屬于生物素依賴性酶。ACC廣泛存在于多種生物中，在人類和其它哺乳動物中該酶屬于組織特異性酶，存在兩種變構體ACC1(或稱ACCα)和ACC2(或稱ACCβa)，分別由和基因編碼。乙酰輔酶A羧化酶B(ACACB)是一種促進脂肪合成的限速酶，在糖脂代謝中起重要作用。之前的研究表明，基因位于已知對產奶量和乳成分性狀有很大遺傳效應的區域。牛的基因位于第17號染色體上，全長116.36 kb，包含58個外顯子和57個內含子。其mRNA全長7 007 bp，共編碼2 331個氨基酸，mRNA序列與人的同源性為86%，氨基酸序列與人的同源性為88%。基因被認為是影響牛奶成分的一個潛在重要候選基因。課題組前期RNA-seq研究鑒定了一批候選功能基因的遺傳效應，確定23A和基因與中國荷斯坦牛產奶量和乳成分性狀顯著關聯；因此本研究選擇23A和基因的3個SNPs位點在荷斯坦群體中進行驗證。

本研究采用檢測成本低、準確性高的微流控芯片SNP 分型技術，對前期研究獲得的與產奶性狀潛在關聯的23A和基因的3個SNPs位點進行大樣本驗證及關聯性分析，并進行群體多態性分析，為奶牛產奶性狀功能基因的挖掘以及高乳成分性狀群體的選育提供可靠的候選基因標記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究以北京地區8個牛場的1 596頭中國荷斯坦母牛為試驗群體，所有個體均為3胎以內的泌乳牛，每頭牛所有測定日的產奶量、乳脂率、乳蛋白率等數據來源于中心奶牛生產性能測定實驗室。試驗個體通過EDTA 抗凝真空管采集尾根血樣4 mL，-20 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

血液DNA 提取試劑盒以及RNA酶購自天根生化科技(北京)有限公司，其他無水乙醇、異丙醇等均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采用天根DNA提取試劑盒，根據試劑盒說明書提取血樣DNA，TB緩沖液洗脫溶解, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，同時采用 NanoDrop 2000 核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度和質量。將OD/OD值在 1.7 ～2.0 之間的樣本調整濃度約50 ng·μL，置于96孔板中，-20 ℃保存備用。

1.3.2 位點的開發與設計 檢索NCBI數據庫發布的23A(GenBank登錄號為NC_037346.1)、基因序列信息(GenBank登錄號為NC_037344.1)，根據3個SNPs位點(g.20146771G>A、g.63962768C>T、g.63878254T>C)上、下游各150 bp序列信息，利用 Primer Express3.0軟件進行引物設計。兩個等位基因特異的正向引物(分別為FAM標記、HEX標記)，一個用于野生型等位基因，另一個用于突變型等位基因，以及一個通用的反向引物(下游引物R)，被用于3個SNPs的分型檢測，具體引物信息見表1。

表1 高乳成分位點擴增引物序列Table 1 Primer sequences for high milk composition SNPs

1.3.3 SNP分型檢測 本研究中SNP基因型檢測由北京博奧生物技術有限公司完成，SNP分型采用基于微流控芯片的SNP檢測系統，其原理是在微流控芯片上完成基于等位基因特異擴增原理的基因分型。SNP分型檢測流程如下：1)配置 PCR 擴增反應體系，用移液器將配置的反應體系從芯片入口注入到芯片里，并密封進出口。2)將芯片放入到離心機中 4 000 r·min離心 1 min；放入芯片熱封儀中進行熱封 1 s。3)放入平板 PCR 儀上進行擴增反應，PCR 擴增體系約1 μL:DNA模板20 ng, Mix(2×) 0.5 μL，0.14 μL引物混合物(包括兩種等位基因特異性上游引物各12 μmol·L，通用下游引物30 μmol·L)，以及0.36 μL ddHO。4)PCR 擴增程序:95 ℃預變性15 min;95 ℃變性 20 s,61～55 ℃ 60 s，共 10個降落擴增循環(每循環降0.6 ℃)，之后26個擴增循環，95 ℃變性 20 s,55 ℃ 60 s; 37 ℃ 60 s完成擴增。5)PCR 擴增程序運行結束后，通過 LuxScan-10K/D 掃描儀進行掃描，生成 tif 文件，通過軟件轉換成數據信號值，然后將原始數據導入 SNPTyper 軟件中，可輸出每個位點 SNP 分型結果，例如基因型、信號值、檢出率等。

1.4 數據分析

1.4.1 表型數據及基因型數據的質量控制 牛只具有完整的系譜信息和規范的DHI測定記錄，包括第一泌乳期記錄989條和第二泌乳期記錄666條。表型數據包括305 d產奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量5個性狀。

1.4.2 關聯分析 本研究采用 SAS 9.4 軟件中的 MIXED 過程對試驗群體的中國荷斯坦母牛產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5個產奶性狀和SNP位點基因型進行關聯分析，采用動物模型如下：

=++×+++

其中，為個體產奶性狀(產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率)表型值，為總體均值，為場年季效應，為協變量的回歸系數，為產犢月齡效應，為基因型，為個體隨機加性效應，為隨機殘差效應。多重比較采用Bonferroni法進行矯正，本模型中場年季水平合計47個。

1.4.3 遺傳參數計算 利用GenAlE x6.5軟件計算 3 個 SNPs 位點在荷斯坦牛群中的等位基因頻率及基因型頻率等遺傳參數。

2 結 果

2.1 DNA 提取結果

對血液樣本進行了 DNA 提取，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰單一，DNA 的OD/OD值、濃度、體積均達到位點分型檢測要求，部分樣本電泳檢測結果見圖1。

M.DL2000 marker; 1.170062; 2.170063; 3.170064; 4.170065; 5.170066; 6.070067; 7.180001; 8.180003圖1 8 個樣本DNA電泳檢測結果圖Fig.1 Plot of DNA electrophoresis results from 8 samples

2.2 SNP位點分型檢測

采用微流控平臺進行PCR擴增，根據熒光信號的散點圖，確定測定個體基因型，每個位點既有位點純合子，也有雜合子。通過對高乳成分位點的檢測，3個高乳成分位點的檢出率均在98.9%以上，位點分型結果見圖2，X軸代表兩種熒光(FAM 和HEX)的比值，Y軸代表熒光的強度。

a. rs133967247分型結果圖；b. rs134128952分型結果圖；c. rs209975092分型結果圖。X軸代表兩種熒光的比值，Y軸代表熒光的強度a. rs133967247 typing result diagram; b. rs134128952 typing result diagram；c. rs209975092 typing result diagram. The X-axis represents the ratio of two kinds of fluorescence, and the Y-axis represents the intensity of fluorescence圖2 3個SNPs位點分型結果圖Fig.2 Genotyping results of 3 SNPs

利用高通量技術對北京地區荷斯坦牛群體中的高乳成分位點進行檢測，3 個 SNPs 位點經微流控芯片技術分型，結果顯示 3個位點基因型檢出率均大于90%，位點基因型檢出率及等位基因頻率見表2，分型數據可用于后續關聯分析。群體中23A基因優勢位點rs134128952等位基因G的頻率為68.62%，A等位基因的頻率為31.38%；基因優勢位點rs209975092等位基因C的頻率為30.22%，T等位基因的頻率為69.78%；基因優勢位點rs133967247等位基因T的頻率為60.74%，C等位基因的頻率為39.26%。通過精準的選種選配可進一步提高優勢等位基因的頻率。

表2 優勢位點等位基因頻率結果統計Table 2 Statistics of allele frequency results of dominant loci

2.3 與產奶性狀的關聯分析

23A基因的SNP位點g.20146771G>A與5個產奶性狀的關聯分析結果見表3。在第一泌乳期，g.20146771G>A與產奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量均達到極顯著關聯(<0.01)，與乳蛋白率關聯不顯著(>0.05)；第二泌乳期，g.20146771G>A與5個產奶性狀均呈極顯著關聯(<0.01)。

表3 RPL23A基因SNP位點與5個產奶性狀的關聯分析(最小二乘均值±標準誤)Table 3 Association analysis between SNP locus of RPL23A gene and 5 milk production traits(least squares mean±standard error)

基因的2個SNPs位點與5個產奶性狀的關聯分析結果見表4。SNP位點g.63962768C>T在第一泌乳期，與產奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白量均呈極顯著關聯(<0.01)，與乳蛋白率呈不顯著關聯(>0.05)；在第二泌乳期，與產奶量、乳脂量、乳脂率和乳蛋白率呈極顯著關聯(<0.01)，與乳蛋白量關聯不顯著(>0.05)。SNP位點g.63878254T>C在第一泌乳期中，僅與乳脂量呈極顯著關聯(<0.01)，與其余4個產奶性狀均無顯著關聯(>0.05)，在第二泌乳期中，除乳蛋白量無顯著關聯外(>0.05)，其余4個產奶性狀均有極顯著關聯(<0.01)。

表4 ACACB基因的2個SNPs位點與5個產奶性狀的關聯分析(最小二乘均值±標準誤 )Table 4 Association analysis between two SNPs of ACACB gene and 5 milk production traits (least squares mean±standard error)

3 討 論

23基因是真核生物核糖體不可或缺的組成部分，在蛋白質合成、折疊及排列中具有重要作用。它的主要功能之一是在核糖體的合成和功能中發揮關鍵作用，可提高rRNA合成蛋白質的催化能力。核糖體蛋白可以調節基因轉錄、mRNA翻譯、細胞凋亡和DNA修復。根據之前的研究，23A可能是一種正調控乳蛋白量的基因。本研究結果提示，23A基因是一個影響奶牛乳脂率、乳蛋白率性狀的重要關鍵基因，23A基因位點rs134128952與第一、第二泌乳期的乳脂率、乳蛋白率均達到顯著關聯水平(<0.01)。Li等首次在23A基因中發現了1個單倍型塊與產奶性狀關聯顯著，同時發現1個SNP位點(g.20702122 C>G)可能通過改變轉錄因子結合位點而顯著影響產奶性狀。

ACACB是調節脂肪代謝的限速酶，定位于線粒體外膜肉堿棕櫚酰轉移酶附近，它可能對脂代謝起調節作用。脂肪酸氧化研究發現，人類的等位基因變體可能與代謝綜合征相關，據報道的等位基因變異與產奶特性有關，如在山羊和牛中。本研究結果表明，基因的2個SNPs位點與第一、二泌乳期的乳脂率顯著相關，此外是脂肪酸氧化的關鍵調節因子，因此認為及其SNPs可能影響牛奶中的乳脂成分。Han等研究發現，基因2個SNPs位點，rs135874354 (g.66218726T>C)和rs210928430 (g.66218117G>A)與產奶量、脂肪含量顯著相關，轉錄因子結合位點分析表明，rs135874354被認為是一個潛在的功能性突變。

奶牛全基因組評估自2008年開始，隨著基因分型成本的降低，進行基因分型的奶牛數量持續增加，這些記錄將成為用于基因組評估的基本數據。在選擇目標中，產奶性狀是奶牛的主要生產性狀，挖掘奶牛的產奶性狀功能基因位點和重要遺傳變異一直是我國奶牛分子育種的關鍵。此外，產奶性狀是一種數量性狀，由微效多基因決定，影響奶牛產奶性狀的候選基因如1D、3、2、等已被文獻證實，可以通過挖掘影響奶牛產奶性狀的關鍵基因，進一步改良奶牛產奶性狀，為從分子水平提高奶牛產奶性能提供依據。

研究表明，3 SNP g.12264 C>T的主要等位基因C與試驗日產奶量、蛋白質百分比和305日產奶量呈正相關，進一步分析表明，該位點的C/T轉換產生兩個新的轉錄因子結合位點(TFB)，E2F1和Nkx3-2。2基因SNP g.14061A>G和g.14819C>T和組合基因型Hap1/5的關聯分析表明，中國荷斯坦奶牛的產奶性狀顯著受這些基因位點的影響(<0.05)。功能SNP位點與產奶性狀之間的關聯可用于標記輔助選擇，用于產奶性狀的遺傳改良，并可能與其他性狀一起用于選擇，以提高奶牛的適應性。

根據對荷斯坦奶牛泌乳相關基因研究進展進行綜合分析發現，目前大部分泌乳相關基因未進行相關性分析和功能驗證。功能SNP位點驗證可通過與產奶性狀關聯分析、在牛乳腺上皮細胞中開展RNAi功能分析或信號通路分析等。在后期的研究中，需進一步擴大泌乳基因研究范圍，并積極開展功能驗證，以便于更準確地應用于奶牛群體遺傳改良。

4 結 論

通過奶牛功能性SNP與產奶性狀之間的關聯分析，揭示了單核苷酸多態性對產奶量和乳成分的影響。本研究結果表明，23A、基因3個SNPs是影響奶牛產奶量和乳成分的潛在功能性突變，23A、基因可以作為影響中國荷斯坦奶牛產奶性狀的候選基因用于標記輔助選擇，以上基因位點可能通過直接或間接的途徑影響奶牛的乳脂或乳蛋白性狀，對產奶性狀起到重要調控作用。本研究為荷斯坦奶牛后續的標記輔助選擇奠定了良好的基礎。