毒素-抗毒素系統在細菌生物被膜形成中的作用及調控機制

侯 博，王晨燕，周倫江

(福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福州 350013)

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, T-A)系統廣泛存在于細菌基因組或質粒中，在調控細菌的生理活動中發揮著重要的作用，包括維持基因組的穩定性、促進抗生素壓力下持留細胞的形成、增強噬菌體感染的耐受性、調控細菌細胞程序性死亡和致病力以及生物被膜的形成，因此T-A系統已成為多重耐藥病原菌致病機理和防控技術研究的新靶標，引起了國內外研究者的高度關注。本文將對T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用和調控機制進行綜述，以期為更好地掌握T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用以及二者之間的調控機制提供參考。

1 細菌生物被膜的危害性

細菌生物被膜是細菌黏附聚集到有生命或無生命固體表面形成具有復雜結構的群落組織，廣泛存在于自然界，可在江河、巖石以及自來水管和人及動物體內組織等表面形成，具有廣泛的危害性。細菌生物被膜作為細菌重要的抗應激機制之一，是細菌適應應激環境(不利環境)而采取的一種生存策略，具有極強的耐藥性及免疫逃逸性，是造成臨床慢性感染和持續感染的主要原因之一，研究顯示：生物被膜細菌對抗生素和殺菌消毒劑的抵抗力比懸浮的非生物被膜細菌高100倍～1 000倍，成熟的生物被膜(生長期超過2%)比新生物被膜(生長期小于2%)耐藥性更強，因此細菌生物被膜可導致抗菌藥物在獸醫臨床上的治療失敗。生物被膜存在于農產品加工業、乳品加工業、魚品加工業、禽和肉品加工業以及即食食品加工業，可存在于所有類型的食品加工裝置(如塑料、玻璃、金屬、木頭)及食品產品的表面，生物被膜的形成保護了生物被膜內細菌免受食品防腐劑、消毒劑等的清除，耐受高滲透壓(腌制食品)，增加了食品中細菌存活和后續交叉污染的可能性，并且降低了食品的保存期限，還可引起食源性傳染病的傳播而危害人類健康。因此，對于生物被膜形成機制的研究可以為生物被膜的控制和清除提供新的思路和研究策略，本文對T-A系統參與細菌生物被膜形成的作用及其分子機制進行綜述，以期為細菌生物被膜形成的分子機制和控制與清除策略的研究提供參考。

2 T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

T-A系統最早于1983年在低拷貝質粒上被發現，目前，T-A系統普遍存在于細菌和古細菌中，包括人類和動物的致病菌。T-A系統均由2個共表達基因組成，一個基因編碼結構較為穩定的毒素分子，另一個編碼不穩定的抗毒素分子。目前根據抗毒素的性質和T-A系統的組成將T-A系統分為8種類型，并且越來越多的研究已經證實T-A系統參與了細菌的生物被膜形成。

2.1 Ⅰ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

在Ⅰ型T-A系統中毒素分子是蛋白質，抗毒素分子是由編碼毒素的基因反方向轉錄而成的反義RNA，其抑制毒素蛋白mRNA的翻譯，這一類T-A包括-、-、-、-、-、-、-、-4、-等。枯草芽胞桿菌Ⅰ型T-A系統有-、-4、-5、-6、-等，在營養限制條件下，毒素基因缺失導致非正常形態細菌聚集，干擾細菌群落的正常形成而破壞生物被膜的對稱性；氮分子缺乏增強TxpA毒素的轉錄，同時使生物被膜中的細菌對TxpA的作用變得更為敏感。金黃色葡萄球菌Ⅰ型T-A系統的毒素基因2不僅可以被抗毒素分子2抑制，還可以被SarA抑制，而SarA影響細菌的毒力、代謝、生物被膜形成和對抗生素的耐藥性，并且抑制生物被膜形成相關基因操縱子和1的表達，因此2-2對細菌生物被膜形成的影響可能與SarA有關。大腸桿菌生物被膜形成誘導Ⅰ型T-A系統毒素基因的表達，而在中生物被膜相關的因子對部分Ⅰ型T-A系統具有調控作用。

2.2 Ⅱ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

Ⅱ型T-A系統的毒素和抗毒素分子均為小分子蛋白質，抗毒素蛋白與毒素蛋白直接相互作用形成緊密結合的復合物抑制子而發揮作用，目前研究最普遍和最廣泛的是Ⅱ型 T-A 系統，在K-12染色體上至少有19對Ⅱ型T-A 系統，包括、、-、-、-、-、、、、、和等，大多數的毒素分子均為核糖核酸內切酶(RNase)，以不同的特異性分別剪切mRNA抑制蛋白翻譯，而抗毒素分子直接通過蛋白質相互作用中和毒素分子的功能發揮，并且可以通過與啟動子區域的操縱元件結合調控T-A操縱子轉錄，其中，RelE、YoeB、YafO、YafQ和YhaV毒素蛋白具有翻譯依賴性RNase活性，而MazF、ChpBK、HicA和MqsR毒素蛋白的核糖核酸內切酶活性與核糖體無關。

目前，越來越多的研究已經證實多個Ⅱ型T-A系統參與了細菌生物被膜的形成，在腸外致病性大腸桿菌中缺失Ⅱ型T-A系統、-和均可使細菌的生物被膜形成能力顯著下降。MqsRA是第一個被發現與生物被膜形成有直接作用的Ⅱ型T-A系統，并且對其調控生物被膜形成的分子機制進行了較深入的研究。MqsR表達下降可以直接降低參與curli菌毛形成的調控子CsgD 的表達，導致信號分子c-di-GMP和curli菌毛的形成減少，促使生物被膜形成能力下降。而氧化應激作用使Lon蛋白酶對MqsA發生降解作用，促使生物被膜形成。MqsR的核酸內切酶活性在5′-GCU位點特異性地剪切mRNA，并且這種特異性還可降解Ⅴ型抗毒素蛋白GhoS的mRNA，從而對Ⅴ型T-A系統GhoT-GhoS起調控作用。然而，也有研究結果表明，大腸桿菌缺失菌株不影響生物被膜的形成，與野生型菌株具有相似的細菌附著生物量，并且curli菌毛形成和的表達沒有差異性。此外的超表達也不影響細菌附著生物量和curli菌毛的形成，推測Ⅱ型T-A系統在調控細菌生物被膜形成中具有復雜性，或許因菌株不同或種屬不同而具有差異性。因此T-A系統對生物被膜的調控具有不同的分子機制，仍然需要進一步大量研究明確其差異性才能更好地掌握T-A系統參與生物被膜形成的作用機理。

有研究報道，分別缺失Ⅱ型T-A系統MazEF、RelBE、ChpB、YoeB-YefM或YafQ-DinJ的菌株生物被膜在形成初期受到抑制，導致生物被膜形成能力下降，主要原因是由于細菌的附著能力下降，然而在生物被膜形成后期這些缺失菌株通過減少生物被膜的分散作用而增強了生物被膜形成能力；通過對這5個缺失株轉錄組的分析發現共同誘導了一個功能未知蛋白基因的表達；5個毒素蛋白的缺失可以促進生物被膜的早期形成，而超表達毒素蛋白則可以在早期抑制生物被膜的形成，并且證實基因可以控制細菌生物被膜的形成，與5個T-A系統的缺失對生物被膜的影響具有一致性。當大腸桿菌K-12菌株中毒素基因缺失后，其生物被膜形成能力與野生菌相似，但缺失菌株生物被膜暴露于殺菌濃度的頭孢唑林和妥布霉素中，生物被膜中的活菌數下降了2 400倍以上，而超表達基因的菌株活菌數增加了10 000倍以上。因此T-A系統不僅在生物被膜形成期具有影響作用，而且還可以增強生物被膜中細菌的耐受性，進而增加生物被膜的危害性，這將對生物被膜的清除和控制提出更大的挑戰。

大腸桿菌中CcdAB和HipAB在致病菌中是非常保守的，在Nissle 1917(EcN)菌株中，抑制或基因的表達顯著降低EcN菌株在平臺穩定期的生物被膜形成能力，當和基因同時被抑制時生物被膜形成能力急劇下降，和調控EcN菌株生物被膜和持留細菌的形成與DNA合成、SOS應激反應和嚴緊反應相關；當抑制表達后顯著降低的表達量，提示HipAB在調控EcN菌株生物被膜形成中具有正向作用，通過增加DNA的合成而促使生物被膜形成能力增強，基因缺失同樣上調嚴緊反應基因，促使生物被膜形成能力下降。當細菌暴露在亞抑菌濃度的環丙沙星下，基因缺失可以降低22%～80%的生物被膜形成量，而和轉錄被抑制后能夠上調基因的表達量。同時缺失和基因導致F1C菌毛合成相關基因表達下降，而有報道F1C菌毛在的生物被膜形成中是必需的。在無抗生素壓力下缺失BW25113菌株顯著降低生物被膜形成量，用Dnase I對BW25113野生菌株處理導致生物被膜形成顯著下降，而對缺失株生物被膜的處理影響很小；HipA失活使生物被膜形成中的eDNA水平下降，而額外添加BW25113 菌株基因組DNA可以促進野生型和缺失株的生物被膜形成；野生型與缺失株相比發生了嚴重的細菌細胞溶解，在大腸桿菌中HipA毒素蛋白通過EF-Tu的磷酸化作用而剪切RNA，抑制蛋白翻譯過程。

在銅綠假單胞菌T-A系統HigBA中，缺失和過表達的細菌生物被膜形成能力下降，表明銅綠假單胞菌毒素蛋白HigB參與了細菌生物被膜形成的調控，HigB可以降低細菌胞內c-di-GMP的水平，而c-di-GMP具有抑制生物被膜形成的作用，通過對c-di-GMP已知的代謝基因的表達水平進行分析，發現3個c-di-GMP水解基因被HigB上調，分別為PA2133、PA2200和PA3825基因，通過對這3個基因分別缺失或同時缺失可以減少HigB對生物被膜形成的調控作用。將銅綠假單胞菌在第一階段形成的生物被膜暴露于環丙沙星中導致和基因在整個試驗過程中超表達，生物被膜長期處在抗生素暴露條件下可能使HigA發生降解，或者HigB對于生物被膜的持續存在沒有發揮作用，并且缺失基因不影響銅綠假單胞菌的生物被膜形成和毒力。

在金黃色葡萄球菌Ⅱ型T-A系統MazEF中，毒素的過度表達會抑制生物被膜的形成，基因缺失在顯著增加生物被膜形成的同時，降低了生物被膜對抗生素的耐受性，而基因表達可以抑制生物被膜形成，但提高了生物被膜對抗生素耐受性，在急性感染轉變為慢性感染中發揮了關鍵作用，通過對臨床分離的金黃色葡萄球菌菌株對甲氧西林的耐藥性和生物被膜形成與的基因表達相關性分析表明，的表達與否與生物被膜形成沒有顯著的相關性。在金黃色葡萄球菌中，及其同源基因1和2缺失，降低細菌生物被膜的形成，而野生型菌株具有更高的胞間黏附素生成量，而對野生型菌株采用Dnase I 處理降低了生物被膜的形成，而對1和2基因缺失株沒有影響。

肺炎鏈球菌T-A系統-的缺失導致細菌生物被膜厚度顯著減小，然而缺失并不影響生物被膜生長，但缺失-的操縱子表現出生物被膜形成增加，表明YefM-YoeB的 T-A系統參與了生物被膜的形成。中的Ⅱ型毒素抗毒素系統YefM-YoeB在生物被膜形成中的作用與肺炎鏈球菌中不一致，YefM-YoeB缺失與野生菌TX01相比增強了細菌的耐高溫能力、生物被膜形成能力，-缺失菌株的生物被膜形成能力顯著高于野生菌株和缺失菌株，表現為生物被膜厚度和密度顯著增加，而缺失菌株表現出與野生菌株相似的水平，因此YefM-YoeB在不同病原菌種的功能和作用機制是不同的，并敦促人們研究和揭示這些T-A系統的功能和作用機制。

目前，雖對Ⅱ型T-A系統在細菌生物被膜形成的研究較多，但不同的Ⅱ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用不同，并且具有不同的分子調控機制，對于其深層次的調控機制尚不清楚，這對開發具有廣譜、有效的生物被膜抑制劑或其他清除技術帶來了巨大的挑戰。

2.3 Ⅲ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

在Ⅲ型T-A系統中，毒素分子是蛋白質，而抗毒素分子是RNA，ToxI-ToxN是第一個被發現的Ⅲ型T-A系統，RNA抗毒素分子直接與毒素蛋白相互作用而發揮活性，目前，還未見有Ⅲ型T-A系統參與細菌生物被膜形成的相關研究和報道。

2.4 Ⅳ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

在Ⅳ型T-A系統中毒素與抗毒素分子都是蛋白質，抗毒素蛋白直接競爭性結合毒素蛋白在細胞的靶位點而發揮功能，YeeU-YeeV(又名CbtA/CbeA)是第一個在中被發現的Ⅳ型T-A系統。在大腸桿菌K-12中，Ⅳ型抗毒素基因、、分別缺失或同時缺失均能夠使細菌生物被膜形成能力在早期增加2倍～4倍，然而分別缺失相對應的毒素基因、、或同時缺失僅對生物被膜的形成具有輕微的增加作用。目前對Ⅳ型T-A系統在細菌生物被膜形成中作用和分子機制亟待進一步研究和解析。

2.5 Ⅴ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

Ⅴ型T-A系統的毒素和抗毒素分子均為蛋白質，但抗毒素不是與毒素直接結合，而是抗毒素蛋白分子具有酶活性以降解毒素mRNA而發揮作用，GhoT-GhoS是第一個被發現的Ⅴ型T-A系統，毒素蛋白GhoT的表達可導致細菌死亡或造成細菌持留感染形成，抗毒素蛋白GhoS作為一種序列特異性的核酸內切酶切割mRNA而阻止翻譯，此外GhoT-GhoS還受不同應激條件的調控。在LB培養基30和37 ℃培養8 h時，缺失降低細菌生物被膜形成能力4倍以上，而缺失顯著增加生物被膜形成能力6倍以上。在應激條件下，Ⅱ型T-A系統的毒素分子MqsR降解Ⅴ型T-A系統的抗毒素的mRNA以促進mRNA翻譯產生具有活性的毒素分子從而調節細菌生理活動過程，GhoT-GhoS是第一個發現的被另一個T-A系統調節的T-A系統。因此T-A系統之間存在的相互調控作用致使T-A系統調控生物被膜形成的機制復雜化，這給研究T-A系統參與生物被膜形成中的作用和分子機理增加了很多難點。

2.6 Ⅵ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

第一個Ⅵ型T-A系統是在革蘭陰性菌中發現的，毒素蛋白SocB強有力地結合到DNA聚合酶的β-sliding clamp上阻止DNA復制延伸，而抗毒素SocA作為蛋白水解適配器蛋白質結合到毒素SocB發揮蛋白酶對SocB介導的降解作用，目前，尚未見Ⅵ型T-A系統參與細菌生物被膜形成的相關研究及報道。

2.7 Ⅶ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

Ⅶ型T-A系統是最近新分類的一類T-A系統，毒素分子和抗毒素均為蛋白質，由抗毒素分子對毒素分子進行酶促修飾而發揮作用，這種酶促修飾作用是通過毒素和抗毒素兩個分子的短暫相互作用而實現，不同于Ⅱ型T-A系統的緊密結合作用。第一個Ⅶ型T-A系統-在小腸結腸炎耶爾森菌和中被發現，Hha毒素分子是一個溶血素表達調節蛋白，通過增加細菌分散作用導致生物被膜形成下降，而抗毒素TomB在生物被膜形成中是一個毒素過表達調節子，在氧存在的條件下使毒素Hha失去活性；抗毒素TomB的活性是氧依賴性的，促進Hha單個保守的半胱氨酸Cys18發生氧化作用轉變為SOH種類的分子(包括sulfenic RSOH、sulfinic RSOH和sulfonic acid RSOH)，因此Hha-TomB作為氧感應分子參與到了細菌生物被膜的形成。在大腸桿菌中,Hha可以結合稀有密碼子tRANs(、、和)抑制稀有密碼子tRNAs的轉錄作用從而抑制菌毛基因和的轉錄導致菌毛生成的作用下降而顯著降低細菌生物被膜的形成；Hha對稀有密碼子的轉錄抑制作用還能夠激活噬菌體裂解基因、、和，并且可以引起ClpP/ClpX 蛋白酶降解抗毒素而激活毒素，這兩種作用還可以導致細菌發生溶菌和生物被膜崩解。因此T-A系統對于生物被膜形成的影響是多方面的，不僅在早期影響細菌黏附作用而降低生物被膜形成能力，還可通過對成熟的生物被膜產生分散作用而致使生物被膜發生崩解，降低細菌對于不利環境或消毒劑和抗生素的耐受性從而加速對生物被膜細菌的清除作用。

2.8 Ⅷ型T-A系統在細菌生物被膜形成中的作用

Ⅷ型T-A系統也是近年來新發現的一類T-A系統，毒素和抗毒素分子均為小RNA，其位于相同位點DNA序列的不同DNA單鏈上，抗毒素小RNA通過反向結合毒素小RNA而阻止毒素小RNA發揮作用。-是第一個被鑒定的Ⅷ型T-A系統，毒素分子SdsR可以將不同mRNA作為靶分子進行基因表達的調控，在大腸桿菌和沙門菌中分別通過抑制、和、、、的轉錄而發揮作用，而在大腸桿菌中，缺失外膜蛋白TolC導致細菌對滲透壓環境的應激改變，從而導致curli菌毛和生物被膜形成能力下降，在沙門菌中，通過外排泵抑制劑抑制TolC的功能或缺失TolC，均可導致細菌生物被膜形成能力下降，因此雖無-直接參與細菌生物被膜形成的報道，但-可能會通過TolC間接參與并調控細菌生物被膜的形成。

3 小 結

細菌生物被膜廣泛存在于自然界中，嚴重威脅人和動物的健康以及食品安全。細菌T-A系統也廣泛存在于細菌的基因組和質粒中，在細菌的生物被膜形成中發揮調控作用，有的T-A系統可以直接影響生物被膜的形成，而有的T-A系統間接影響細菌生物被膜的形成，但大部分T-A系統影響細菌生物被膜形成的分子機制尚不明確，仍需要更進一步的研究。此外，新類型的T-A系統不斷被發現，其在細菌生理活動和生物被膜形成中的作用和機制需要進一步明確。因此，通過對T-A系統影響細菌生物被膜形成的作用及分子機制的研究，開發具有針對性或特異性的消毒劑和其他藥物或生物被膜清除和防制技術，對于減輕細菌生物被膜的威脅具有重要的理論意義和應用價值。