酵母甘露聚糖肽對致病性大腸桿菌感染小鼠的保護作用

王海迪，蔡欽嶺，馬 瑞，于旻睆，劉衛敏，魏玉西

(青島大學生命科學學院，青島 266071)

甘露聚糖肽(mannatide)是我國首次采用溶血性鏈球菌發酵法成功制備的一種新型免疫增強劑，具有調節機體防御功能和提高自身抗腫瘤能力的作用，系由不同鏈長度的甘露聚糖肽分子組成，其中，不存在單糖、雙糖等小分子糖類和游離氨基酸。即使甘露聚糖肽原料中含有其他單糖或單糖組成的多糖及不同連接方式構成的糖肽，其含量也很低。因其制備原料單一、價格昂貴，探究甘露聚糖肽其他來源和制備方法成為國內研究熱點。

我國食品發酵產業發達，酵母產量巨大，亟待開發高值化利用產品。根據文獻報道，酵母細胞壁厚約70 nm，約占細胞干重的20%～30%，酵母細胞壁主要由三類多糖構成：甘露聚糖共價連接到多肽的聚合物(甘露聚糖蛋白，約占細胞壁干重的40%)、葡萄糖聚合物(β-D-葡聚糖，約占細胞壁干重的60%)和-乙酰氨基葡萄糖聚合物(甲殼素，約占細胞壁干重的2%)。啤酒酵母細胞壁中含有豐富的甘露聚糖及蛋白，是制備酵母甘露聚糖肽的良好資源。

甘露聚糖肽在人類臨床上主要應用于治療腫瘤的輔助藥，免疫力低下以及白細胞減少癥，減輕放化療對腸胃反應影響等，同時還具有抗病毒、抗呼吸道感染以及特殊的抗菌效果。李守現等通過研究α-甘露聚糖肽對斷奶仔豬生長性能的影響，發現甘露聚糖肽可以降低斷奶仔豬的發病率及死亡率，增強機體細胞免疫，增強小腸原始淋巴細胞的活性和小腸內白細胞吞噬能力。王利菊和劉耀強發現甘露聚糖肽可以提高機體對各種疾病的抵抗力。甘露聚糖肽進入腸道后可以改善細胞內外的生物活性，主動修復受損的腸道黏膜組織，增強對營養物質的吸收和利用，但目前國內尚未有酵母甘露聚糖肽對動物腸道保護作用的研究報道。

本文將通過酶解、醇沉獲得酵母甘露聚糖肽，研究其對致病性大腸桿菌(PEC)感染小鼠的保護作用。研究結果為酵母甘露聚糖肽作為新型飼料添加劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康同齡20日齡昆明小鼠(SPF級)40只，體質量18 g±2 g；健康同齡60日齡昆明小鼠(SPF級)60只，體質量35 g±2 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。

致病性大腸桿菌(PEC)，菌株編號：BNCC186732，血清型：O，由青島大學生命科學學院微生物實驗室保存。

本文所用酵母為商品啤酒酵母()，批號：20191208，購自青島啤酒酵母有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母甘露聚糖肽(MTY)制備 參照文獻[9]的方法制備并進行含量測定，結果為MTY含量達40.04%。

1.2.2 試驗分組 小鼠適應性飼喂7 d后，將40只體質量為(18±2)g SPF級昆明小鼠隨機分為4組：空白組、模型組、陽性藥物組、酵母甘露聚糖肽(MTY)組，每組10個重復，每個重復1只小鼠。對小鼠進行編號，置于潔凈動物房中飼養，采取自由采食、飲水方式，連續喂養28 d。

1.2.3 菌種復蘇 參照文獻[10]方法，對致病性大腸桿菌(PEC)進行復蘇。并將復蘇后無雜菌的PEC接種液體培養基中，收集對數生長期的大腸桿菌，重懸于無菌的PBS中，進行后期注射試驗。

1.2.4 灌胃樣品 空白組、模型組灌胃生理鹽水，用無菌生理鹽水根據體質量按1 000 mg·(kg·d)劑量配制MTY溶液，按照體質量以100 mg·(kg·d)劑量配制陽性藥物(阿莫西林)，各組每次均灌胃0.2 mL，灌胃藥現用現配。灌胃期間，均任其自由飲水、采食，并每天觀察小鼠的健康狀況。

1.3 小鼠體質量

試驗開始后，每5 d稱量1次小鼠體質量，記錄體質量變化情況并繪制圖表。

1.4 腸道微生物分析

在攻毒前一天取各組小鼠糞便置于滅菌的EP管中，每組取5只，并保存于-80 ℃冰箱，進行后續腸道微生物檢測。具體檢測方法參照文獻[12]，并利用I-Sanger平臺(美吉生物，上海)進行分析。

1.5 PEC半數致死模型試驗

小鼠適應性生長7 d后，將60只體質量為(35±2)g的試驗鼠分組，按每組10只分為6組，設為6組不同濃度為LDPEC半數致死量組，期間均自由采食、飲水。將復蘇后PEC用PBS稀釋至所需濃度，設置6個濃度分別為4.13×10、4.09×10、4.02×10、3.98×10、3.82×10、3.78×10CFU·mL，0.2 mL·只，觀察、記錄注射PEC后小鼠狀態及死亡情況。

1.6 半數致死量PEC對小鼠攻毒試驗

對模型組、陽性藥物組和MTY組小鼠進行PEC腹腔注射攻毒，每只注射半數致死量濃度的PEC溶液0.2 mL，觀察小鼠的精神狀態。用小鼠存活率來評價MTY對PEC感染的預防效果。

1.7 臟器指數測定

將小鼠處死后，取各器官組織，除去脂肪以及筋膜，在電子稱上稱重并記錄質量，計算臟器指數。公式：

臟器指數(mg·g)=器官質量(mg)/活體質量(g)。

1.8 器官切片組織病理分析

1.8.1 空腸組織PAS染色 采血后，頸椎脫臼處死小鼠，剖開腹腔取空腸組織，用滅菌后的生理鹽水沖洗干凈，置于甲醛溶液固定24 h后，組織脫水、包埋、切片，石蠟切片脫蠟至水，進行空腸組織PAS染色。經染色后杯狀細胞被染成紫紅色，選取各組空腸組織切片，在200倍顯微鏡下，每張切片選取10個視野，分別計數后，并取平均數。

1.8.2 MUC2、ZO-1的免疫組化分析蛋白質表達量 將上述“1.8.1”的石蠟切片經過抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗MUC2(廠家Servicebio，貨號GB11344，稀釋比1∶1 000)和一抗ZO-1(廠家Servicebio，貨號GB111981，稀釋比1∶400)、加二抗HRP標記山羊抗兔IgG(廠家Servicebio，貨號GB23303，稀釋比1∶200)、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片等處理，進行空腸組織MUC2、ZO-1免疫組化分析，利用統計軟件Image J對免疫組化結果進行分析，通過測量總面積、陽性區域面積與陽性區域累計光密度值，并計算出平均光密度值來衡量蛋白表達量。

1.8.3 器官切片HE染色及組織病理分析 取處死后小鼠的空腸、脾、肺、肝，按“1.8.1”步驟制作石蠟切片，隨后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡檢在200倍下挑選典型視野拍照，進一步對組織病理進行分析。

1.9 數據處理

2 結 果

2.1 小鼠狀態及體質量

飼喂MTY未對小鼠體質產生明顯影響，小鼠被毛順滑，活動正常，與空白對照相比未見肉眼可見異常。灌胃期間小鼠表現出較好的狀態，飲食、飲水、排泄均正常，并有增加小鼠體質量的趨勢，但不顯著(>0.05)。陽性藥物組相比空白組和MTY組，體質量增長較慢，其他未見異常(表1)。

表1 MTY對小鼠平均體質量變化的影響Table 1 Effect of mannatide on the changes of average body weight in g

2.2 腸道微生物

2.2.1 各組微生物OTU 微生物OTU數由圖1可知，3組中共有OTU數為413，空白組、陽性藥物組、MTY組微生物特有的OTU數分別為79、57、71。

con. 空白組；amx. 陽性藥物組；man. 酵母甘露聚糖肽組。下同Con. Blank group; amx. Positive drug group; man. Yeast mannatide group. The same as below圖1 MTY對小鼠腸道微生物OTU的影響(韋恩圖)Fig.1 Effects of MTY on intestinal microbe OTU in mice (Venn)

2.2.2 Beta多樣性 Bate多樣性分析可以評價腸道中物種復雜性方面的差異程度，距離越接近且聚集在一起的樣品，表明物種組成結構越相似，通過主坐標分析(PCoA)生成二維散點圖2顯示，MTY組與空白組和陽性藥物組之間距離較遠，說明MTY組與空白組和陽性藥物組菌群組成存在差異性。

(1)分隔土體。可采用土工膜等防滲隔水材料，或者非分散性黏土及改性分散性黏土，將低溶鹽水和分散性黏土隔離開來。

OTU水平上的主成分(PcoA)分析; PC1.主成分1; PC2. 主成分2Principal component (PCoA) analysis on OTU level; PC1. Principal component 1; PC2. Principal component 2圖2 小鼠腸道內微生物主成分分析Fig.2 Microbe PcoA analysis in intestinal tract of mice

2.2.3 Alpha多樣性分析 小鼠腸道微生物Alpha多樣性見圖3、4，Alpha多樣性可以評價樣品內的微生物群落的豐度和多樣性，ACE指數和Chao指數反映群落豐富度，香農·威納指數(Shannon)和辛普森指數(Simpson)反映菌群多樣性。

α 多樣性分析結果；數據柱形標注無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Alpha diversity estimators. Value columns with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below圖3 MTY對腸道內微生物豐度的影響Fig.3 Effect of MTY on microbial abundance in intestinal tract

圖4 MTY對腸道內微生物多樣性的影響(α 多樣性分析結果) Fig.4 Effects of MTY on intestinal microbial diversity (Alpha diversity estimators)

Alpha多樣性結果顯示，MTY組ACE指數和Chao指數均略高于空白組和陽性藥物組，其中陽性藥物組指數最低，但差異不顯著(>0.05)，說明MTY

組有增加菌群豐度的趨勢。MTY組香農(Shannon)指數均高于陽性藥物和空白組，并顯著高于陽性藥物組(<0.05)；MTY組辛普森指數(Simpson)顯著低于陽性藥物組、空白組(<0.05)。結果表明，MTY組的物種的豐度及多樣性均高于空白組與陽性藥物組，其中MTY組多樣性顯著高于空白組與陽性藥物組(<0.05)。

2.2.4 腸道菌群組成及其相對豐度 由圖5、6可知，在門水平上，各組的優勢菌群為擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicultes)，其中陽性藥物組擬桿菌門較空白組提高16.18%，厚壁菌門較空白組降低12.54%，而MTY組擬桿菌門較空白組降低10.29%，厚壁菌門提高7.48%。

圖5 門水平上的腸道菌群組成及相對豐度Fig.5 Composition and relative abundance of gut microflora on phylum level

圖6 屬水平上的腸道菌群組成及相對豐度Fig.6 Composition and relative abundance of gut microflora on genus level

在屬水平上，除未命名屬外，乳酸菌屬、另枝菌屬、臭味桿菌屬、擬桿菌屬、幽門螺旋桿菌屬、擬普雷沃菌屬豐度最高，其中，MTY組的另枝菌屬(7.41%)、臭味桿菌屬(6.71%)、擬普雷沃菌屬(3.00%)和脫硫弧菌屬(4.38%)等均較空白組、陽性藥物組的菌群豐度有所提高。

為了探討各組間菌群豐度的差異，采用kruskal-wallis軼和檢驗進行各組比較(圖7、8)。在門水平上，脫硫桿菌門、髕骨細菌門有顯著差異(<0.05)，藍細菌門有極顯著差異(<0.01)。在屬水平上，另枝菌屬、擬桿菌屬、脫硫弧菌屬等有顯著差異(<0.05)，而臭味桿菌屬、考拉桿菌屬有極顯著差異(<0.01)。

圖7 不同組間門水平上Kruskal-Wallis H檢驗條形圖Fig.7 Kruskal-Wallis H test bar plot on phylum level between different groups

圖8 不同組間屬水平上Kruskal-Wallis H檢驗條形圖Fig.8 Kruskal-Wallis H test bar plot on genus level between different groups

2.3 PEC半數致死量模型試驗

PEC半數致死模型試驗結果見表2。攻毒8 h，小鼠被毛粗糙發黃，精神不振，不愿活動，多蜷縮在一起，眼角多有白色分泌物流出，少數小鼠緊閉雙眼，多數小鼠肛門處附近沾有稀便。攻毒10 h,小鼠開始出現死亡，集中死亡出現在攻毒后24 h內，之后無死亡情況增加。通過SPSS 20.0軟件采用線性回歸方法，計算出PEC半數致死量為3.98×10CFU·mL。

表2 小鼠人工感染PEC后LD50測定結果Table 2 LD50 assay result of PEC infected mouse

2.4 PEC半數致死量攻毒試驗

本試驗將灌胃28 d后的模型組、陽性藥物組和MTY組小鼠進行PEC腹腔注射攻毒試驗，每只小鼠攻毒0.2 mL，劑量為3.98×10CFU·mL，注射后觀察24 h，之后進行解剖，取所需臟器進行后續試驗。PEC半數致死量攻毒試驗結果見表3。

由表3可見，空白組無死亡情況，模型組死亡最多(5只)，陽性藥物組死亡3只，MTY組死亡數(2只)低于模型組和陽性藥物組，表明MTY對PEC有抑制作用。而且，MTY組在灌胃期間，小鼠體態與質量均呈現健康生長狀態，說明MTY沒有毒性，食用安全。

表3 PEC半數致死量攻毒試驗結果Table 3 Result of PEC attack with LD50 dose

2.5 器官指數分析

如表4所示，被PEC感染后小鼠胸腺指數極顯著降低(<0.01)，但灌服MTY組小鼠胸腺指數顯著高于模型組(<0.05)。被PEC感染后小鼠脾由于發生腫脹，出現脾指數顯著升高(<0.05)，而灌服MTY的小鼠脾指數較模型組降低。相比于空白組，PEC極顯著的提高了小鼠的肝指數(<0.01)，而MTY組的肝指數相比模型組發生極顯著降低(<0.01)。說明酵母甘露聚糖肽對被攻毒PEC小鼠的免疫器官具有保護作用。

表4 MTY對PEC感染小鼠臟器指數的影響Table 4 Effects of MTY on organ indexes in mice infected with mg·g-1

2.6 器官切片組織病理分析

2.6.1 MTY抑制了PEC感染小鼠空腸杯狀細胞的減少 本研究使用PAS染色研究MTY對空腸中杯狀細胞的影響，結果表明(圖9)，致病性大腸桿菌能顯著減少腸腔中杯狀細胞數量(<0.05)，陽性藥物處理的小鼠杯狀細胞也明顯減少(<0.05)，而經灌胃MTY的小鼠杯狀細胞相比陽性藥物組及模型組均有較大程度地增多，但不顯著(>0.05)。因此，MTY可抑制PEC誘導的空腸杯狀細胞的減少，起到保護空腸的作用。

A. 空腸PAS染色圖片(200×)；B. 小鼠空腸中杯狀細胞的數量A. PAS staining of jejunum (200×); B. The number of goblet cells in mouse jejunum圖9 MTY對攻毒后小鼠空腸中杯狀細胞數量的影響Fig.9 Effect of MTY on goblet cells in jejunum of mice after PEC challenge

2.6.2 MTY抑制了PEC感染小鼠腸道中MUC2和ZO-1表達下調 通過免疫組化分析小鼠腸道組織中MUC2及緊密連接蛋白ZO-1的蛋白表達，PEC可顯著降低小鼠腸道中MUC2及ZO-1的表達量，如圖10A所示，MTY組空腸MUC2及ZO-1染色陽性區域(黃棕色)面積大于模型組，定量分析結果如圖10B、C顯示，MTY組空腸中MUC2及ZO-1表達量顯著高于模型組(<0.05)，說明MTY可以抑制PEC感染后小鼠腸道中的MUC2和ZO-1表達下調。

A. 空腸中MUC2和ZO-1表達量免疫組化染色圖(200×)；B. Image J對MUC2表達量半定量分析；C. Image J對ZO-1表達量半定量分析A. Immunohistochemical staining of MUC2 and ZO-1 expression levels in jejunum (200×); B. Image J semi-quantitative analysis of MUC2 expression; C. Image J semi-quantitative analysis of ZO-1 expression圖10 MTY對攻毒后小鼠腸道中MUC2和ZO-1表達量的影響Fig.10 Effects of MTY on the expression of MUC2 and ZO-1 in intestinal tract of mice after PEC challenge

2.6.3 MTY對PEC感染后小鼠器官的保護作用 MTY對攻毒后小鼠各器官的影響結果見圖11。

A. 空腸HE染色；B. 脾HE染色；C. 肺HE染色；D. 肝HE染色；a. 腸絨毛斷裂；b. 腸絨毛排列混亂；c. 脾小動脈玻璃樣變；d. 炎性壞死灶；e. 炎性細胞浸潤，肺泡腔內充滿紅細胞；f. 肺泡壁增厚，肺泡腔內充滿紅細胞；g. 炎性細胞浸潤；h. 部分肝組織壞死A. HE staining of jejunum; B. HE staining of spleen; C. HE staining of lung; D. HE staining of liver; a. Broken intestinal villi; b. Disordered intestinal villi; c. Hyaline lesion of splenic arteriole; d. Inflammatory necrotic lesion; e. Inflammatory cell infiltration, alveolar cavity filled with red blood cells; f. Alveolar wall thickening, alveolar cavity filled with red blood cells; g. Inflammatory cell infiltration; h. Partial liver tissue necrosis圖11 MTY對攻毒后小鼠各器官的影響(200×)Fig.11 Effects of MTY on various organs of mice after PEC challenge (200×)

由圖11A可見，MTY降低了PEC攻毒對小鼠小腸的影響，抑制了小腸絨毛斷裂及隱窩萎縮。PEC感染后空腸內絨毛出現斷裂，排列混亂；使用抗生素灌胃，經PEC感染后，小腸絨毛排列混亂，幾乎不可見隱窩；而灌胃MTY后的小腸絨毛排列整齊，隱窩正常。

脾切片見圖11B，可見空白組未見明顯異常；模型組出現脾小動脈玻璃樣變，脾小節淋巴細胞壞死，紅白髓界限不清，紅髓內中性粒細胞增多；陽性對照組有大小不一的炎性壞死灶，出現輕微脾小節淋巴細胞壞死；MTY灌胃組輕微脾小動脈玻璃樣變，其他未見明顯異常。

從肺組織切片圖11C，可以觀察到空白組未見明顯異常，模型組出現肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤，肺泡腔充滿紅細胞；陽性對照組出現嚴重的肺泡壁增厚，肺泡壁毛細血管擴張，肺泡腔內充滿紅細胞，炎性細胞浸潤；MTY組肺部未出現異常。

肝病理切片11D顯示，空白組中央靜脈周邊肝細胞增厚，未有明顯炎性浸潤區和肝組織壞死部位；模型組肝組織部分有炎性細胞浸潤，少數細胞胞質內有空泡；陽性對照組肝組織部分壞死，肝索基本消失；MTY組顯示組織未見明顯異常，肝索結構比較明顯。

3 討 論

甘露聚糖肽在消化道中消化酶的作用下被分解為低聚甘露糖和堿性多肽，而甘露聚糖通過相應酶催化被降解成甘露寡糖，進而經過產生的生物活性物質而發揮作用。甘露聚糖肽具有特殊的抗菌效果，可以與腸道病原菌發生凝集現象從而抑制微生物在腸道內的定植，并進一步抑制其生長，為有益菌提供營養促進有益菌的增殖。在對腸道微生物分析中，有研究表明，相同物種豐度的情況下，Simpson指數越低，Shannon指數越高，說明樣品的物種多樣性越高。本研究發現，酵母甘露聚糖肽組較空白組菌群組成有明顯差異，多樣性有顯著性提高，菌群豐度有較大提高，其中，酵母甘露聚糖肽組中厚壁菌門較空白組有顯著提高，而厚壁菌門中許多成員都是有益菌，如乳酸桿菌、瘤胃球菌等，這些有益菌的增多，在一定程度上競爭性抑制了有害菌的生長增殖。甘露聚糖肽可調節動物體的免疫機能，提高抵抗力，能最大程度地減少各類疾病和細菌病毒對動物產生的傷害。本研究對小鼠進行攻毒試驗，灌胃酵母甘露聚糖肽的小鼠死亡率呈現下降趨勢，表明酵母甘露聚糖肽對致病性大腸桿菌(PEC)有抑制作用。通過肝、脾、肺切片HE染色結果分析可見，酵母甘露聚糖肽可以改善炎癥反應，使各器官保持在健康狀態的作用。腸道是機體重要消化、吸收營養物質的器官，而腸絨毛和隱窩是小腸的重要組成部分。有研究表明，滸苔多糖可以保護腸絨毛及隱窩，改善空腸形態，促進腸道消化吸收功能。本研究中，PEC感染后破壞小腸絨毛及隱窩，而MTY可減輕PEC對小腸絨毛和隱窩的損壞，保護腸道健康。腸杯狀細胞合成分泌黏蛋白，二者共同作用形成覆蓋腸上皮表面的黏液層，并維持了腸上皮屏障的完整性。此外，Masuda等、Ikeda等發現杯狀細胞還參與腸道損傷后的修復過程。有研究表明香菇多糖可以增加杯狀細胞數量及腸道緊密連接蛋白的含量，提高腸屏障免疫力。PEC可破壞小腸中黏液層，本研究結果表明，MTY提高了注射PEC后黏蛋白MUC2的表達量及杯狀細胞數量，因而在一定程度上保護腸道健康。ZO-1是腸上皮細胞中重要的緊密連接蛋白，PEC可破壞腸道緊密連接結構，改變ZO-1的分布；酵母甘露聚糖肽提高了被PEC感染后ZO-1的表達量，保護腸道緊密連接功能，進一步保護腸屏障功能。

抗生素的應用極大的提升了防疫水平，但是，抗生素在殺滅有害菌的同時也損害了一部分有益菌，在被致病性菌感染后，反而會加劇致病菌對機體的傷害，還導致一些耐藥菌株的產生。尋找一種天然無公害的抗生素替代產品成為目前人們需要亟待解決問題。本研究結果表明，酵母甘露聚糖肽沒有毒性，食用安全，具有代替抗生素的潛質，作為一種新型的飼料添加劑市場前景十分廣闊。

4 結 論

酵母甘露聚糖肽可提高腸道菌群多樣性及增加益生菌的數量，可抑制致病性大腸桿菌攻毒后小鼠腸道黏膜蛋白表達下調和杯狀細胞減少，對腸道、肝、脾和肺等器官均具有顯著的保護作用，從而提高了小鼠的生存率。