ETT2結構基因epaPQR對禽致病性大腸桿菌生物學特性及致病性的影響

邵 穎，傅丹丹，吳曉妍，谷 一，宋祥軍，涂 健，祁克宗

(安徽農業大學 獸醫病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室，合肥 230036)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic, APEC)屬于腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenic, ExPEC)，引起家禽持續感染并引發多系統疾病，常經呼吸道定殖感染，引起家禽的氣囊炎、腹膜炎、輸卵管炎、蜂窩織炎以及敗血癥等，嚴重影響養禽業的養殖成本和產品質量。研究發現，APEC與人源ExPEC具有很高的同源性，表明APEC具有潛在的人獸共患病風險。因此，加強對禽致病性大腸桿菌的致病研究，對養殖業和公共衛生安全都具有重大意義。

大腸桿菌Ⅲ型分泌系統2(Type Ⅲ secretion systems 2, ETT2) 又稱ETT2毒力島，與沙門菌Ⅲ型分泌系統SPI-1毒力島同源，其作為T3SS的主要毒力基因簇，參與多種毒力因子的調控。研究表明，尿道致病性大腸桿菌(uropathogenic，UPEC)中完整的ETT2毒力島缺失會顯著降低細菌運動能力，降低鞭毛蛋白、菌毛和表面蛋白、外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMV)的分泌，并影響細菌耐藥性以及改變細胞行為。ETT2 ATPase基因的缺失導致APEC運動能力降低，細菌鞭毛受損，表面菌毛增加等。ETT2轉錄調節因子YqeI及EivF調控APEC運動性、生物被膜形成的能力以及細菌毒力。由此可見，ETT2毒力島在禽致病性大腸桿菌的生物學特性及致病性中發揮著重要作用。

ETT2基因簇由、、、、基因組成(圖1)，這5個基因被認為是ETT2注射裝置假定的結構基因的重要組成部分，與沙門菌SPI-1注射裝置的基因簇的基底裝置內環的5個組成基因、、、、具有高度同源性。在腸出血性大腸桿菌O157: H7中，與沙門菌SPI-1中功能相似的基因的缺失會阻斷效應蛋白NleB1和NleB2易位到宿主細胞中，該基因簇在細菌分泌蛋白的過程中發揮一定的作用并影響細菌致病性。而ETT2基因簇在大腸桿菌生物學特性及致病性中的作用目前尚不清楚。

圖1 大腸桿菌毒力島ETT2模式圖Fig.1 Physical map of the ETT2 element of Escherichia coli

本研究通過CRISPR-Cas9基因編輯技術，構建ETT2基底裝置基因的缺失株和回復株，對其生長性能、運動性、生物被膜形成等生物學特性及致病作用進行評價，探究其對APEC生物學特性及致病性的影響，為進一步了解APEC的致病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與引物設計

禽致病性大腸桿菌AE81菌株及質粒pCas(卡那霉素抗性)、pTarget(大觀霉素抗性)由獸醫病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。PrimeScriptRT Master Mix (Perfect Real Time) 購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，PowerUpSYBRGreen Master Mix購自Thermo公司。

利用Primer 5軟件設計、、三個基因共同缺失的的檢測引物以及 CRISPR-Cas9 基因編輯技術構建基因缺失株和回復株所需要的引物。相關引物序列見表1。

表1 epaPQR基因缺失的引物序列Table 1 Primer sequence for epaPQR gene knocking out

1.2 epa基因在AE81和腸出血性大腸桿菌O157： H7中序列比對及功能預測

通過NCBI將AE81中基因簇所包含的5個基因(、、、、)序列與腸出血性大腸桿菌O157： H7(GenBank: NC_002695.2)中基因簇進行同源性分析。利用生物學軟件Phyre2進行蛋白質功能預測，篩選置信度較高的疑似結構基因(Phyre2: http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.3 基因缺失株AE81ΔepaPQR的構建

利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，以pTarget質粒為模板，sgRNA-F/R為引物擴增sgRNA片段。以AE81基因組為模板，-up-F/R和-down-F/R為引物分別擴增的上、下游序列片段。將以上3個片段為模板，以sgRNA-F/-down-R為引物，PCR連接成sgRNA特異性的結合靶標序列，引導Cas9蛋白對特異DNA序列切割使DNA雙鏈斷裂，利用非同源末端鏈接(non-homologous end joining，NHEJ)修復機制，隨機缺失或插入堿基造成移碼突變，以實現目的基因的敲除。將此連接產物與pTarget質粒同時進行雙酶切，鑒定正確后進行膠回收，對回收產物進行連接，將連接產物轉化入DH5α中培養，驗證重組質粒pTarget-是否構建成功。

將重組質粒電轉入含有pCas質粒的AE81感受態細胞中，涂布至含有卡那霉素抗性的LB培養基上，28 ℃培養24 h。將驗證正確的陽性菌株培養至OD為0.2，按照1∶150比例加入IPTG，37 ℃過夜培養，次日劃菌至無抗固體培養基中，42 ℃培養，以消除抗性，用引物pCas-F/R和pTarget-F/R進行PCR驗證。

1.4 基因回復株C-AE81ΔepaPQR的構建

以AE81基因組為模板，-RI-F/-HI-R為引物，擴增含有酶切位點的基因片段，將片段和pSTV28質粒進行酶切并利用T4 DNA連接酶進行連接，化轉至DH5α中，構建重組質粒pSTV28-，PCR篩選陽性克隆并測序。將pSTV28-質粒電轉入AE81Δ感受態細胞中37 ℃培養。用M13通用引物進行PCR驗證并測序。

1.5 生長曲線的測定

挑取3株細菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ的單克隆接種至液體LB培養基中，37 ℃、180 r·min過夜培養，次日接種至新的液體LB培養基中，培養到OD為1.0，然后1∶200轉移至新鮮LB肉湯中，每隔1 h用酶標儀測量 OD，直到細菌生長到穩定期。

1.6 運動能力的檢測

挑取3株細菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ單克隆培養至OD為1.0，用滅菌PBS溶液洗滌2次，調整OD為2.0。然后滴加2 μL菌液點到瓊脂粉含量2.5 g·L的LB半固體培養基中央，37 ℃靜置培養8 h后觀察結果，根據運動圈的大小，比較菌株運動能力的差異。

1.7透射電鏡觀察鞭毛形態

將野生株AE81以及AE81Δ和C-AE81Δ在LB中于37 ℃靜置培養12 h，用PBS洗滌3次后，將細菌置于200目銅鏡下，在室溫下短暫孵育。然后將細菌用2%醋酸鈾酰水溶液染色30 s，待樣品干燥后，用透射電子顯微鏡(日立HT-7700，日本)觀察3株細菌鞭毛的形態。

1.8 生物膜形成能力的檢測

挑取3株細菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ培養至OD為1.0，用新LB培養基重懸洗滌兩次，并調整OD為1.0，用LB培養基將菌液稀釋50倍，添加到96孔板中，每組重復3次，LB培養基作為陰性對照，分別在25 ℃和37 ℃靜置培養48 h。用PBS洗滌并干燥兩次，再用0.1%結晶紫染色約20 min，用PBS洗滌并干燥兩次。將生物膜溶解在95%酒精中，通過酶標儀測定OD吸光值，比較3株細菌生物被膜形成能力差異。

1.9 抗血清殺菌能力的檢測

挑取3株細菌AE81、AE81Δ和C-AE81Δ培養到OD為1.0，用無菌PBS洗滌2次，調整細菌數為1×10CFU·mL。用PBS將SPF雞血清稀釋至5%、12.5%、25%、50%和100%，將56 ℃水浴30 min的滅活血清做陰性對照。不同梯度的血清與細菌混勻后，37 ℃靜置培養30 min，梯度稀釋，掛板計數法進行細菌計數。

1.10 組織載菌量測定

將野生株AE81和缺失株AE81Δ培養到OD為1.0，用無菌PBS洗滌3次并重懸菌體。每組細菌感染3只羅曼蛋雞，每只攻毒劑量1×10CFU·mL。感染24 h后無菌條件下分別取心、肝、肺和脾組織，等比例加入無菌PBS，組織研磨儀研磨并倍比稀釋，用平板計數法進行細菌計數。

1.11 熒光定量檢測鞭毛相關基因的表達

為探究基因對鞭毛的作用，選擇鞭毛結構基因(、、、)和輸出蛋白基因()及一級調控操縱子(、)進行qRT-PCR檢測。將野生株AE81與缺失株AE81Δ培養至對數期，利用TRIzol法提取細菌RNA，利用反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。參照PowerUpSYBRGreen Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR檢測，每個樣本重復3次。鞭毛基因熒光引物見表2，以16為內參基因。

表2 鞭毛基因熒光引物Table 2 The primers of flagellar genes

2 結 果

2.1 epaPQR基因的功能預測

通過Phyre2預測基因簇蛋白的結構與功能(圖2A、2B和2C)，結果顯示，基因簇5個基因中的、和的結構域分別以92%、99%和93%的置信度在其全結構范圍內與大腸桿菌鞭毛三型分泌系統核心輸出裝置的結構域相一致。故選定此3個基因作為整體來探究其功能。

圖2 epaP(A)、epaQ(B)和epaR(C)蛋白質功能預測結果及三級結構Fig.2 Prediction results and tertiary structure of epaP (A), epaQ (B) and epaR (C) proteins

2.2 基因缺失株AE81ΔepaPQR及其回復株C-AE81ΔepaPQR的構建與鑒定

通過CRISPR-Cas9基因編輯技術構建重組質粒pTarget，以-in-F/R為引物，PCR驗證結果顯示，重組質粒擴增片段大小為2 101 bp，pTarget原始質粒大小為800 bp(圖3A)，條帶大小相差1 391 bp，表明重組質粒構建成功。

A. 重組質粒驗證，M. Marker；1. 重組pTarget質粒，引物pTarget-F/R；2. pTarget質粒，引物pTarget-F/R; 3. 陰性對照。B. 缺失驗證，M. Marker；1. AE81菌株，引物epaPQR-in-F/R；2. AE81ΔepaPQR菌株，引物epaPQR-in-F/R；3. 陰性對照；4. AE81菌株，引物epaPQR-out-F/R；5. AE81ΔepaPQR菌株，引物epaPQR-out-F/R；6. 陰性對照A. Verification of recombinant, M. marker; 1. Recombinant pTarget plasmid, primer pTarget-F/R; 2. pTarget plasmid, primer pTarget-F/R; 3. Negative control. B. Verification of deletion, M. marker; 1. AE81 strain, primer epaPQR-in-F/R; 2. AE81ΔepaPQR strain, primer epaPQR-in-F/R; 3. Negative control; 4. AE81 strain, primer epaPQR-out-F/R; 5. AE81ΔepaPQR strain, primer epaPQR-out-F/R; 6. Negative control圖3 pTarget重組質粒驗證(A)及缺失驗證(B)Fig.3 Verification of pTarget recombinant plasmid (A) and deletion (B)

通過內、外側引物驗證基因缺失株(圖3B)。PCR檢測結果顯示，通過內側引物-in-F/R驗證，野生株AE81大小為261 bp，缺失株和陰性都無條帶(孔道1～3)；通過外側引物-out-F/R驗證基因缺失株，AE81野生株大小為2 791 bp，缺失株大小為1 400 bp(孔道4～6)，缺失株相較于野生株減少了1 391 bp，證明基因缺失成功，缺失株命名為AE81Δ。

通過pSTV28質粒在AE81Δ中構建出回復株，用引物M13-F/R進行PCR驗證，結果顯示，AE81Δ缺失株無條帶，而回復株出現1 391 bp條帶(圖4)，證明回復株構建成功，回復株命名為C-AE81Δ。

M. Marker；1. AE81ΔepaPQR菌株，引物M13-F/R；2. C -AE81ΔepaPQR菌株，引物M13-F/RM. Marker; 1. AE81ΔepaPQR strain, primer M13-F/R; 2. C-AE81ΔepaPQR strain, primer M13-F/R圖4 回復株的驗證Fig.4 Validation of complement strain

2.3 生長曲線的測定

AE81、AE81Δ和C-AE81Δ3株菌在17 h內的生長趨勢相同(>0.05，圖5)，說明基因的缺失不影響其生長特性。

圖5 生長曲線測定Fig.5 Growth curves determination

2.4 生物膜形成能力的測定

生物膜形成能力的結果表明，與野生株AE81相比，缺失株AE81Δ和回復株C-AE81Δ的生物膜形成能力的差異不顯著(>0.05，圖6)。

A.結晶紫染色法測定APEC生物被膜的形成；B. 酶標儀測定的生物被膜形成的吸光值。ns. 差異不顯著(P>0.05)A. Crystal violet staining method was used to determine the formation of APEC biofilm; B. The absorbance value of biofilm formation was determined by enzyme reader. ns. No significant difference (P>0.05)圖6 生物被膜形成能力檢測Fig.6 Biofilm formation ability test

2.5 運動能力的測定

對3株菌的運動能力(圖7)檢測結果表明，野生株AE81、缺失株AE81Δ和回復株C-AE81Δ的運動圈直徑平均值分別為65.40、32.75、54.21 mm，在37 ℃下，缺失株AE81Δ的運動圈相較于野生株AE81顯著減小；回復株C-AE81Δ的運動圈明顯回復。因此基因的缺失會降低AE81的運動能力。

圖7 運動能力的比較Fig.7 Comparison of motility ability

2.6 透射電鏡觀察鞭毛形態

通過透射電鏡觀察3株菌的鞭毛形態(圖8)。結果表明，野生株AE81有數根長而彎曲的鞭毛；相較于野生株AE81，缺失株AE81Δ鞭毛的數量明顯減少；回復株C-AE81Δ鞭毛數量相較于缺失株明顯增加，且與野生株AE81鞭毛形態相似。透射電鏡對鞭毛形態的觀察與“2.5”中運動能力的測定結果趨勢一致，進一步證明基因影響AE81的運動能力。

圖8 透射電子顯微鏡下的鞭毛形態Fig.8 Flagella under the transmission electron microscope

2.7 熒光定量PCR檢測鞭毛相關基因的表達

通過熒光定量PCR驗證鞭毛相關基因的表達。結果顯示，與野生株AE81相比，缺失基因后，缺失株中鞭毛一級調控操縱子和的表達水平顯著下調(<0.05)；鞭毛T3SS的結構基因、、、的表達水平的顯著下調(<0.05)，的表達水平下調但差異不顯著(>0.05)；鞭毛輸出蛋白基因的轉錄水平顯著下調(<0.05)。回復株C-AE81Δ的基因表達水平基本恢復(圖9)。表明基因通過影響鞭毛基因的表達，進而影響細菌的運動性。

*. P<0.05，下同*. P<0.05, the same as below圖9 鞭毛相關基因熒光定量Fig.9 Fluorescence quantification of flagellum-related gene

2.8 抗血清殺菌能力的檢測

在不同濃度血清中3株菌的存活能力檢測結果表明(圖10)，3株菌在PBS和滅活血清中的存活能力無差異(>0.05)， 缺失株AE81Δ在不同濃度的血清中存活能力相較于野生株都顯著增強(<0.05)，且在5%、12.5%、25%濃度中存活能力極顯著高于其余2菌株(<0.01)，說明基因缺失后其抗血清殺菌能力顯著增強(<0.05)。

***. P<0.001；**. P<0.01。下同***. P<0.001; **. P<0.01. The same as below圖10 抗血清殺菌數據圖Fig.10 Antiserum bactericidal data graph

2.9 體內分布的檢測

通過體內分布試驗檢測野生株和缺失株菌在雛雞體內心、肝、脾和肺4個器官的定殖情況(圖11)。結果表明，與野生株AE81相比，基因的缺失造成AE81在雛雞心、肝、脾和肺器官的定殖數量顯著減少，尤其在脾中定殖量較少。脾作為免疫器官，會影響細菌在機體內存活能力。

圖11 野生株AE81和缺失株AE81ΔepaPQR感染雛雞的組織載菌量Fig.11 Tissue bacteria load after infected with AE81 and AE81ΔepaPQR strains

3 討 論

ETT2作為T3SS的主要毒力基因簇，編碼包括(3721-3726)、(3727-3734)、(3707-3712)等至少35個開放閱讀框，參與多種毒力因子的調控。研究發現，ETT2毒力島編碼的蛋白影響大腸桿菌毒素和黏附素的分泌或運輸；在產志賀毒素大腸桿菌中許多毒力基因的表達和分泌受到ETT2毒力島的影響。在腸出血性大腸桿菌中，ETT2毒力島缺失后導致細菌鞭毛蛋白和菌毛蛋白的分泌減少。可見ETT2對于細菌生物特性及毒力具有重要作用。

生物被膜是一種由胞外多糖、分泌蛋白和DNA組成的表面相關微生物的異質聚集體，可幫助細菌增強自身抵抗力以及抵抗外部環境壓力。在本研究中，基因的缺失顯著降低其運動能力，對其生物被膜形成能力無顯著改變。有研究顯示，運動性對生物膜的形成并非必不可少，且細菌的運動性不總是促進生物膜形成。ETT2分子伴侶基因缺失后導致其運動性顯著增加，生物被膜形成能力顯著下降。因此，運動能力在生物被膜形成過程中起著非常重要的作用，但也受到環二核苷酸和某些代謝調控蛋白等其他因素的影響。

鞭毛是細菌重要的毒力因子，在細菌感染過程中發揮多種作用。細菌可通過旋轉鞭毛來運動，使它們能夠克服表面環境中的靜電斥力和液體阻力，從而增加它們與細胞表面相互作用的機會，可促進細菌穿過小腸黏膜黏附于宿主細胞或者非生物表面，并且可以維持和擴散感染。研究表明，UPEC缺失2基因后，導致鞭毛蛋白的分泌顯著減少，血清存活能力增強，運動性減弱。ETT2基因簇中的缺失導致APEC運動能力減弱，且鞭毛和運動相關基因,的表達水平顯著下調。在本研究中，透射電鏡中觀察到缺失株鞭毛數量顯著減少，可能通過影響鞭毛數量從而調控細菌運動性；qRT-PCR數據顯示，缺失基因后，鞭毛一級調控操縱子和、結構基因、、、和鞭毛輸出蛋白的轉錄水平顯著下調。其中鞭毛蛋白是鞭毛的主要成分，其表達由鞭毛一級調控子FlhD激活。

APEC主要通過呼吸道感染禽類，然后擴散到全身，導致家禽的菌血癥和死亡。研究表明，在789中ETT2的缺失導致細菌在1日齡雞中的毒力顯著減弱；ETT2 ATPase的缺失在鴨體內毒力和存活率減弱。本研究發現，的缺失會降低APEC在雞體內的定殖，減弱對APEC的致病作用。但在抗血清能力試驗中，的缺失造成AE81在血清中的存活能力增強。在APEC中，缺失ETT2轉錄因子基因，增強了細菌在血清中的存活。缺失轉錄因子減弱APEC在血清中存活能力。ETT2基因簇的缺失增加了UPEC對血清的敏感性。細菌的許多特性都有助于其血清抗性，包括囊泡、OmpA和LPS等，但基因是否通過影響這些因素而導致其缺失株血清抗性增強還尚不清楚，還需要進一步深入研究。

4 結 論

ETT2結構基因參與調控APEC的鞭毛形成及其相關基因的轉錄水平，影響APEC抗血清殺菌能力以及在雛雞體內不同器官的定殖能力，表明在APEC致病過程中發揮重要作用，為深入探究ETT2功能和APEC致病機制提供參考。