PK-15細胞的ISG15基因敲除促進PRV的復制

李 琛，何文峰，趙麗娜，凡 啟，楊國慶，劉慧敏

(河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多種家畜和哺乳動物的急性傳染病，以發熱、奇癢(豬除外)及急性腦脊髓炎為主要癥狀。PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科。豬是PRV的唯一自然感染宿主以及長期貯存和傳播宿主。PRV感染豬后可建立持續性感染，主要潛伏在豬的外周神經組織，在機體免疫低下或受到應激時可被激活，導致機體發病甚至成為傳染源。PRV特殊的致病方式和感染方式給該病的防控帶來較大困難，嚴重危害全球養豬業的發展。近年來，PRV更是突破了常規疫苗，導致豬偽狂犬病的防控難度極大，成為養豬業防控偽狂犬病所面臨的巨大挑戰。

在病毒入侵機體過程中，宿主產生各種防御機制來保護機體，先天性免疫應答是抵抗入侵病原體的第一道防線。PRV對宿主細胞的感染力很強，能夠引起宿主細胞產生免疫反應，誘導產生Ⅰ型IFN，分泌的IFN與其受體結合激活下游信號轉導，最終導致數百個干擾素刺激基因(ISGs)的表達。其中，ISG15(interferon-stimulated gene15)作為誘導最強烈、反應最快的ISG蛋白之一，在宿主抵御病毒感染的過程中發揮重要的作用。

近年來，對ISG15抗病毒復制的作用有越來越多的研究。ISG15可以通過作用于病毒入侵的各階段影響病毒的增殖，也可以作為免疫調節蛋白來調控宿主的反應。本實驗室前期研究發現PRV感染能顯著上調ISG15，過表達ISG15能明顯抑制PRV復制。但是ISG15抑制PRV復制的分子機制尚不清楚，有待進一步研究。在前期試驗基礎上，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建15基因敲除PK-15細胞系(PK15-ISG15)，利用PRV毒株檢測敲除15基因對PRV復制的影響，以期為進一步研究ISG15抑制PRV 復制的分子機制提供新思路，同時為有效防控豬偽狂犬病提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬腎上皮細胞(PK-15)、PRV、ISG15兔多克隆抗體由作者實驗室保存；pCompass-LVKO 載體購自Addgene；載體質粒pMD2.G和psPAX2購自Sigma；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶Ⅰ、RNAiso Plus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、Primer STARMax DNA Polymerase購自寶日醫生物技術有限公司；MonAmpSYBRGreen qPCR Mix試劑購自莫納生物科技有限公司；PRV鼠源gE單克隆抗體購自普萊柯生物工程股份有限公司；β-actin抗體購自賽維爾生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8購自生工生物工程股份有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據NCBI網站所公布的豬15基因序列(GenBank No.：NM_001128469)，在15的單一外顯子上找到2個合適的靶位點，將此靶序列與豬的基因組序列進行比對，僅在15基因座上找到完全匹配序列，針對2個位點分別設計sgRNA上游引物與下游引物，同時，在基因組靶序列兩側設計15的驗證引物(表1)；通過NCBI數據庫查詢需要檢測的基因 mRNA序列，應用Primer-Blast設計RT-qPCR引物(表1)。

表1 引物序列及相關信息Table 1 Sequences and information of primers used in our study

1.3 ISG15基因敲除細胞系的構建

1.3.1 敲除載體的構建 將兩對sgRNA引物95 ℃ 5 min進行退火雜交，退火后連接至Ⅰ限制性內切酶線性化的pCompass-LVKO載體中。重組載體送北京擎科生物科技有限公司測序，將測序正確質粒命名為pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，挑取單菌落擴大培養，提取質粒后，-20 ℃保存備用。

1.3.2 敲除細胞系的構建 將pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2與psPAX2、pMD2G以2∶1∶1的比例，共轉染HEK293T細胞；培養48 h后收集包裝病毒上清液，取1 mL感染PK-15細胞，感染48 h后，用2 μg·mL嘌呤霉素篩選細胞，使用胰酶消化存活細胞，梯度稀釋后，按照每孔1個細胞的比例接種至96孔板，37 ℃，5% CO培養擴增細胞。取15完全敲除的克隆，抽提基因組DNA后以此為模板，使用驗證引物ISG15 VerF和ISG15 VerR進行PCR擴增，20 μL反應體系：PrimerSTAR Max Premix 10 μL,上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，模板1 μL，ddHO 8.2 μL。反應條件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，共35個循環；72 ℃ 5 min。如果在619 bp處出現一條特異性條帶，可初步說明敲除15細胞構建成功，將此條帶連接至pEASY-T1 simple載體，隨機挑選陽性克隆送公司測序。

1.4 ISG15敲除效率的驗證

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細胞，各設3組重復。培養至細胞匯合度70%左右接種病毒，以PRV MOI=2感染細胞，感染24 h收取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取35 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入ISG15兔多克隆抗體(1∶5 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h，ECL顯影。以β-actin作為內參。

1.5 細胞增殖(CCK-8)檢測

以每孔1×10個細胞在96孔板中鋪種PK-15和PK15-ISG15細胞，每個處理設置5個復孔，培養24 h。參照CCK-8試劑盒在不同時間點向指定培養孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，隨后用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。試驗重復3次。

1.6 間接免疫熒光檢測

12孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細胞，各3個重復，培養至細胞匯合度70%左右進行病毒處理，以PRV MOI=2感染細胞，24 h后取出，PBS洗滌兩次，然后使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，使用破膜液滲透15 min。然后用封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉的PBS)封閉細胞1 h后，加入鼠源PRV-gE抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，室溫避光孵育FITC標記的山羊抗小鼠抗體(1∶200)，PBS清洗3遍。滴入封片劑平鋪覆蓋細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細胞，各3組重復。培養至細胞匯合度70%左右進行病毒處理，以PRV MOI=2感染細胞，分別在0、6、12、24、36和48 h收取RNA。TRizol法提取RNA并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行RT-qPCR檢測。每個樣品3個重復。反應體系20 μL：MonAmpSYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，cDNA 3 μL，ddHO 6.2 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環。以-mRNA表達水平為內參值，計算PRV-0、PRV-、PRV-16、-β mRNA水平。

1.8 Western blot檢測PRV-gE蛋白的表達

6孔板鋪種PK-15和PK15-ISG15細胞，各3組重復。培養至細胞匯合度70%左右進行病毒處理，以PRV MOI=2感染細胞，感染0、6、12、24、36和48 h收取蛋白，BCA法測蛋白濃度。取35 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入ISG15兔多克隆抗體(1∶5 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，室溫孵育HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h后ECL顯影。以β-actin作為內參。Image J軟件分析條帶灰度值比較ISG15敲除對PRV-gE蛋白表達的影響。

1.9 PRV子代病毒滴定測定

取對數生長期PK-15和PK15-ISG15細胞接種于6孔板。培養至細胞匯合度70%左右，棄去細胞培養物，PBS洗2遍，將稀釋好的PRV病毒液400 μL接種到各孔中，置于37 ℃、5% CO培養箱1 h，期間每隔15 min搖晃一次，以便病毒吸附；棄去病毒液，加入含1%瓊脂糖細胞維持液覆蓋各孔，置于37 ℃、5% CO培養箱培養3 d，取出細胞培養板，10%福爾馬林固定30 min，棄去細胞覆蓋物，PBS洗2遍，用0.5%結晶紫染色30 min，選擇合適的稀釋度進行計數。

1.10 ISG15與PRV共孵育試驗

取對數生長期PK-15細胞稀釋接種于6孔板。培養至細胞融合度70%左右，進行分組處理：第1組直接用PRV(MOI=2)感染細胞；第2組將PRV與BSA于37 ℃孵育1 h后加入細胞；第3組將PRV與ISG15蛋白孵育1 h后加入細胞。吸附1 h后，更換成2%維持培養基，24 h后收取細胞總RNA、總蛋白和上清。分別檢測PRV-gE的mRNA和蛋白表達，以及子代病毒的增殖。

1.11 統計學分析

各試驗均平行重復3次，通過GraphPad Prism 8.0軟件中-test檢驗方法對數據結果進行統計學分析。

2 結 果

2.1 Cas9/sgRNA載體的構建

為構建15基因敲除PK-15細胞系，針對豬源15的第二外顯子，設計了兩個特異性的CRISPR-Cas9 sgRNA。利用Ⅰ末端序列將sgRNA克隆到pCompass-LVKO載體上，挑取單個菌落進行DNA測序，測序結果表明，重組質粒pCompass-LVKO-sgRNA構建成功(圖1)，提取質粒用于后續試驗。

框內序列分別為sgRNA1和sgRNA2序列The sequences in box are sgRNA1 and sgRNA2 sequence respectively圖1 pISG15-sgRNA測序結果Fig.1 Sequencing results of pISG15-sgRNA

2.2 PK-15敲除ISG15基因單克隆細胞系的構建

將構建成功的質粒pCompass-LVKO-sgRNA轉染PK-15細胞，并以pCompass-LVKO空載體作為陰性對照。轉染24 h后進行嘌呤霉素篩選，通過有限稀釋法挑選單克隆。單克隆擴大培養后提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA模板對15進行PCR擴增。結果顯示,在619 bp處有出現一條特異性條帶，初步說明該敲除細胞構建成功 (圖2A)。將陽性克隆進行測序鑒定，與對照細胞的序列對比分析結果顯示，sgRNA1細胞株的15基因外顯子打靶區缺失20 bp堿基，sgRNA2細胞株的15基因外顯子打靶區缺失8 bp堿基，選取sgRNA2 細胞株進行后續功能評價，并命名為PK15-ISG15。

A. PCR擴增(M.DL5000 DNA相對分子質量標準；1～3. 陽性克隆細胞PCR結果；4. PK-15細胞為陰性對照)；B. PK15-ISG15-/-單克隆細胞測序結果A. PCR amplification (M. DL5000 DNA marker; 1-3. The ISG15 PCR results of cell colonies; 4. PK-15 cell as a negative control); B. Sequencing results of PK15-ISG15-/- monoclonal cell圖2 PK15-ISG15-/-單克隆細胞的篩選Fig.2 Screen of PK15-ISG15-/-monoclonal cell line

2.3 ISG15基因敲除效率的鑒定及對細胞增殖的影響

為驗證15敲除效率，Western blot檢測PK-15和PK15-ISG15細胞中ISG15蛋白的表達水平。結果表明，在PK-15細胞中可見明顯的ISG15條帶，而PK15-ISG15細胞中沒有檢測到ISG15的表達，證實PK-15細胞中15基因完全敲除(圖3A)。

A. Western blot檢測ISG15敲除效率(1.PK-15細胞；2.PK15-ISG15-/- sgRNA1；3.PK15-ISG15-/- sgRNA2)；B. 敲除ISG15基因對細胞增殖無影響。ns.差異不顯著A. ISG15 knockout efficiency by Western blot(1. PK-15 cell; 2. PK15-ISG15-/- sgRNA1 polyclonal cell; 3. PK15-ISG15-/- sgRNA2 polyclonal cell); B. ISG15 gene knockout can induce the replication of PK-15. ns. No significant difference圖3 ISG15基因敲除細胞系的鑒定Fig.3 Identification of PK-15 cell line knockout of ISG15 gene

通過CCK-8檢測敲除15基因后是否影響細胞增殖活性。結果顯示，敲除15基因后PK15-ISG15細胞與PK-15細胞相比，OD波長吸光度值差異不顯著(>0.05)，結果表明，15基因敲除對PK15細胞的增殖沒有顯著影響(圖3B)。

2.4 敲除ISG15基因對PRV病毒復制的影響

為了研究ISG15對PRV復制的影響，作者評估了PRV在PK-15和PK15-ISG15細胞中的復制狀態。用MOI=2的PRV分別感染PK15細胞和PK15-ISG15細胞，通過間接免疫熒光檢測PRV蛋白的表達，發現在感染后的不同時間點，PRV在PK15-ISG15細胞中的表達顯著高于PK-15細胞中的表達(圖4)。該結果初步表明，敲除15顯著促進PRV復制。

熒光顯微鏡觀察PRV感染PK-15及PK15-ISG15-/-細胞對病毒復制的影響(80×)Effect of PRV infecting PK-15 and PK15-ISG15-/- cells on viral replication observed by fluorescence microscopy(80×)圖4 敲除ISG15基因促進PRV復制Fig.4 Knockout of ISG15 gene promotes PRV replication

2.5 ISG15基因敲除對PRV不同基因及IFN-β轉錄水平的影響

為進一步驗證15基因敲除對PRV復制的影響，利用RT-qPCR檢測PK15-ISG15細胞在感染PRV后的不同時間點，PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平。與對照組PK-15細胞相比，PK15-ISG15細胞中 PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平極顯著升高(<0.01；<0.001)(圖5A～C)，表明15基因的敲除顯著促進PRV基因轉錄。

A. RT-qPCR檢測感染PRV不同時間PRV-EP0基因mRNA水平；B. RT-qPCR檢測感染PRV不同時間PRV-gE mRNA水平；C. RT-qPCR檢測感染PRV不同時間PRV-VP16 mRNA水平；D. RT-qPCR檢測感染PRV不同時間IFN-β mRNA水平。*.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05A. PRV-EP0 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; B. PRV-gE gene mRNA were quantified by RT-qPCR; C. PRV-VP16 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; D. PRV-IFN-β gene mRNA were quantified by RT-qPCR. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05圖5 敲除ISG15基因促進PRV基因轉錄、抑制PRV誘導的IFN-β基因轉錄Fig.5 Knockdown of ISG15 promotes PRV transcription and inhibits PRV-induced IFN-β transcription

同時檢測不同時間段-β的mRNA水平，結果顯示，PK15-ISG15細胞中-β mRNA水平感染在0～6 h差異不顯著；6～36 h時顯著低于對照組(<0.05)(圖5D)，表明15基因敲除可以顯著抑制-β的表達。

2.6 ISG15基因敲除對PRV蛋白表達的影響

相同感染復數(MOI=2)的PRV感染PK-15細胞和PK15-ISG15細胞，并在不同時間點收取細胞總蛋白，Western blot檢測結果顯示，PRV感染后不同時間PK15-ISG15細胞中 PRV-gE蛋白的表達量顯著高于對照PK-15細胞(圖6A)。PK-15細胞在感染PRV 12 h時檢測到PRV-gE蛋白，而PK15-ISG15細胞在感染PRV 6 h就可以檢測到PRV-gE蛋白，并且顯示在PRV感染12、24、36 h的PK15-ISG15細胞檢測到的PRV-gE蛋白明顯高于PK-15細胞。對PRV病毒蛋白的表達進行灰度分析顯示，PK15-ISG15中PRV-gE的蛋白表達極顯著高于PK-15細胞(<0.001)(圖6B)。以上結果表明，15基因敲除促進PRV-gE蛋白表達。

PRV gE蛋白Western blot結果(A)及灰度值分析結果(B)。***. P<0.001Western blot results of PRV gE protein(A)and gray value analysis results (B). ***. P<0.001圖6 敲除ISG15基因促進PRV-gE蛋白表達Fig.6 Knockout of ISG15 gene promotes PRV-gE protein expression

2.7 ISG15基因敲除對PRV病毒滴度的影響

為研究PK-15和PK15-ISG15細胞擴增PRV子代病毒滴度的差異，用相同感染復數(MOI=2)的PRV分別感染這兩種細胞，通過病毒噬斑法測定并計算PRV的病毒滴度。結果顯示，PK15-ISG15細胞的空斑數多于PK-15細胞，并且每個稀釋度的空斑數均高于PK-15細胞(圖7A、B)。如圖7C所示，隨著感染時間的增加，PK15-ISG15細胞的病毒滴度顯著高于PK-15細胞的病毒滴度(<0.05)，并且在12 h后PK15-ISG15細胞的病毒滴度極顯著高于PK-15細胞(<0.001)。結果進一步證實15基因敲除促進PRV的增殖。

A．PRV感染24 h PK-15細胞病毒噬斑(1表示細胞對照；2～6表示病毒4倍梯度稀釋，圖中按照標號順序每孔的空斑數量分別為0、1、2、14、40、153個)；B．PRV感染24 h PK15-ISG15-/-細胞病毒噬斑(1表示細胞對照；2～6表示病毒4倍梯度稀釋，圖中按照標號順序每孔的噬斑數量分別為0、1、7、26、94、190個)；C. PK15-ISG15-/-細胞與PK-15細胞的病毒滴度。*P<0.05; ***.P<0.001A. Plaque of PK-15 cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 2, 14, 40 and 153, respectively); B. Plaque of PK15-ISG15-/- cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 7, 26, 94 and 190, respectively); C. Virus titers of PK-15 and PK15-ISG15-/- cell. *.P<0.05; ***.P<0.001圖7 敲除ISG15基因促進PRV子代病毒的增殖Fig.7 Knockout of ISG15 gene promotes proliferation of PRV virus

2.8 ISG15蛋白對PRV復制的影響

為了驗證ISG15是否通過抑制病毒入侵抑制PRV的復制，將純化的ISG15蛋白與PRV于37 ℃孵育1 h后感染細胞，通過Western blot、RT-qPCR和病毒噬斑分別檢測PRV的蛋白表達、轉錄水平以及病毒滴度，BSA與PRV孵育作為陰性對照，說明ISG15與PRV的相互作用是特異性的。Western blot檢測和灰度分析結果顯示，與對照組相比ISG15抑制PRV-gE蛋白的表達(<0.05)(圖8A)；RT-qPCR結果顯示，PRV-的mRNA水平較對照組顯著降低 (<0.05)(圖8B)；病毒噬斑結果進一步證實ISG15可以抑制PRV的復制(<0.05)(圖8C)。以上結果表明，ISG15蛋白對PRV的抑制作用是通過抑制病毒侵入宿主細胞實現的。

A. Western blot檢測不同處理PRV感染后PRV-gE蛋白表達(左)及灰度值分析結果(右)；B. RT-qPCR 檢測不同處理PRV感染后PRV-gE基因的mRNA水平；C. 病毒噬斑檢測不同處理PRV感染后病毒滴度。*. P<0.05A. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by Western blot (left) and gray value analysis results (right); B. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by RT-qPCR; C. Virus titer after infection with different treatments of PRV by plaque. *. P<0.05圖8 ISG15通過抑制病毒入侵抑制PRV的復制Fig.8 ISG15 inhibits PRV replication by inhibiting viral invasion

3 討 論

ISG15是由病原微生物IFN誘導產生的，在宿主防御和清除外源病原感染方面發揮重要作用。ISG15已被證明在病毒感染過程中發揮重要作用，既可以通過直接作用影響病毒感染的各階段，也可以通過間接作用影響病毒感染的宿主信號通路，發揮免疫調節作用。由于作用機理的差異，ISG15在不同病原體之間甚至不同宿主物種之間的重要性可能會有所不同。對ISG15的研究有助于抗病毒藥物的研發，也能為干預許多疾病的進展提供新的靶標。本試驗利用近年來發展迅速的CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建了穩定敲除15基因的PK-15細胞系，選取sgRNA2細胞株進行功能評價，并將該細胞克隆命名為PK15-ISG15，用于研究ISG15對PRV復制的影響及作用機制。

敲低15可促進A型流感病毒(influenza virus，IAV)的復制。Nicholl等研究表明，單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染可以激活15、等干擾素應答基因，從而抑制HSV-1的復制。Hsiao等研究發現，過表達ISG15可以顯著抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的復制。本課題組前期研究發現，PRV感染PK-15細胞后引起ISG15的表達上調，過表達ISG15顯著抑制PRV的復制。然而，ISG15抑制PRV復制的分子機制尚不清楚。本研究利用構建的PK15-ISG15細胞系對15基因在PRV感染過程中的作用加以探究。結果表明，15基因的敲除能夠顯著增加PRV基因的轉錄、病毒蛋白的翻譯以及病毒的增殖，由此確定了ISG15對PRV具有抗病毒作用，敲除ISG15能夠促進PK-15細胞中PRV的復制。

病毒入侵機體后，免疫系統可以識別病毒來源的核酸，誘導產生Ⅰ型IFN、促炎性細胞因子等。Chen等發現PRV感染過程中，ISG20在PK-15細胞中通過增強IFN-β信號抑制PRV復制。ISG15在抑制PRV復制過程中發揮關鍵作用，在本研究進一步發現，ISG15敲除能抑制IFN-β的表達，推測 ISG15抗PRV復制的作用可能是通過調節Ⅰ型IFN實現，這其中的具體作用機制還需進一步探究和闡明，本文構建的15敲除細胞系可以為該機制的研究提供有力工具。

4 結 論

從PK-15細胞中敲除15并通過IFA、RT-qPCR、Western blot和病毒噬斑評估了15基因敲除后對PRV復制的影響，確定了ISG15對PRV的抗病毒作用。進一步發現敲除15能夠抑制IFN-β的表達，在一定程度上促進PRV的復制。本研究為進一步探討ISG15抑制PRV復制的分子機制提供良好的生物材料。