HMGB1與日本血吸蟲病肝炎癥和纖維化的相關(guān)性分析

鐘昊然，侯 玲,，桂 祥，呂榮雪，劉金明，古少鵬，金亞美*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，國(guó)家動(dòng)物血吸蟲病參考實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801)

血吸蟲病是僅次于瘧疾的全球第二大寄生蟲病，廣泛分布于亞熱帶與熱帶的76個(gè)國(guó)家和地區(qū)，對(duì)人畜健康造成嚴(yán)重危害。血吸蟲蟲體呈線形，雌雄異體，在感染過(guò)程中，蟲體不會(huì)對(duì)宿主造成明顯的病理?yè)p害，而成熟雌蟲所產(chǎn)蟲卵不僅造成宿主嚴(yán)重病理?yè)p害，還引起疾病的再傳播。在全球廣泛流行的三種感染人類的血吸蟲中(日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲)，日本血吸蟲()產(chǎn)卵量最大。日本血吸蟲所產(chǎn)蟲卵主要沉積于肝與腸道，沉積于肝的蟲卵分泌的可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigens，SEA)刺激宿主免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積，進(jìn)而引發(fā)肉芽腫和繼發(fā)性肝纖維化等病理變化。日本血吸蟲病肝纖維化若治療不當(dāng)或不及時(shí)可發(fā)展為慢性血吸蟲病。日本血吸蟲病晚期患者即使進(jìn)行了徹底的殺蟲治療，宿主體內(nèi)未成熟蟲卵仍可繼續(xù)發(fā)育，導(dǎo)致蟲卵肉芽腫反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。盡管已去除誘因，但當(dāng)肝纖維化發(fā)展到一定程度時(shí)，病癥往往不可逆轉(zhuǎn)，而當(dāng)發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌時(shí)，患者將出現(xiàn)肝脾腫大、門脈高壓等癥狀，最終可因上消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥致死。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是高遷移率族蛋白家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物組織中，參與眾多生物學(xué)功能，例如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)以及細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)等。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，HMGB1可作為一種炎性因子，由損傷壞死的肝細(xì)胞被動(dòng)釋放，通過(guò)與糖基化晚期終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和Toll樣受體結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。近年來(lái)研究表明，HMGB1與各類纖維化疾病也密切相關(guān)，如肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化以及心肌纖維化等。此外，在曼氏血吸蟲()病肝纖維化患者的血清和肝中均可檢測(cè)到高水平HMGB1表達(dá)，證實(shí)HMGB1參與血吸蟲致肝疾病。然而，HMGB1在日本血吸蟲病肝纖維化的致病過(guò)程中扮演何種角色卻鮮有研究。

日本血吸蟲蟲卵分泌物引起的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致宿主肝病變的主要原因。本研究構(gòu)建了日本血吸蟲肝病模型，并在蟲卵發(fā)育早期給予小鼠甘草甜素(glycyrrhizin，GL，HMGB1抑制劑)，觀察GL能否通過(guò)抑制HMGB1對(duì)血吸蟲蟲卵導(dǎo)致的宿主肝病變起保護(hù)作用，初步探究了HMGB1與宿主肝炎癥和纖維化的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明日本血吸蟲病肝纖維化的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為慢性日本血吸蟲病治療藥物靶點(diǎn)的選擇提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠25只，6周齡，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2018-0004]。每天12 h光照，12 h黑暗循環(huán)，飼養(yǎng)過(guò)程中給予全價(jià)飼料，自由飲水。中國(guó)大陸株日本血吸蟲尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲課題組釘螺室提供。本試驗(yàn)通過(guò)了中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理管理委員會(huì)審查(SV-20210709-02)。

1.2 主要試劑與儀器

HMGB1抑制劑甘草甜素(glycyrrhizin，GL)，羧甲基纖維素鈉(中國(guó) Abmole)；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，Hifair II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit，Masson染色試劑盒(上海翊圣生物科技)；TRIzol(北京天根生化科技)；血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞B(yǎng)C5300)；全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技)；NanoDrop 2000核酸測(cè)定儀(美國(guó) Thermo)；Abi 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABi)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康Eclipse80)。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組

將25只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(=10)，感染后4周組、6周組和HMGB1抑制劑組(=5)。小鼠腹部去毛，在解剖鏡下計(jì)數(shù)日本血吸蟲尾蚴，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠通過(guò)腹部貼片法感染日本血吸蟲尾蚴，每只小鼠感染(20±2)條尾蚴。將GL溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，配制成6.25 mg·mL的溶液，HMGB1抑制劑組每只小鼠自感染后24 d起連續(xù)4 d灌胃0.2 mL GL溶液(即每只小鼠50 mg·kg)，4周空白對(duì)照組與感染組則連續(xù)4 d灌胃等體積生理鹽水。尾蚴感染4、6周后，分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行眼眶靜脈采血，采集肝右葉置于4%多聚甲醛固定，用于病理切片制作，采集肝左葉置于液氮速凍后-80 ℃保存，用于提取肝組織總RNA。

1.4 血常規(guī)及血清生化檢測(cè)

用含180 μL稀釋液的1.5 mL離心管收集100 μL血液，吹打混勻，室溫放置2 min后用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、嗜中性粒細(xì)胞(neutrophils，Neu)、單核細(xì)胞(monocytes，Mon)和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，Eos)。剩余全血于4 ℃靜置30 min，400×離心15 min，收集上層血清用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)AST和ALT。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查

將采集的肝樣品，置于4%多聚甲醛中溶液中，固定48 h后取出，流水沖洗12 h；進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明及浸蠟后包埋于石蠟中；常規(guī)切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后鏡檢。用Image J軟件測(cè)量每張切片中由單個(gè)蟲卵形成的蟲卵肉芽腫面積，并計(jì)算每張切片中的所有蟲卵肉芽腫的總面積與每張肝切片面積的比值。此外，每張切片任選5個(gè)視野，根據(jù)肝纖維化病理Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 肝纖維化病理Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Ishak index score of liver fibrosis

1.6 Masson染色

將小鼠肝切片按Masson染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，中性樹膠封片后鏡檢。每張切片任選5個(gè)視野，用Image J軟件計(jì)算藍(lán)色膠原纖維面積，膠原面積的百分比越高，肝纖維化程度越高。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)HMGB1相關(guān)炎性因子及纖維化因子的表達(dá)

用TRIzol法提取肝組織總RNA。隨后采用NanoDrop 2000核酸測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，總RNA經(jīng)Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。自NCBI GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)獲得高遷移率族蛋白 B1(1，No. NM_010439.4)，白細(xì)胞介素-1β(-1，No. NM_008361.4)，腫瘤壞死因子α(-，No. NM_013693.3)，白細(xì)胞介素-6(-6，No. NM_031168.2)，干擾素γ(-，No. NM_008337.4)，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(-，No. NM_007392.3)，Ⅰ型膠原α1(11，No. NM_007742.4)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(-1，No. NM_011577.2)，Smad蛋白2(2，No. NM_010754.5)，Smad蛋白3(3，No. NM_016769.4)及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(, No. NM_008084.3)的序列，設(shè)計(jì)引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行熒光定量RT-PCR。反應(yīng)體系為5 μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，正反向引物各0.5 μL，2 μL cDNA模板，補(bǔ)去離子水至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s；95 ℃ 50 s。各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平采用相對(duì)定量方法(2-ΔΔ)。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for RT-PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差分析(One-way ANOVA), *表示差異顯著(<0.05), **表示差異極顯著(<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 感染4周后小鼠各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

感染4周后，對(duì)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，4周空白對(duì)照組、感染組的血常規(guī)檢測(cè)未見(jiàn)異常指標(biāo)(結(jié)果未展示)；血清生化檢測(cè)可見(jiàn)4周感染組小鼠ALT數(shù)值極顯著高于4周空白對(duì)照組(圖1A)(<0.01)；各組小鼠肝形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)明顯異常(結(jié)果未展示)；各組小鼠肝切片Masson染色未見(jiàn)明顯膠原纖維沉積(結(jié)果未展示)；RT-PCR檢測(cè)感染4周后小鼠肝內(nèi)炎性因子及纖維化因子表達(dá)顯示，肝組織中-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于4周空白對(duì)照組(圖1B)(<0.05)，1、-、-6及-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量則極顯著高于4周空白對(duì)照組(圖1B)(<0.01)。以上結(jié)果表明，在感染日本血吸蟲尾蚴4周后，肝功能部分指標(biāo)異常，提示小鼠肝功能已受到一定程度的損傷。

A. 小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)；B. 小鼠肝炎癥和纖維化基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。*或**表示4周空白對(duì)照組與4周感染組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；虛線表示正常范圍A. Serum ALT content of mice; B. The mRNA expression of inflammatory and fibrotic cytokines. * or ** indicates that the difference between week-4 control and week-4 infected group are significant (P<0.05) or extremely significant (P<0.01); the dotted lines indicate the normal range圖1 感染4周后小鼠各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)Fig.1 Indexes detection of mice after 4 weeks infection

2.2 感染6周后小鼠血常規(guī)及血清生化檢測(cè)

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，6周感染組小鼠WBC、Eos和Mon數(shù)值顯著高于6周空白對(duì)照組小鼠(圖2A～D)(<0.05)，Neu數(shù)值極顯著高于6周空白對(duì)照組(圖2B)(<0.01)；6周空白對(duì)照組小鼠各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。血清生化檢測(cè)結(jié)果顯示，6周感染組小鼠ALT和AST數(shù)值極顯著高于6周空白對(duì)照組小鼠(圖2E、F)(<0.01)；6周空白組小鼠各項(xiàng)血液生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。血常規(guī)及血清生化檢測(cè)結(jié)果表明，在感染日本血吸蟲尾蚴6周后，小鼠機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且肝功能受到嚴(yán)重?fù)p傷。

A～D. 小鼠血常規(guī)WBC、Neu、Mon、Eos檢測(cè)；E～F. 小鼠血清生化ALT、AST檢測(cè)。*或**表示6周空白對(duì)照組與6周感染組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；虛線表示正常范圍A-D. Blood routine test of WBC, Neu, Mon and Eos in mice; E-F. Blood biochemical tests of ALT and AST in mice. * or ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group are significant (P<0.05) or extremely significant (P<0.01); the dotted lines indicate the normal range圖2 感染6周后小鼠血常規(guī)及血液生化檢測(cè)Fig.2 Blood routine test and blood biochemical test of mice after 6 weeks infection

2.3 感染6周后小鼠肝形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)檢查

小鼠肝形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)6周空白對(duì)照組小鼠肝呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟而脆，肝葉邊緣銳利；6周感染組小鼠肝呈深棕色，表面可見(jiàn)大小不一的白色蟲卵肉芽腫，質(zhì)地較硬，肝葉邊緣粗糙(圖3A)。HE染色結(jié)果顯示，6周空白對(duì)照組小鼠肝肝竇清晰，肝細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等異常病理學(xué)變化；6周感染組小鼠肝內(nèi)有蟲卵聚積，蟲卵周圍存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞(圖3B)。根據(jù)肝纖維化病理 Ishak評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì) HE染色切片進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果顯示，6周感染組Ishak評(píng)分極顯著高于6周空白對(duì)照組(圖3C)(<0.01)。用Image J軟件計(jì)算肉芽腫面積，結(jié)果顯示，6周感染組小鼠肝肉芽腫面積以及每張切片肉芽腫面積占比均極顯著高于6周空白對(duì)照組(圖3D、3E)(<0.01)。通過(guò)對(duì)肝進(jìn)行形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)檢查可知，在感染日本血吸蟲尾蚴6周后，小鼠肝呈現(xiàn)肝纖維化癥狀。

A. 小鼠肝形態(tài)學(xué)觀察；B. 小鼠肝組織HE染色(200×)；C. 小鼠肝纖維化病理 Ishak評(píng)分；D. 肝肉芽腫面積占比；E. 單個(gè)蟲卵肉芽腫面積。掃文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖。黑色箭頭表示蟲卵肉芽腫；**表示6周空白對(duì)照組與6周感染組相比差異顯著極顯著(P<0.01)A. Morphology observation of livers; B. HE staining of livers (200×); C. Ishak index score of hepatic fibrosis; D. Percent of egg granulomas; E. Area of a single granuloma. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page. Black arrows indicate granuloma; ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P<0.01)圖3 感染6周后小鼠肝形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)檢查Fig.3 Morphological and histopathological examination of liver in mice after 6 weeks of infection

2.4 感染6周后小鼠肝Masson染色

鏡檢可見(jiàn)6周感染組小鼠肝匯管區(qū)蟲卵結(jié)節(jié)周圍有藍(lán)色纖維增生，有部分向肝小葉間延伸；6周空白對(duì)照組未見(jiàn)明顯著色(圖4A)。用Image J軟件對(duì)各組Masson染色切片進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，6周感染組膠原纖維表達(dá)面積顯著高于6周空白對(duì)照組(圖4B)(<0.01)。Masson染色結(jié)果表明，6周感染組小鼠肝嚴(yán)重纖維化。

A. 小鼠肝Masson染色(200×)；B. 小鼠肝Masson染色著色面積。掃文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖。黑色箭頭表示Masson染色陽(yáng)性區(qū)域；**表示6周空白對(duì)照組與6周感染組相比差異顯著極顯著(P<0.01)A. Masson staining of livers (200×); B. Masson staining area. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page. Black arrows indicate positive areas of Masson staining; ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P<0.01)圖4 感染6周后小鼠肝Masson染色Fig.4 Masson staining of liver in mice after 6 weeks infection

2.5 RT-PCR檢測(cè)感染6周后小鼠HMGB1等炎性因子表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，6周感染組小鼠肝組織中1、-1、-、-6及-mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于6周空白對(duì)照組(圖5)(<0.01)。結(jié)果表明，小鼠肝產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。

**表示6周空白對(duì)照組與6周感染組相比差異顯著極顯著(P<0.01)**. indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P<0.01)圖5 感染6周后小鼠肝組織HMGB1等炎性因子的mRNA表達(dá)Fig.5 The mRNA expression of HMGB1 and other inflammatory cytokines in mice liver after 6 weeks infection

2.6 RT-PCR檢測(cè)感染6周后小鼠纖維化因子表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，6周感染組小鼠肝組織中-、11、-1及3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于6周空白對(duì)照組(圖6)(<0.01)，2的mRNA相對(duì)表達(dá)量則顯著高于6周空白對(duì)照組(圖6)(<0.05)。結(jié)果表明,小鼠肝產(chǎn)生纖維化反應(yīng)。

*或**表示6周空白對(duì)照組與6周感染組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)* or ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group are significant (P<0.05) or extremely significant (P<0.01)圖6 感染6周后小鼠肝纖維化因子的mRNA表達(dá)Fig.6 The mRNA expression of fibrotic cytokines in mice liver after 6 weeks infection

2.7 HMGB1抑制劑對(duì)感染4周小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響

在感染日本血吸蟲尾蚴24 d后，連續(xù)4 d灌胃HMGB1抑制劑GL 50 mg·kg，檢測(cè)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，GL給藥組小鼠ALT數(shù)值相比4周感染組小鼠顯著下降(圖7A)(<0.05)；肝組織中1、-、-β1、-6及-α mRNA相對(duì)表達(dá)量相比4周感染組小鼠均呈下降趨勢(shì)，其中，1與-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(圖7B)(<0.05)，-、-1與-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(圖7B)(<0.01)。以上結(jié)果表明，在日本血吸蟲蟲卵發(fā)育早期給予GL可抑制HMGB1表達(dá)，進(jìn)而引起肝炎癥及纖維化相關(guān)指標(biāo)下調(diào)。

A. 小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)；B. 小鼠肝炎癥及纖維化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。*或**表示4周空白對(duì)照組與4周感染組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；#或##表示4周感染組與4周GL給藥組相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；虛線表示正常范圍A. Serum ALT content of mice; B. The mRNA expression of inflammatory and fibrotic related cytokines. * or ** indicates that the difference between week-4 control and week-4 infected group are significant (P<0.05) or extremely significant (P<0.01); #or ## indicates that the difference between week-4 infected group and GL treated group are significant (P<0.05) or extremely significant (P<0.01); the dotted lines indicate the normal range圖7 HMGB1抑制劑對(duì)感染4周小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響Fig.7 Effects of HMGB1 inhibitor on indexes of mice after 4 weeks infection

3 討 論

慢性血吸蟲病對(duì)宿主的損害主要以肝纖維化為特征，血吸蟲蟲卵聚積于宿主肝門脈系統(tǒng)并分泌SEA，形成肉芽腫繼而引起ECM大量沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變是肝纖維化發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。HSCs活化的過(guò)程伴隨著多種促纖維化細(xì)胞因子的分泌增加，如α-SMA、Col1α1和TGF-β1等。其中，α-SMA和Col1α1已被公認(rèn)為是肝纖維化的標(biāo)志物，在寄生蟲、病毒、異常代謝、大量飲酒和過(guò)度免疫反應(yīng)等各種病因引起的肝纖維化中均異常表達(dá)。TGF-β1則是纖維化疾病的重要調(diào)控因子，可調(diào)控成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并與下游轉(zhuǎn)錄因子Smad2、Smad3相互作用，通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)膠原合成。

嚴(yán)自助等研究表明，小鼠感染日本血吸蟲尾蚴第25天時(shí)，可首先在肝組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)期蟲卵，從初產(chǎn)期至蟲卵發(fā)育成熟需10 d左右。本研究在小鼠感染日本血吸蟲尾蚴28 d時(shí)，用熒光定量PCR檢測(cè)感染小鼠肝組織中炎性及纖維化相關(guān)因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1、-、-6、-及-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且血清ALT水平顯著上升，提示肝中的初產(chǎn)期蟲卵已使肝組織發(fā)生一定損傷。感染6周后蟲卵已發(fā)育成熟，再次使用熒光定量PCR檢測(cè)感染小鼠肝組織中纖維化標(biāo)志物-、11、-1、2及3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，6周感染組小鼠肝組織中各基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于6周空白對(duì)照組小鼠。同時(shí)，結(jié)合肝病理學(xué)檢查可證實(shí)，在感染日本血吸蟲尾蚴6周后，蟲卵肉芽腫周圍已出現(xiàn)肝纖維化癥狀。

HMGB1作為一種多功能細(xì)胞因子，可由損傷的肝細(xì)胞被動(dòng)釋放。Ge等發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，HMGB1在肝組織中的表達(dá)與α-SMA、Col1α1的表達(dá)成正相關(guān)。此外，利用siRNA沉默體外HSC-T6細(xì)胞系中的HMGB1表達(dá)后，細(xì)胞中α-SMA、Col1α1的表達(dá)也得到抑制，證明HMGB1與HSC的活化密切相關(guān)。此外，Albayrak等研究表明，在乙型肝炎病毒致肝纖維化患者的血清中可檢測(cè)到高水平HMGB1。Vicentino等則在致肝纖維化患者的血清檢測(cè)中得到相似結(jié)果，說(shuō)明HMGB1應(yīng)該與肝纖維化有關(guān)，且有望成為肝纖維化的重要診斷指標(biāo)。本研究中，4周與6周感染組小鼠肝組織內(nèi)1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于相應(yīng)空白對(duì)照組小鼠，證實(shí)了HMGB1與日本血吸蟲病肝纖維化的相關(guān)性，驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果，但HMGB1如何調(diào)控肝纖維化仍需進(jìn)一步研究。

在肝纖維化發(fā)展時(shí)，肝組織同時(shí)會(huì)分泌大量炎性因子，使HSCs在炎性因子的刺激下持續(xù)活化，進(jìn)一步促進(jìn)纖維化進(jìn)程。本研究中，4周感染組小鼠血常規(guī)檢測(cè)無(wú)異常指標(biāo)，6周感染組小鼠的血液WBC、Mon、Neu和Eos顯著高于6周空白對(duì)照組，肝組織內(nèi)炎性因子1、-1、-6、-及-mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，提示感染日本血吸蟲尾蚴6周后小鼠體內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。HMGB1作為炎性因子被動(dòng)釋放時(shí)，可與細(xì)胞膜表面受體RAGE/TLR結(jié)合，活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信號(hào)通路，使NF-κB磷酸化并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)下游炎性因子轉(zhuǎn)錄。He等發(fā)現(xiàn)，在感染日本血吸蟲的小鼠肝星狀細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路被激活。邢媛等研究則表明，在四氯化碳肝纖維化小鼠模型中，除肝組織中HMGB1表達(dá)升高外，血清中TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游的炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)也隨四氯化碳損傷的加劇而升高，也表明 HMGB1與肝炎癥的發(fā)展有關(guān)。

慢性血吸蟲病繼發(fā)的肝疾病涉及多條信號(hào)通路的參與，通過(guò)藥物抑制關(guān)鍵信號(hào)通路的激活是目前主要的治療原則，但臨床上單一藥物的治療效果不足以完全逆轉(zhuǎn)肝纖維化，故篩選潛在高效的藥物作用位點(diǎn)至關(guān)重要。GL是甘草中的重要生理活性物質(zhì)，已被證實(shí)具有抗病毒、抗炎和保肝等功能。同時(shí)，GL可與HMGB1的功能結(jié)構(gòu)域A box和B box結(jié)合，從而抑制HMGB1的生物學(xué)功能，是HMGB1的一種天然抑制劑。Vicentino等通過(guò)口服GL抑制HMGB1表達(dá)來(lái)治療致肝纖維化小鼠，結(jié)果顯示，小鼠存活率升高、肝肉芽腫面積減小、肝炎癥及纖維化因子表達(dá)下調(diào)，證實(shí)HMGB1有成為慢性血吸蟲病治療藥物靶點(diǎn)的潛力。最新研究表明，通過(guò)口服丁酸鈉抑制HMGB1表達(dá)，也可有效緩解日本血吸蟲致小鼠肝纖維化。本研究在日本血吸蟲蟲卵發(fā)育早期，自感染尾蚴后24 d起，連續(xù)4 d灌胃給予小鼠GL 50 mg·kg，結(jié)果顯示，小鼠血清ALT水平和肝組織中1、-、-6、-及-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較4周未給藥組顯著下降，提示GL可抑制HMGB1表達(dá)，進(jìn)而引起肝炎癥及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明GL 對(duì)宿主肝能起一定保護(hù)作用。然而，HMGB1調(diào)控肝炎癥和纖維化的分子機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建日本血吸蟲病肝纖維化模型，初步探索了HMGB1與宿主肝炎癥和纖維化的潛在關(guān)系，為闡明日本血吸蟲病肝纖維化的致病機(jī)理提供重要參考，同時(shí)也討論了HMGB1作為慢性日本血吸蟲病治療藥物靶點(diǎn)的可能性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)證實(shí)HMGB1與日本血吸蟲病肝炎癥及纖維化具有一定相關(guān)性。此外，在病因形成早期給予HMGB1抑制劑GL能對(duì)宿主肝產(chǎn)生一定保護(hù)作用。