弓形蟲4個假定蛋白基因缺失株的構建及其基本生物功能學研究

王 沛，王 萌，李婷婷，鄭曉楠，梁勤立，陳小慶1，*

(1.江西農業大學動物科學技術學院，江西省動物疫病診斷與防控重點實驗室，南昌 330045；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

剛地弓形蟲()是一種分布廣泛且危害嚴重的重要人畜共患病病原，全世界約有三分之一的人感染。弓形蟲生活史相對復雜，具有多宿主和多階段的發育周期。其生命周期包括有性生殖階段和無性生殖階段，但有性生殖階段僅存在于終末宿主貓科動物的腸道黏膜中，而無性生殖階段可以發生在人及幾乎所有溫血動物中。弓形蟲的傳播方式多樣，其有性生殖階段和無性生殖階段的任一環節均可感染宿主，這也是弓形蟲病患者基數龐大的重要原因之一。弓形蟲可在宿主的腦部、心以及骨骼肌中形成包囊，人和動物攝入未烹飪或烹飪不完全的帶有感染力包囊的食物以及被其成熟卵囊污染的水，是感染弓形蟲病的重要途徑。大多數弓形蟲病患者為隱性感染，但對于HIV/AIDS患者以及免疫功能低下的個體而言，急性感染是相對常見的，甚至有致死的可能性。弓形蟲對孕婦和孕畜的危害巨大，速殖子可穿過胎盤，誘發先天性弓形蟲病，導致胎兒流產或生理缺陷。因此，對弓形蟲毒力因子的研究具有深遠的公共衛生學意義。

弓形蟲入侵宿主細胞的機制復雜，完整的入侵過程需要多種分泌蛋白共同協作。與弓形蟲毒力相關的主要調節因子有棒狀體蛋白(rhoptry protein, ROP)、致密顆粒(dense granule protein, GRA)、微線體蛋白(microneme protein, MIC)和表面抗原(surface antigen, SAG)等。其中，MIC蛋白是微線體分泌的一類在弓形蟲入侵早期具有重要功能的蛋白，對于弓形蟲識別、黏附及侵入宿主細胞尤為重要，并且還參與肌絲滑動，與弓形蟲的運動能力緊密相關。MIC蛋白的缺失，很有可能會導致弓形蟲失去入侵宿主細胞的能力，進而影響毒力的發揮。MIC蛋白由多種跨膜蛋白和黏附蛋白組成。截至目前，已經發現多種MIC基因，而且這些蛋白具有經典的信號肽序列。這些蛋白結構多樣且復雜，但是許多蛋白(如TgMIC1-4和TgMIC6-9)含有與高等真核生物蛋白質黏附的結構域或同源結構。對于具有黏附結構域的MICs蛋白，其可以與宿主細胞表面的受體和糖類結合，從而形成與宿主細胞相互作用的復合物。二者形成的復合物會分泌到蟲體的表面，在弓形蟲毒力和致病性方面發揮重要作用。通過蛋白結構和保守位點預測發現，部分MIC蛋白和假定蛋白均含有EGF_3結構域，并且同時還有相似的蛋白結構。通過蛋白結構預測結果和ToxoDB數據庫中提供的信息，作者挑選了4個可能與MIC蛋白相關的假定蛋白進行基因功能學研究。此前眾多學者已經對大部分MIC蛋白的功能進行解析，但并未對本研究選定的4個MIC相關的假定蛋白進行研究。那么這4個MIC假定蛋白是否也具有與MIC蛋白相似的結構和生物學功能呢？本研究基于CRISPR/Cas9技術，對弓形蟲I型RH蟲株的4個MIC假定蛋白相關基因進行敲除，以了解這4個基因對弓形蟲的生長和對小鼠致病性的影響，為弓形蟲疫苗的開發以及相關基因的研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株與實驗動物

弓形蟲RH蟲株速殖子由中國農業科學院蘭州獸醫研究所保存，30只6～8周齡SPF雌性昆明小鼠購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)以及0.25%胰酶均購自美國Gibco公司。質粒小提試劑盒購自北京天根生化有限公司，膠回收試劑盒購自OMEGA公司，乙胺嘧啶粉末購自美國Sigma-Aldrich公司，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自南京諾唯贊技術有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.3 細胞和蟲體培養

使用添加了10% FBS DMEM培養基培養HFF細胞，待細胞長滿，換成添加2% FBS的培養基，用于傳代弓形蟲I型RH蟲株親本株和基因敲除株的速殖子。待蟲體大量逸出時，收集蟲體和細胞，用1 mL注射器反復抽吸，裂解宿主細胞，使蟲體全部逸出。用孔徑為5 μm的Millipore過濾器過濾速殖子，最后將速殖子接入長滿HFF的細胞中傳代培養。

1.4 目的基因結構特征分析

將從ToXoDB下載的目的基因蛋白序列導入蛋白質結構域、家族和功能位點數據庫(https://prosite.expasy.org/)，獲得目的基因活性功能位點。將目的基因蛋白序列導入蛋白3D結構預測網站(https://swissmodel.expasy.org/interactive/)，以評分最高的蛋白結構進行3D建模，最后用Discovery Studio 4.5 分析蛋白結構。

1.5 弓形蟲基因敲除株的構建、篩選和鑒定

利用CRISPR/Cas9靶點選擇網站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)對弓形蟲RH蟲株的4個目的基因(TGME49_222975、TGME49_275798、TGME49_238220和TGME49_238210)進行靶點預測，并設計相關引物(表1)。根據設計的引物，以pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT為模板，利用Q5定點突變試劑盒將模板質粒中的靶點序列(SgUPRT)替換為目的基因靶點特異的SgRNA序列，酶切環化后得到帶有目的基因靶點序列的質粒，轉化后測序鑒定獲得陽性質粒。用表2設計的引物，以RH蟲株DNA為模板，擴增目的基因的U3、U5同源臂，以DHFR-D質粒為模板擴增抗性片段DHFR-TS，膠回收后，利用同源重組的方法，將目的基因的U3、U5和DHFR-TS連接至PUC19載體，獲得帶有相關目的基因同源臂以及乙胺嘧啶抗性片段的質粒，轉化后測序鑒定獲得陽性質粒。最后通過電擊轉染的方式將帶有目的基因靶點序列的質粒與帶有目的基因臂以及DHFR的抗性片段導入弓形蟲RH速殖子中(圖1)，用乙胺嘧啶進行篩選陽性蟲株。96孔板單克隆篩選后提取蟲體DNA，用之前設計的引物進行PCR驗證(表3)。所有目的基因缺失株構建原理相同。

表1 目的基因sgRNATable 1 sgRNA of target genes

表2 擴增同源片段引物Table 2 Primers for amplification of homologous fragments

表3 驗證敲除引物Table 3 Primers used for identification of the deletion

圖1 TGME49_222975基因敲除原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of disrupting TGME49_222975

1.6 噬斑試驗

將剛逸出的速殖子接種到長滿HFF細胞的12孔板中，分別接入300個目的基因缺失株和RH野生株速殖子，細胞培養箱培養7 d后，棄去原培養基，用PBS洗滌3遍，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液固定30 min，棄掉固定液，隨后每孔加入500 μL 0.5%結晶紫染液,染色10 min，棄掉結晶紫染液，再用PBS洗滌兩邊，倒置晾干，觀察并拍照記錄結果。

1.7 復制試驗

長滿HFF細胞的12孔板中每孔分別接入1×10個目的基因缺失株和RH野生株速殖子，培養24 h，棄掉原培養基，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，固定30 min，顯微鏡下分別記錄含有16、8、4、2、1個速殖子的納蟲空泡的數目及百分比。

1.8 逸出試驗

長滿單層HFF細胞的12孔板中每孔分別接入2×10個剛逸出的目的基因缺失株和RH野生株速殖子，培養28～32 h，棄去原有培養基，每孔加入1 mL提前37 ℃預熱添加了3 μmol·LA23187鈣離子的DMEM培養基，立刻用相機記錄速殖子實時逸出情況。

1.9 小鼠毒力試驗

將30只SPF級6～8周齡昆明雌鼠隨機分為5組，每組6只。以腹腔注射的方式接種基因缺失株速殖子和野生株RH速殖子，每只小鼠接種100個速殖子。每天定時觀察發病情況，并記錄小鼠的死亡情況。

1.10 基于ToXoDB數據庫對目的基因進行表達差異分析

通過ToxoDB(http：/ / toxodb.org)網站，分別檢索4個目的基因在不同基因型弓形蟲蟲株、不同生活史階段以及不同分裂周期的表達量數據，并對此數據進行差異化分析。

2 結 果

2.1 目的基因結構分析

用ExPASy分析4個目的基因蛋白序列(圖2)。未在TGME49_222975中檢索到保守的結構域，TGME49_275798檢索到1個EGF_3結構域，TGME49_238220和TGME49_238210均發現含有1個SRCR_2結構域和1個EGF_3結構域。SRCR_2結構域上有3個二硫鍵，EGF_3位點上有2個二硫鍵。SWISS-MODEL蛋白建模結果與ExPASy結果相符，并且發現TGME49_238220和TGME49_238210蛋白結構相似，蛋白功能可能比較相似；而TGME49_222975的蛋白結構與其余3個目的基因的蛋白結構差異較大，因此功能可能有較大差異。

a.保守結構域預測；b～e. 3D結構預測。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖a. Conservative structure domain prediction; b-e. 3D structure prediction. Scan OSID code for the color pictures圖2 目的基因保守結構域及蛋白3D結構Fig.2 Conserved structural domain of target gene and 3D structure of protein

2.2 目的基因敲除蟲株的鑒定

將電轉后的速殖子接入25T長滿單層HFF細胞，加入乙胺嘧啶進行篩選，待速殖子全部逸出后接入96孔板長滿單層HFF細胞中進行單克隆篩選。提取單克隆蟲株的DNA，用表3中引物檢驗是否成功篩選出目的蟲株。如圖3所示，4個目的基因缺失株(RHΔTGME49_222975、RHΔTGME49_275798、RHΔTGME49_238200和RHΔTGME49_238210)均無法擴增出PCR2目的基因片段，而成功擴增出PCR1、PCR3目的基因片段。對于RH野生株，均無法擴增出PCR1、PCR3基因片段，而PCR2可以擴增出目的大小基因片段，這說明成功構建4個目的基因敲除株。

圖3 目的基因的敲除驗證Fig.3 Identification of the knock-out strain

2.3 噬斑試驗

目的基因缺失株和RH野生株的速殖子以相同數量接種至12孔板長滿單層HFF細胞培養7 d后，固定染色并拍照記錄試驗結果。結果表明，4個目的基因敲除株與野生株RH所形成的噬斑數量和大小沒有明顯差異(>0.05，圖4)。

a.空斑大小及數目；b.空斑大小及數目可視化分析,n.s.P>0.05。掃文章首頁OSID碼可查看彩圖a.Size and number of plaques; b. Visual analysis of plaques size and number, n.s.P>0.05. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page圖4 目的基因缺失株和RH野生株空班形成情況Fig.4 Plaques formed by wild-type and the deletion strain

2.4 復制試驗

接種目的基因缺失株和RH野生株1×10個速殖子的12孔板長滿單層HFF細胞培養24 h后，棄去原培養基后固定，顯微鏡下觀察包含不同速殖子個數的納蟲空泡數量。結果顯示，含有16個速殖子的納蟲空泡數目最多，4個目的基因缺失株和RH野生株包含相同速殖子個數的納蟲空泡數目差別不顯著(>0.05，圖5)。

掃文章首頁OSID碼可查看彩圖The color picture can befound by scanning the OSID code on the front page圖5 目的基因缺失株和RH野生株體外復制情況Fig.5 Comparison of in vitro replication between the deletion strain and wild-type

2.5 逸出試驗

接種目的基因敲除株和RH野生株2×10個速殖子12孔板長滿單層HFF細胞培養28～32 h,棄去原培養基，加入一定濃度鈣離子，拍照記錄速殖子逸出情況。結果顯示，目的基因敲除株和RH野生株納蟲空泡內的速殖子2 min內大部分可全部逸出，在1 及1.5 min時間點時速殖子逸出情況也大體相似(圖6)。

圖6 RHΔTGME49_222975和RH野生株逸出情況Fig.6 Comparison of in vitro egress of RHΔTGME49_222975 and wild strain

2.6 小鼠毒力試驗

5組小鼠(6只·組)以腹腔注射的方式接種目的基因缺失株和RH野生株速殖子100個·只。結果顯示，5組小鼠在8～11 d內全部死亡，4個目的基因缺失株小鼠存活時間較接種野生株小鼠稍有延長，但差異并不明顯(>0.81，圖7)。

掃文章首頁OSID碼可查看彩圖The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page圖7 目的基因缺失株與RH野生株對昆明鼠的毒力情況Fig.7 Survival curves of Kunming mice infected with the deletion strain and wild-type strain

2.7 基于ToxoDB數據庫數據對目的基因的表達差異分析

通過ToxoDB數據庫檢索目的基因在不同弓形蟲蟲株(圖8a)、不同分裂期表達量(圖8b)和卵囊、速殖子和緩殖子期轉錄水平(圖8c)的數據，并分析發現，TGME49_222975、TGME49_275798相關數據并不齊全，不適合進行后續分析。TGME49_238220、TGME49_238210表達水平低，其中，TGME49_238220、TGME49_238210在RH蟲株中的表達量接近，表達量最高的蟲株分別為VEG和Pru，但表達量總體低。TGME49_238220不同分裂期表達量沒有變化，TGME49_238210表達量在S1分裂期間有一定增加。TGME49_238220、TGME49_238210在弓形蟲卵囊、速殖子和緩殖子階段的轉錄水平均不高，不同分裂期表達量差異不顯著(圖8)。

a、b、c分別代表目的基因在弓形蟲不同分裂期、不同基因型和不同生命階段的表達量差異分析a, b, c represent the differential expression of target genes in different division stages, different genotypes and different life stages of Toxoplasma gondii, respectively圖8 基于ToxoDB數據庫的目的基因表達差異分析Fig.8 Differential expression analysis of target genes based on ToxoDB database

3 討 論

CRISPR/Cas9作為一種操作簡便、高效的基因編輯工具，已經廣泛用于分子生物學和遺傳學研究。經過長時間的發展，CRISPR工具已經是弓形蟲基因的編輯常用工具之一，眾多相關研究成果已相繼發表。MIC基因是決定弓形蟲毒力的重要基因之一，大多數MIC基因生物學功能已經被相繼解析，但對于與MIC相關基因的研究相對有限。本研究基于轉錄組數據，有針對地挑選4個與MIC基因相關的假定蛋白展開功能學研究，以期找到與重要MIC基因聯系緊密的基因，更全面地解析MIC基因功能，為以后開發高效的弓形蟲疫苗奠定一定基礎。

多種微線體蛋白都含有EGF同源類似的結構域或EGF樣結構域，這些結構域對于微線體蛋白間形成復合物，從而提高弓形蟲對宿主細胞的黏附能力十分重要。EGF還可以通過與宿主細胞的EGFR結合，激活EGFR和Akt通路，進而阻止由宿主自噬蛋白和溶酶體蛋白啟動蟲體清除程序。SCRC是一種富含半胱氨酸的保守結構域，其功能不僅與蟲體黏附宿主細胞緊密相關，還與蟲體調節宿主免疫反應相關。其作為傳統意義上的模式識別受體，作為蛋白與蛋白相互作用中的受體是其發揮功能的重要體現。ExPASy檢索目的蛋白序列保守結構域發現，TGME49_275798含有1個EGF_3位點，TGME49_238220和TGME49_238210含有1個EGF_3和1個SCRC保守結構域。EGF和SCRC結構對于弓形蟲對宿主細胞的黏附、微線體蛋白之間形成復合物、蛋白與宿主蛋白發揮相互作用以及調節宿主的免疫反應有重要作用。以同樣方法分析部分MIC蛋白序列(如MIC3和MIC8)的保守結構域和3D結構發現，MIC3和MIC8蛋白也含有EGF_3位點。目的基因TGME49_238220和TGME49_23821與MIC3和MIC8蛋白3D結構也十分相似。

基于此，作者利用CRISPR技術敲除RH野生株4個與MIC相關的假定蛋白基因進行功能研究，成功獲得4個目的基因缺失株RHΔTGME49_222975、RHΔTGME49_275798、RHΔTGME49_238200和RHΔTGME49_238210。隨后比較基因敲除株與RH野生株在體外復制能力、逸出能力、形成空班的能力以及對昆明鼠的毒力間的差異。結果表明，目的基因缺失株與RH野生株形成的包含相同速殖子個數的納蟲空泡數目大體相當，目的基因缺失株與RH野生株速殖子的逸出能力以及形成空斑的數目和大小，接種相同劑量的目的基因缺失株和RH野生株的昆明鼠從開始死亡時間到全部死亡時間差別并不大，均無統計學差異(>0.05)。此外，基于定位蟲株的構建，間接免疫熒光試驗和蛋白免疫印記試驗結果均表明目的基因在速殖子階段并不表達或表達量極低以至于無法檢測到。以上結果均說明這4個與MIC相關的目的基因并不是影響弓形蟲體外生長能力、逸出能力以及毒力的重要基因。

通過ToxoDB數據庫，將目的基因在不同基因型弓形蟲蟲株、不同細胞周期的表達水平以及不同生活史階段的轉錄水平數據進行差異分析。但沒有檢索到TGME49_222975和TGME49_275798完整的可用于分析的轉錄組數據。通過比較TGME49_238220和TGME49_238210轉錄組數據發現，TGME49_238220在Pru中的表達量最高，在RH中表達量最低。TGME49_238210在VEG中表達量最高。但相較于其他功能較強大的基因，TGME49_238220與TGME49_238210在Pru、VEG中的表達水平并不高。這或許解釋了目的基因缺失株對弓形蟲體外復制能力、逸出能力以及對昆明鼠的毒力并未產生顯著影響。TGME49_238220在不同的分裂周期及不同生活史階段(卵囊、速殖子和緩殖子)轉錄水平無明顯變化，說明其對于弓形蟲分裂、卵囊的形成、速殖子緩殖子之間的轉化沒有影響或所發揮的功能有限。TGME49_238210在弓形蟲S1期表達量最高，說明其可能在分裂S1期中有一定作用，但表達量相對較低，也說明其作用有限。TGME49_238220和TGME49_238210在不同生活史階段中表達量有輕微浮動，但幅度較小。數據分析結果表明TGME49_238220和TGME49_238210在RH中的表達量較低，在不同分裂周期表達量、不同生活史階段(卵囊、速殖子和緩殖子)的轉錄水平均較低，與基因缺失株表型試驗結果相吻合。

本研究結果表明，4個目的基因均不是弓形蟲的重要“獨立”毒力因子，但可能在其他方面發揮著重要生物學功能。本研究為后續開發弓形蟲疫苗、全面解析弓形蟲蛋白的功能奠定了基礎。

4 結 論

成功構建4個以弓形蟲RH野生株為載體的MIC相關假定蛋白基因缺失株(RHΔTGME49_222975、RHΔTGME49_275798、RHΔTGME49_238200和RHΔTGME49_238210)，基因缺失株和野生株RH的噬斑試驗、復制試驗、逸出試驗以及小鼠毒力試驗結果均差異不顯著，可見4個目的基因均不是弓形蟲的重要“獨立”毒力因子。