C型產氣莢膜梭菌外毒素致小鼠腸道損傷的轉錄組分析

張思雨，王玉炯*，曾 瑾*

(1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021)

產氣莢膜梭菌()是一種短桿狀、無鞭毛、不運動、有莢膜、可形成內生孢子的專性厭氧的革蘭陽性菌。該菌能產生至少18種外毒素和酶類；傳統上，依據其產生的主要致死性毒素與其抗毒素的中和試驗可將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E 5個血清型，而在2017年美國安娜堡舉行的“第十屆梭狀芽胞桿菌分子生物學及其發病機制”國際會議上對該菌的分類擴展到7個類型(A～G)。其中，毒力較強的主要是A型和C型產氣莢膜梭菌，C型菌株定義為攜帶2個分型毒素基因(編碼α毒素)和(編碼β毒素)的產氣莢膜梭菌。

該菌引起的多種動物的氣性壞疽、腸毒血癥、壞死性腸炎(intestine necrotic, IN)難以預防和治療，流行范圍廣，從而引起大量的關注。在產氣莢膜梭菌引起的人類食源性疾病中，原因通常是病患食用了受到該菌污染的生肉及其制品，這些受污染的食品會由于不當的加工和保存，造成該菌的大量繁殖并分泌外毒素，從而引起食源性感染疾病。據美國疾病預防控制中心(CDC)統計，產氣莢膜梭菌病是美國第二大常見的食源性疾病，占總發病率的26%。我國居民飲食結構多以熟食為主，由產氣莢膜梭菌所引起的食源性感染事件較少，但也有相關的感染食源性疾病暴發的事件報道。

產氣莢膜梭菌病在畜禽養殖生產中的危害性更令人關注。特別是近年來“禁抗令”的實施，伴隨抗生素類生長促進劑從動物飼料中撤出，產氣莢膜梭菌所引發的壞死性腸炎的患病率明顯增加。該菌所產生的外毒素可影響牛、羊、豬以及禽類等幾乎所有的養殖動物，患病動物往往在短時間內迅速發病，常常會出現休克乃至死亡；該病對幼年動物的影響尤為嚴重，即使是經大量抗生素治療后存活下來的幼畜，也常常會出現發育遲緩以及壞死性腸炎的亞臨床現象，而亞臨床感染可以削弱畜禽的生長速度，降低飼料轉化率，減少體重增加，使其養殖生產性能受到嚴重的影響，并導致重大經濟損失。據報道僅C型產氣莢膜梭菌每年給全球家禽業造成約60億美元的生產損失和控制成本。

產氣莢膜梭菌是利用其分泌的大量蛋白質毒素在人類和動物中產生腸道感染、組織毒性以及神經反應等疾病狀態的。在一些條件下，人或動物攝入產氣莢膜梭菌，或黏附在消化道內壁上的該菌過度繁殖，迅速產生多種毒素和侵襲性酶，毒素作用于腸道中的多種靶細胞上的受體，激活細胞內信號通路，進而產生多種效應。在研究產氣莢膜梭菌感染的發病機制時，宿主和細胞敏感性似乎是需要考慮的關鍵因素，因此，常常選擇產氣莢膜梭菌相關疾病的體外或動物模型解決這個問題，而發病機制作為病理機制中的初期環節，可提供治療該病的重要靶點。而機體在響應產氣莢膜梭菌感染時，也會啟動免疫應答、代謝調控等一系列復雜的生物學過程。在這其中，涉及大量調控反應的相關蛋白的表達，以及關鍵信號通路的激活或抑制。目前，隨著現代技術的日益發展，越來越多的研究者采用高通量測序技術分析基因表達和信號通路富集情況，探究病原菌致病的分子機制，挖掘關鍵基因作為靶點。比如劉樂文對感染腸炎沙門菌雞的盲腸組織進行mRNA與miRNA測序，分析后發現：表達上調的mRNA包含169個表達下調miRNA的靶基因，主要富集在免疫反應、炎癥反應、細菌防御反應、Toll樣受體信號通路等與機體免疫相關的生物學過程。張旭等對感染鴨腸炎病毒的櫻桃谷鴨的十二指腸組織進行測序，通過GO和KEGG數據庫分析發現，差異表達基因主要富集在NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、IL-17信號通路等。也有關于產氣莢膜梭菌的轉錄組研究，比如姜天團對灌服C型產氣莢膜梭菌培養菌液的仔豬回腸組織進行蛋白組學和轉錄組學測序，聯合分析發現能量代謝、免疫響應、細胞膜結構、腸道炎癥等方面的變化可能介導仔豬對C型產氣莢膜梭菌的耐受性或易感性。但是，產氣莢膜梭菌的致病因子是其產生的多種外毒素和侵襲酶，該菌所分泌的毒素種類和數量受培養基成分、pH以及培養溫度等條件的影響而具有顯著的差異；同時還受到菌體VirS/VirR毒力調節系統以及Agr群體傳感系統的影響。因此，本研究規避了產氣莢膜梭菌的產毒條件所帶來的干擾，直接采用經腦心浸液中培養的C型產氣莢膜梭菌培養上清感染小鼠，通過RNA-seq技術對腸道組織轉錄組的變化進行分析，篩選差異表達基因，通過GO功能注釋和KEGG通路富集篩選關鍵信號通路，以期為C型產氣莢膜梭菌分泌外毒素致機體損傷的致病機理研究提供理論基礎和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6周齡BALB/c雌性小鼠，體質量均為20 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物常溫培養于12 h明暗交替的動物實驗室，保證其自由飲水、攝食。標準飼養3～5 d后進行試驗。

1.1.2 菌株與試劑 產氣莢膜梭菌中國標準株C59-2(C型)由本實驗室保存，腦心浸液培養基購自英國OXOID公司，產氣莢膜梭菌B型菌株鑒定血清和C型菌株鑒定血清均來自于中國農業科學院蘭州獸醫研究所，1K19單克隆抗體和2G7單克隆抗體均由本實驗室制得。

1.2 方法

1.2.1 毒素蛋白表達檢測 將產氣莢膜梭菌C59-2菌株復壯后培養于腦心浸液培養基中，培養至第4代，離心菌液收集培養上清，并通過0.22 μm細菌濾器過濾獲得上清，加入2×蛋白上樣緩沖液，于100 ℃金屬浴中煮5 min，制得蛋白免疫印跡樣品。樣品分別經過電泳、轉膜、封閉、孵育一抗(具體見圖1圖注)、洗滌、孵育二抗(山羊抗鼠IgG，Proteintech)、洗滌以及顯影過程，以分析毒素蛋白表達情況。

1.2.2 樣本采集 產氣莢膜梭菌C59-2培養上清經0.22 μm濾器過濾后備用；以不同劑量(10、20、40、80 μL)的培養上清對BALB/c小鼠腹腔注射進行攻毒，每組設置4只小鼠，24 h后觀察小鼠死亡情況。發現當注射培養上清的劑量為20 μL時BALB/c小鼠全部死亡，即絕對致死量LD為20 μL，因而確定在后續試驗中每只小鼠的最佳攻毒劑量為20 μL。對照組和處理組各隨機設置10只小鼠，處理組小鼠腹腔注射新鮮制備并稀釋的培養上清20 μL(原液)，對照組注射等體積腦心浸液培養基。在處理組小鼠出現瀕臨死亡狀態時解剖各組小鼠，快速收集小腸(空腸)病變部位于液氮速凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱待用。

1.2.3 總RNA提取 取兩組小鼠的腸道組織，使用RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN，德國)，按照說明書分別提取每個樣品的總RNA，并通過超微量分光光度計(Nanodrop 8000)檢測RNA的濃度及純度，通過Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性。

1.2.4 測序及原始數據質控 每個樣品構建一個文庫，庫檢合格后，通過Illumina測序平臺進行測序。經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得后續分析使用的clean reads。并且使用HISAT2軟件將質控后的clean reads與參考基因組進行精確的比對，以獲取reads在參考基因組上的定位信息。進而采用Subread軟件中的Feature Counts工具，根據獲取的位置信息統計每個基因從起始到終止范圍內覆蓋的reads數。過濾掉不合格數據后進行定量分析，以及后續的差異分析和富集分析。

1.2.5 差異表達基因分析 完成基因表達定量后，通過DESeq2對其表達數據進行統計學分析，篩選樣本在不同狀態下表達水平顯著差異的基因。并且引入adj對假設檢驗的-value進行校正，從而控制假陽性的比例。篩選標準為| lb(FoldChange)| ≥1.5，adj<0.05。

1.2.6 富集分析 采用cluster Profiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析等，篩選得到生物學過程中起關鍵作用的信號通路和相關分子途徑。

1.2.7 q-PCR驗證測序結果 在“1.2.5”篩選結果中隨機選取上調表達以及下調抑制基因各5個，使用Primer BLAST網站設計引物(表1)。將測序送樣后所剩余的RNA通過TaKaRa逆轉錄試劑盒反轉為cDNA，以-作為內參基因，通過Quant Studio 5儀器進行實時熒光定量PCR，采用2法分析數據，對測序結果進行驗證。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

2 結 果

2.1 產氣莢膜梭菌培養上清中的毒素蛋白表達檢測

通過“1.2.1”方法分析毒素蛋白的表達情況，結果表明，產氣莢膜梭菌C59-2菌株經腦心浸液培養基培養后上清中具有外毒素，包括Alpha毒素(較少)和Beta1毒素(圖1)，符合C型產氣莢膜梭菌分型條件。

A. 孵育識別Alpha毒素的B型菌株鑒定血清；B. 孵育識別Alpha毒素的C型菌株鑒定血清；C. 孵育識別Beta1毒素的1K19單克隆抗體；D. 孵育識別Beta2毒素的2G7單克隆抗體；M. 蛋白相對分子質量標準；1. BL21(DE3)pET-32a誘導后全菌液；2.液體硫乙醇酸鹽培養基培養上清；3.腦心浸液培養基培養上清A. Type B strain identification serum(recognizes Alpha toxin); B. Type C strain identification serum (recognizes Alpha toxin); C. 1K19(recognizes Beta1 toxin); D. 2G7(recognizes Beta2 toxin); M. Protein marker; 1. BL21(DE3)pET-32a Whole bacterial solution after induction; 2. Culture supernatant of fluid thioglycollate medium; 3. Culture supernatant of brain heart infusion medium圖1 檢測產氣莢膜梭菌C59-2菌株通過腦心浸液培養基培養后毒素的蛋白表達情況Fig.1 Detection of protein expression of toxin in Clostridium perfringens C59-2 strain cultured in brain heart media

2.2 腹腔注射產氣莢膜梭菌培養上清后小鼠觀察結果

產氣莢膜梭菌培養上清對BALB/c小鼠的LD為20 μL(表2)。

表2 產氣莢膜梭菌C型菌(C59-2)培養上清BALB/c小鼠LD100的測定Table 2 Determination of LD100 of culture supernatant of Clostridium perfringens type C (C59-2) in BALB/c mice

接種C59-2培養上清后，觀察發現小鼠短至2～3 h內即出現呼吸窘迫、精神萎靡、被毛雜亂、抱團取暖、食欲消失等癥狀，并在24 h內全部死亡(圖2)。剖檢結果可以看到病變主要在回腸和空腸部分；處理組死亡小鼠腸壁因充滿氣體擴張而菲薄，腸壁黏膜出血呈現血腫狀態(圖3)。

圖2 攻毒后小鼠生活狀態(左為對照組，右為處理組)Fig.2 The represent of mice after challenge(left is the control group, right is the treatment group)

圖3 攻毒后小鼠解剖圖(左為對照組，右為處理組)Fig.3 Anatomy of mice after challenge(left is the control group, right is the treatment group)

2.3 數據質控

將采集好的小鼠空腸組織樣品送北京諾禾致源科技股份有限公司，分別提取總RNA，檢測結果顯示，所有樣本濃度均>702 ng·μL，RIN值>8.7，質量全部合格，可以正常建庫(表3)。通過Illumina 2000測序平臺的nova-seq分別對兩組樣品進行測序，經過濾、整理原始數據后，共獲得273 195 306條高質量數據，共計40.99 Gb堿基，且每個樣品的堿基量均達到6.45以上。各樣品的錯誤率均<0.03，Q20均>96%，Q30均>90%，GC含量均在50%左右，表明測序數據有效，可以用于后續分析。另外，6個樣本與參考基因組的對比率均>92.62%，比對到參考基因組唯一位置，即用于后續定量數據分析的reads數及其百分比為77.09%～88.87%，比對到基因組外顯子區域的reads數及其占clean reads數的比例為94.08%～97.70%，具體內容如表4所示。

表3 總RNA質量檢測Table 3 Examination of total RNA quality

表4 轉錄組測序數據統計分析Table 4 Statistical analysis of transcriptome sequencing data

2.4 差異表達基因分析與驗證

通過方法“1.2.5”分析比較對照組和處理組的基因表達情況，如圖4A火山圖所示，共得到795個差異基因，與對照組相比，處理組中有229個基因表達上調，有566個基因表達下調，有23 669個基因表達無顯著性差異。為了后續進行差異基因的功能富集分析，對所有樣本的基因表達值(FPKM表達矩陣)進行聚類分析，對行(Row)進行均一化處理(Z-score)。如圖4B熱圖所示，表達模式相近的基因被聚集在一起，共有4個不同的功能相關類群，且每組有3個生物學重復樣品間相互關聯。以上結果進一步說明試驗結果準確、可靠，組內不同個體的基因表達譜具有較低的變異。

A.火山圖：每一個點代表一個基因，紅色表示上調表達的基因，綠色表示下調表達的基因，藍色表示非顯著差異表達基因。B.熱圖：每列表示一個樣本，每行表示一個基因；顏色代表該基因在單個樣本中的表達量，紅色代表表達量較高，藍色代表表達量較低；左側為基因聚類的樹狀圖和子聚類的模塊圖A. Volcano map：Each dot represents a single gene. Red dots represent the up-regulated genes；green dots represent the down-regulated genes；Blue dots represent stably expressed genes. B. Heat map：Each column represents a sample and each row represents a gene. The color represents the expression level of the gene in a single sample, with red representing higher expression and blue representing lower expression. On the left is a dendrogram of gene clusters and a block diagram of subclusters圖4 差異表達基因火山圖(A)及熱圖(B)Fig.4 Volcano map (A) and heat map (B) of DEGs

另外，為了驗證篩選后的轉錄組測序數據的準確性，隨機挑選5個上調差異表達基因(4、、、2、4)和5個下調差異表達基因(1、186、、4、9)，進行實時熒光定量PCR試驗。結果如圖5所示，上述所挑選的差異表達基因的q-PCR變化規律與RNA-seq中表達規律一致，進一步表明所分析的數據準確可信。

圖5 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證Fig.5 q-PCR verification of DEGs

2.5 GO注釋分析

GO(Gene Ontology)是描述基因功能的綜合性數據庫，可分為生物過程(biological process)、細胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3個部分。將篩選獲得的差異表達基因通過GO功能富集，以校正值<0.05作為顯著性富集的閾值進行再次篩選，分析GO注釋結果，繪制條形圖如圖6所示。其中，上調的差異表達基因注釋主要涉及生物過程部分，如G蛋白偶聯核苷酸受體活性、G蛋白偶聯嘌呤核苷酸受體活性、嘌呤核苷酸受體活性以及核苷酸受體活性等(圖6A)。而下調的差異表達基因注釋主要涉及分子功能部分，如酶活性、受體活性、轉錄激活因子活性以及MHC Ⅰ類蛋白結合等(圖6B)。

A為上調的差異表達基因注釋，B為下調的差異表達基因注釋。橫坐標為基因數，縱坐標為各注釋內容A is the up-regulated differential expression gene annotation, and B is the down-regulated differential expression gene annotation. The ordinate is the number of genes, and the abscissa is the annotation content圖6 差異表達基因的GO數據庫注釋Fig.6 GO database annotation of DEGs

2.6 KEGG富集分析

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)是整合了基因組、化學和系統功能信息的綜合性數據庫。將篩選獲得的差異表達基因通過KEGG通路富集，以校正值<0.05作為顯著性富集的閾值進行再次篩選，從富集結果中選取最顯著的20個通路，繪制散點圖(圖7)。結果顯示，KEGG通路主要富集在TNF信號通路、IL-17信號通路、p53信號通路、FOXO信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等信號通路。

橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數與差異基因總數的比值，縱坐標為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小The abscissa is the ratio of the number of differential genes annotated to the KEGG pathway to the total number of differential genes, and the ordinate is the KEGG pathway. The size of the dots represents the number of genes annotated on the KEGG pathway, and the colors from red to purple represent the significance of enrichment圖7 差異表達基因的KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEGs

3 討 論

產氣莢膜梭菌作為人畜共患病原菌，引發的疾病具有發病快，病死率高的特點，引起了世界性的廣泛關注，成為嚴重影響公共衛生和社會經濟發展的問題。但是該菌的致病機理尚不清晰，還需進一步研究相關分子機制，為產氣莢膜梭菌病的治療方案提供新的思路。由病原菌產生的毒素(例如產氣莢膜梭菌和艱難梭菌)可以刺激腸黏膜大量分泌黏液，同時小腸絨毛細胞受到毒素的作用會啟動多種死亡機制，細胞損傷時產生的多種炎性細胞因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)等炎癥細胞因子會加劇細胞脫落的情況，致使小腸絨毛表面積減少，黏膜吸收能力降低，造成臨床上的腹瀉癥狀。在此過程中，原本機體內受到嚴格調控的免疫耐受和防御性炎癥反應之間的平衡發生紊亂，導致腸道微生物種群生態進而出現紊亂，腸道固有層通透性發生變化，黏膜免疫系統反應異常，最終發展為炎癥性腸病(IBD)。而本研究中對小鼠進行攻毒的產氣莢膜梭菌培養上清，即含有病原菌的主要毒力因子——單獨或協同作用的多種外毒素。本研究中小鼠腹腔剖檢結果發現，小鼠腸壁因充滿氣體擴張而菲薄，腸壁黏膜出現血腫，呈明顯的炎癥狀態。進一步采集小鼠腸道組織樣品進行轉錄組測序分析，篩選差異表達基因，并對差異基因集進行基因功能富集分析, 進而研究產氣莢膜梭菌引起壞死性腸炎的生物學過程中起關鍵作用的生物通路。

在C型產氣莢膜梭菌分泌的多種毒素中，Beta1毒素對于壞死性腸炎的發病機制至關重要。許多上皮細胞系，包括豬和人腸上皮細胞對Beta1毒素的作用不敏感，而內皮細胞、血小板和不同的白細胞系則對Beta1毒素高度敏感。這表明Beta1毒素的作用可能是細胞類型特異性的，推測可能與細胞類型特異性受體的表達相關。同時也有研究表明，細胞膜上ATP門控的P2X purino receptor 7(P2X7)可能是Beta1毒素的潛在受體，Beta1毒素與靶細胞上的P2X7受體的結合可誘導ATP 從Pannexin 1通道快速釋放。釋放的ATP將進一步刺激Beta1毒素與內皮細胞膜的結合和寡聚體形成，促進毒素的成孔活性。在本研究中，GO注釋的生物學過程中，C59-2培養上清處理組小鼠腸組織中的G蛋白偶聯核苷酸受體活性及G蛋白偶聯嘌呤核苷酸受體活性顯著上調，提示毒素可能通過結合P2Y受體引起炎性反應，破壞腸道屏障，導致腸道損傷。而C型產氣莢膜梭菌的主要致死性毒素即為Alpha及Beta1毒素，作者也利用Beta1毒素單克隆抗體檢測證實了C59-2培養上清中含有大量的Beta1毒素。產氣莢膜梭菌所引起的腸毒血癥也是業界所關注的問題之一，彌散性血管內凝血(DIC)是膿毒癥的常見并發癥，由于伴隨的血栓發炎和微血管通透性變化而嚴重影響患者的預后。P2X7受體通過ERK1/2信號通路介導膿毒癥幼鼠大腦皮質中NLRP3/ Caspase1相關的細胞焦亡，與膿毒癥相關性腦病相關。利用RNAi技術沉默衛星神經膠質細胞的P2X4受體(P2X家族)，可以減輕人類免疫缺陷病毒(HIV)表面毒性顆粒gp120所引起的靶細胞Caspase1活化以及IL-1β、IL-18等炎性因子的釋放。因此推測，針對P2X家族的靶點藥物有望成為治療Beta1毒素所致的相關疾病的治療手段。

在新生兒壞死性小腸結腸炎(一種新生兒炎癥性腸道疾病)的體內模型中發現，TNF-α通過絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)/細胞外調節蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinases2, ERK2)-MAPK3/ERK1途徑誘導自噬，從而抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，進而促進炎癥性腸道疾病的發展。且腸道上皮細胞會由于細胞膜上的Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLR)等模式識別受體因腸道菌群的變化而激活，進而分泌β-防御素。本研究的KEGG通路富集分析結果與其相符，顯示產氣莢膜梭菌培養上清處理組小鼠腸組織中的TNF信號通路、IL-17信號通路、p53信號通路、FOXO信號通路、Toll樣受體信號通路，NF，κB信號通路等炎性相關信號通路顯著富集，且在這些通路中NF-κB抑制劑α(NF-kappa-B inhibitor alpha，Nfkbia)和趨化因子CXC配體2(C-X-C motif chemokine 2，Cxcl2)顯著表達上調。目前，隨著對TNF的深入研究，確定其為炎癥反應的關鍵調節因子。TNF與被稱為TNFR1和TNFR2的兩種受體相互作用，能夠在細胞和組織上差異表達并啟動不同以及相互重疊的信號轉導途徑。這些信號級聯導致一系列的細胞反應，包括細胞存活、分化、增殖、遷移和死亡。血管內皮細胞可通過發生許多促炎變化對TNF作出反應，導致白細胞黏附增加，經內皮遷移和血管滲漏促進血栓形成。并且，TNF在炎癥中的核心作用已通過阻斷其作用的藥劑治療一系列炎性疾病的能力得到證明，包括炎癥性腸病和銀屑病等。另外，IL-17家族能夠與其對應的受體相互作用并激活下游信號通路，如NF-κB以誘導許多促炎介質的分泌，包括IL-6、TNF-α和IL-1β。而NF-κB激活和IL-1β的高表達是細胞焦亡的關鍵特征，提示人們在后續的關于產氣莢膜梭菌毒素致病機理的研究中需要關注細胞焦亡在腸道損傷中的作用。

細胞焦亡在炎性機制相關的宿主抗感染過程中是一把“雙刃劍”：一方面，細胞焦亡可激活細胞內在的死亡機制，釋放炎性因子，清除病原體，防止感染；另一方面，過度的IL-1β和IL-18釋放則可導致炎癥的失控及機體病理狀態的發生。IL-1β在炎性疾病中作用也受到廣泛關注，其病理性的產生可引起許多表現不同的炎癥疾病，甚至可激發致機體休克的細胞因子風暴； 近年的大量的研究表明，IL-1β信號傳導似乎在介導腸道炎癥中發揮著主導作用，腸道生態失調可以通過IL-1β依賴性方式誘導骨髓炎，阻斷IL-1β的產生可改善艱難梭菌和鼠傷寒沙門菌引起的腸炎；產生的IL-1β和IL-18還可以作用于細胞上的IL-1家族受體，進而激活更強的免疫調控以及適應性免疫應答。鑒于這兩種細胞因子都是重要的免疫調節劑，如果不加以控制，它們在不同類型細胞中的高水平表達可能會對機體造成災難性的后果。目前，多項研究認為，抑制細胞焦亡產生的終產物(成熟的IL-1β和IL-18)的過度表達對一些臨床疾病具有治療潛力。例如，Glyburide是一種通過抑制胰腺β細胞中ATP敏感的K通道治療Ⅱ型糖尿病的藥物，還可以通過特異性抑制NLRP3的成熟而抑制IL-1β的產生。Parthenolide是一種天然的植物倍半萜內酯，已被廣泛用作治療各種炎癥性疾病，且副作用極小，可以通過影響NLRP3、NLRP1和NLRC4等炎性小體的組裝而抑制Caspase1的活化。細胞焦亡的誘發因素之一，是細胞內K水平的降低，因此調節K水平也是治療干預的目標。該過程受P2X7的控制，目前已開發出P2X7的小分子抑制劑(AZD9056)并在人體中進行了測試，經治療后的類風濕關節炎患者的炎性癥狀有明顯的臨床改善。因此，在產氣莢膜梭菌引起的慢性腸炎等疾病中是否可以NLRP3炎性小體為靶點進行治療，阻止過度的細胞因子釋放，緩解隨之而來的組織破壞有待進一步的研究。

4 結 論

本研究制備C型產氣莢膜梭菌分泌的外毒素，感染BALB/c小鼠，通過分析小鼠腸道組織轉錄組測序數據，并利用q-PCR 進行了驗證，結果表明,C型產氣莢膜梭菌外泌毒素侵入機體時，通過激活TNF等關鍵炎性信號通路以及NLRP3炎性小體信號通路造成腸道發生炎性損傷甚至壞死，進而引起動物的死亡。本研究結果將為產氣莢膜梭菌病的致病機理研究提供理論基礎，同時為尋找該病的治療靶點提供新的思路。