B亞型禽偏肺病毒的分離鑒定及致病性研究

于蒙蒙，包媛玲，王素艷，辛子琪，劉 鵬，馮笑艷，孟令宅，郭 茹，張艷萍，劉長軍，祁小樂，李俊平，王笑梅，3，高玉龍*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室禽免疫抑制病創新團隊，哈爾濱 150069； 2.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；3.揚州大學 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病協同創新中心，揚州 225009)

禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, aMPV)屬于副黏病毒科，肺病毒亞科，偏肺病毒屬，為單股不分節段的負鏈RNA病毒。根據編碼G蛋白的基因將aMPV分為A、B、C和D4個亞型。aMPV的自然宿主是火雞，其次是雞。aMPV感染火雞可引起火雞鼻氣管炎(turkey rhinotracheitis, TRT)，是除禽流感之外對火雞影響最大的呼吸道疾病。感染蛋雞導致產蛋量下降、軟殼蛋率增高，也是導致肉雞腫頭綜合征(swollen head syndrome, SHS)的主要病原體，對養禽業造成巨大的經濟損失。

aMPV最早于20世紀70年代末在南非發現，隨后相繼出現在歐洲、亞洲、南美等地。血清學調查發現大多數火雞飼養國家除澳大利亞和加拿大外均有該病的存在。1999年，沈瑞忠等首次在國內分離報道aMPV，隨后各地相繼有該病的報道。2009年，郭龍宗和曲立新在山東膠東地區對種雞群進行血清學檢測，發現aMPV的感染是普遍存在的；2012年，贠炳嶺等調查表明黑龍江、吉林、河北、湖北等地區的雞群也普遍感染aMPV，部分雞場的血清陽性率甚至高達100%；2012—2015年，江蘇、遼寧、河南、山東和河北5個省份也存在aMPV的感染，陽性率為50.7%；2016年，本實驗室從遼寧某肉種雞場分離到B亞型aMPV(LN16株)，且證實該分離株對SPF、商品蛋雞、肉雞和黃羽雞均有明顯的致病性；2017年，安徽、河北、北京、上海等地的不同品種(系)雞群中均存在aMPV抗體，且出現臨床癥狀；近幾年來，本課題組發現河北井陘縣和遼寧海城地區的多個蛋雞雞群以及黑龍江、山東等地的多個雞群出現了疑似aMPV感染的癥狀，其aMPV抗體陽性率和抗體滴度均較高。以上數據說明aMPV在我國雞群中已流行甚廣，但由于病毒分離困難，國內關于aMPV分離鑒定報道和致病性研究相對較少。

本研究從疑似aMPV感染發病雞群的鼻甲骨內成功分離到3株病毒，經RT-PCR、病毒分離、基因序列分析、間接免疫熒光試驗(IFA)等試驗鑒定為B亞型aMPV，分別命名為SD2001、SD2002和HLJ2101。致病性研究發現，我國雞群流行的B亞型aMPV對雞有明顯的致病性，這為aMPV的流行病學調查研究、疫苗的研制以及該病的有效防控提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

山東省、福建和黑龍江等地區的養雞場的雞出現疑似aMPV感染的臨床癥狀：甩頭、精神萎靡、嚴重者出現腫頭等。本研究從山東省某蛋雞規?；B殖場的病雞群內采集了35份喉拭子(35/100)、30份鼻甲骨(30/50)及10份肺(10/20)；從福建某肉種雞場的父母代肉雞采集了40份喉拭子(40/100)和10份鼻甲骨(10/50)；黑龍江某肉種雞場的祖代肉雞采集了25份喉拭子(25/100)、10份鼻甲骨(10/50)及10份肺(10/20)，以上雞場均未免疫過aMPV疫苗。將采集的病料冷藏保存，送往實驗室進行病原學檢測和分離。

1.2 細胞、質粒和實驗動物

Vero細胞、aMPV-N基因的陽性質粒PCAGGS-N、aMPV/B陽性血清均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所禽免疫抑制病團隊鑒定、保管和供應；SPF雞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物實驗中心提供。

1.3 常用試劑

RNAiso Plus、pMD18-T載體、rTaq酶、Premix Taq(EX Taq)DNA聚合酶、Prime STAR Max 預混酶和DL2000 Marker、DH5α感受態細胞等均購自大連寶生物工程有限公司；BioRT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒購自博日科技有限公司；核酸膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；FITC標記的兔抗雞IgY熒光二抗購自Sigma試劑公司。

1.4 病料的處理

取適量組織樣品放入1 mL預冷的無菌PBS內，研磨勻漿，喉拭子內加入1 mL PBS漩渦振蕩混勻1 min。將所有樣品利用低溫高速離心機在4 ℃條件下，6 000離心10 min，取上清，經0.45 μm的濾器過濾后，-20 ℃保存備用。

1.5 RT-PCR鑒定

根據GenBank上已發表的LN16毒株序列(MH745147.1)，利用DNAStar里面的Megalign軟件對不同亞型的基因序列進行比較，選擇其保守區域設計aMPV的特異性檢測引物：上游引物aMPVNF：5′-ATGCAAGCTTATGGAGCTGG-3′/下游引物aMPVNR: 5′-ATGCAAGCTTATGGAGCTGG-3′，引物由吉林長春庫美生物有限公司合成。取“1.4”處理好的病料各200 μL，利用Trizol提取總RNA，然后根據BioRT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行反轉錄。

以上述反轉錄cDNA產物為模板，采用aMPVNF/NR進行PCR檢測，以aMPV-基因陽性質粒PCAGGS-N作為陽性對照。反應體系為25 μL：aMPVNF 2 μL，aMPVNR 2 μL，cDNA 2 μL，EX預混酶12.5 μL，RNase Deionized 水6.5 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，若在228 bp處出現條帶判斷為陽性，用于后續的病毒分離。

1.6 病毒分離

取400 μL“1.4”處理好的病料接種于6孔板內單層的Vero細胞，37 ℃、5% CO溫箱內孵育1 h后，將培養液換成含1%青鏈霉素、2%胎牛血清的DMEM細胞維持液。每天觀察Vero細胞的狀態，持續觀察7 d，然后將接毒的細胞反復凍融3次，然后在4 ℃條件下，6 000離心10 min去除細胞碎片，收集上清，盲傳5代后，將仍未出現特征性的細胞病變(CPE)的棄去，出現CPE則進行進一步的鑒定。

1.7 G和F基因測序

根據LN16(MH745147.1)的和基因設計并合成擴增和基因的引物。擴增基因引物序列為aMPV-GF: 5′-ATGGGGTCAGAGCTCTACAT-3′；aMPV-GR: 5′-TTATTGACTAGTACAGCACC-3′。擴增基因引物序列為aMPV-FF:5′-ATGTACCTCAAACTGCTACT-3′；aMPV-FR:5′-TCAACTGATGTAGCCCATGT-3′。以病毒分離陽性樣品的cDNA為模板進行和基因的擴增。反應體系為50 μL：上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，Prime STAR Max預混酶25 μL，加水至50 μL。反應程序：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物中加入1 μL rTaq酶在72 ℃ 10 min加poly A尾巴。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，和基因的預期目的條帶分別為1 263和1 617 bp，然后按照Axygen的膠回收試劑盒說明書對PCR產物純化。

按照pMD18-T載體說明書將膠回收產物與pMD18-T載體分別進行連接，挑取菌落進行PCR篩選陽性單克隆菌。最后選擇3個陽性質粒送吉林庫美生物公司進行測序。利用DNAStar和MEGA7.0軟件進行同源性分析和繪制遺傳演化進化樹。

1.8 IFA檢測

取50 μL“1.6”分離的病毒培養液接種于6孔板內單層的Vero細胞37 ℃、5% CO溫箱內孵育1 h，將培養液換成含1%青鏈霉素，2%血清的DMEM細胞維持液，每天觀察細胞狀態，培養72 h后進行IFA檢測。具體操作：棄去細胞培養液，用預冷的PBST洗3次；然后加入500 μL無水乙醇室溫固定15 min，PBST洗5遍，加入500 μL 100倍稀釋的aMPV陽性血清在37 ℃條件下孵育1 h，PBST洗5遍，再加入500 μL 200倍稀釋的FITC標記兔抗雞IgY的熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBST洗5遍。將處理好的樣品置于熒光倒置顯微鏡下觀察試驗結果。

1.9 RT-qPCR檢測

參考文獻[12]中aMPV/B的RT-qPCR檢測方法，根據LN16的核苷酸序列設計引物和探針，引物aMPV-F:5-AATAGTCCTCAAGCAAGTCCTCAGA-3′/aMPV-R:5′-CTGTTGTAATTTGACCTGTTCTACACT-3′；探針：5′-FAM-CTGGTGTTATCAGCCTTAGGCTTGACGCTTAMRA-3′。反應體系:10×PCR Buffer 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L)和探針各0.7 μL，模板cDNA 2.0 μL，HO 5.9 μL；反應條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 3 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。根據標準質?？截悢?，計算樣品中病毒拷貝數。

1.10 病毒含量(TCID50)測定

用無血清的DMEM在1.5 mL離心管內10倍倍比稀釋病毒，渦旋混勻，每個稀釋度做18個重復，接種于96孔細胞培養板中的Vero細胞，其中，96孔板的第一行(A)和最后一行(H)設為陰性對照孔，100 μL·孔)。將96孔細胞培養板在37 ℃、5% CO細胞培養箱中連續培養7 d，每天觀察病變，統計各稀釋度產生的CPE孔數。根據Reed-Muench方法計算病毒的TCID。

1.11 外源病毒檢測

將分離的病毒各取200 μL按照Axygen的DNA提取試劑盒說明書提取DNA，然后根據文獻進行雞毒支原體(MG)和雞傳染性喉氣管炎(ILTV)的檢測。同時以病毒分離陽性樣品的cDNA為模板，進行新城疫病毒(NDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)的檢測。

1.12 動物感染試驗

將40只3周齡SPF雞隨機分為兩組：感染組和空白組各20只，其中，感染組采用滴鼻點眼的方法進行攻毒，每只接種200 μL, 10TCID·mL的SD2001病毒液，空白組也采用滴鼻點眼的方式接種200 μL無菌的PBS，分開飼養于負壓隔離器內，每天觀察并記錄臨床癥狀。感染后2、3、4、5及6 d采集攻毒組和空白組的鼻裂拭子，進行排毒檢測；于感染后第9天每組隨機抽取3只采集喉頭、氣管和鼻甲骨固定于福爾馬林內，用于組織病理學觀察。

2 結 果

2.1 臨床樣品RT-PCR檢測

以220份樣品的cDNA為模板，利用aMPV的基因的特異性檢測引物aMPV-NF/NR進行RT-PCR擴增。結果顯示，有3份(山東2份，黑龍江1份)鼻甲骨樣品擴增出了228 bp左右的特異性條帶，與預期目的片段大小一致(圖1)。

M. DNA相對分子質量標準(DL2000); 1～3. 3份鼻甲骨樣品；+. 陽性性對照；-. 陰性對照M. DNA marker (DL2000); 1-3. Three samples of nasal turbinate; +. Positive control; -. Negative control圖1 aMPV N基因的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR detection of aMPV N gene

2.2 病毒分離

將RT-PCR檢測陽性的樣品分別接種于Vero細胞，盲傳5代。結果顯示，3份鼻甲骨樣品接種的Vero細胞出現細胞變圓、聚集和融合等明顯的CPE(圖2)，符合aMPV所形成的特征性CPE，初步判斷分離到的病毒為aMPV，同時在分離的病毒內未檢測到引起雞呼吸道癥狀的其他致病性病毒：IBV、NDV、ILTV和MG等(結果沒顯示)，將其命名為SD2001、SD2002和HLJ2101。

SD2001、SD2002和HLJ2101在Vero細胞上形成的細胞變圓、聚集和融合等明顯的CPE(箭頭)Obvious CPE (arrow) such as cell rounding, aggregation and fusion formed by SD2001, SD2002 and HLJ2101 on Vero cells圖2 SD2001、SD2002、HJL2101分離株在Vero細胞上的CPE(標尺=100 μm)Fig.2 CPE of SD2001, SD2002, HJL2101 isolates on Vero cell (bar=100 μm)

2.3 G和F基因序列分析

以SD2001、SD2002和HLJ2101分離株提取的RNA反轉錄產物為模板利用aMPV-GF/GR和aMPV-FF/FR引物分別進行和基因的擴增，測序結果顯示，3個分離株的基因全長1 263 bp，編碼414個氨基酸；基因全長1 617 bp，編碼539個氨基酸。

利用DNA Star中MegAlign軟件對3個分離株的和基因的核苷酸和氨基酸序列相似性進行分析，結果顯示，3個分離株的基因與其他國家B亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為93.4%～96.0%和88.7%～92.8.%，與我國B亞型LN16分離株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為98.4%～98.6%和97.3%～97.8%，與A、C和D亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸的相似性僅為27.1%～61.8%和16.1%～36.7%。3個分離株的基因與B亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為95.6%～98.2%和97.6%～98.9%，與我國B亞型LN16分離株的核苷酸和氨基酸的相似性為99.3%～100.0%和99.4%～100.0%，與A、C和D亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸的相似性為66.8%～74.8%和72.5%～86.5%。遺傳進化分析結果表明，3個分離株的基因(圖3A)和基因(圖3B)均與B亞型aMPV毒株在同一分枝上，表明SD2001、SD2002和HLJ2101分離株均屬于B亞型aMPV。

SD2001、SD2002和HLJ2101分離株用●標記；括號中顯示的是毒株的GenBank登錄號SD2001, SD2002 and HLJ2101 strains were marked with ●; The GenBank accession number of the strain is shown in parentheses圖3 SD2001、SD2002和HLJ2101分離株的G基因(A)和F基因(B)核苷酸序列的遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of G gene (A) and F gene (B) nucleotide sequences of SD2001, SD2002 and HLJ2101 strains

2.4 IFA鑒定

將SD2001、SD2002和HLJ2101分離株接種于6孔板中的Vero細胞，在37 ℃、5% CO溫箱內培養72 h后，利用B亞型特異的陽性血清進行IFA檢測，倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，感染SD2001、SD2002和HLJ2101分離株的Vero細胞呈現特異性的綠色熒光信號，而陰性對照的Vero細胞沒有熒光信號(圖4)，進一步表明SD2001、SD2002和HLJ2101分離株屬于B亞型的aMPV。

圖4 SD2001、SD2002和HLJ2101分離株感染Vero細胞的間接免疫熒光檢測(標尺=125 μm)Fig.4 Indirect immunofluorescence detection of Vero cells infected by SD2001、SD2002 and HLJ2101 strains (bar=125 μm)

2.5 致病性試驗

和基因分析表明，3個分離株的同源性較高，所以選擇病毒毒價為10TCID·mL的SD2001分離株感染3周齡的SPF雞，感染組SPF雞在感染后第3～6天出現精神萎靡、流鼻涕、鼻痂和甩頭等癥狀(圖5)，第5天癥狀最明顯，該組的發病率為90%，空白組SPF雞未見明顯的癥狀。鼻裂拭子的排毒檢測結果顯示，攻毒后的2～6 d雞出現排毒，第4天的排毒率達到100%，且病毒的平均拷貝數達到峰值，為1 472 406拷貝·200 μL(圖6)。病理組織學結果顯示，感染病毒后9 d，雞的鼻甲骨黏膜固有層淋巴組織增生，個別黏液腺萎縮，腺上皮細胞變性，少量炎性細胞浸潤(圖7A)；氣管的黏膜上皮細胞少量變性(圖7B)；肺輕度淤血(圖7C)。空白對照組雞則沒有任何臨床癥狀和組織病理損傷。以上結果表明，SD2001分離株對SPF雞有明顯的致病性。

A.鼻痂; B.膿鼻涕A. Nasal scabs; B. Purulent snot圖5 SPF雞感染SD2001分離株后的臨床癥狀Fig.5 Clinical symptoms of SPF chickens infected with SD2001 strain

圖6 SPF雞感染SD2001分離株后排毒情況Fig.6 Viral shedding of SPF chickens infected with SD2001 strain

A. 雞的鼻甲骨出現腺體萎縮，炎性細胞浸潤(標尺=100 μm)；B. 雞的氣管出現黏膜上皮細胞少量變性(標尺=50 μm)；C. 雞的肺出現輕度淤血(標尺=100 μm)A. Gland atrophy and inflammatory cell infiltration appeared in the turbinate bone of chickens 9 days after infection (100 μm); B. A small amount of degeneration of mucosal epithelial cells appeared in the trachea of chickens 9 days after infection (50 μm)；C. Mild congestion appeared in the lungs of chickens 9 days after infection (100 μm)圖7 SPF雞感染SD2001毒株9 d的鼻甲骨、氣管和肺的HE染色Fig.7 HE staining of nasal turbinate, trachea and lung of SD2001 infected SPF chickens 9 days after infection

3 討 論

1999年，我國雞群首次檢測到aMPV，隨后國內許多研究人員對aMPV的流行情況展開了調查，血清學結果表明我國家禽養殖場普遍存在aMPV的感染，有些地區的雞群血清陽性率高達100%。aMPV感染蛋雞導致產蛋率和孵化率下降，產軟殼蛋和薄殼蛋率增高；感染肉雞導致腫頭綜合征，同時也影響肉質、增重比及飼料轉化率。若僅有aMPV感染時，雞的恢復速度很快，但繼發其他細菌或病毒時發病率高達100%，成年雞的死亡率為0.5%，幼齡雞的死亡率可高達80%。

近些年，在河北、山東、黑龍江、福建等地的蛋雞和肉雞養殖場中常出現雞群精神沉郁、流淚、流鼻涕、眼瞼和頭部腫脹等癥狀，死淘率增加，產蛋率明顯下降，有的雞場下降達30%以上，經濟損失嚴重。本研究從這些雞群采集發病雞的喉拭子，鼻甲骨和肺組織等病料，進行了病毒分離鑒定，從蛋雞中分離到2株B亞型aMPV(SD2001和SD2002)，從肉雞中分離到1株B亞型aMPV(HLJ2101)。盡管大量的研究數據表明，我國蛋雞存在aMPV的感染，但是由于病毒分離困難，一直沒有蛋雞源的分離株的報道，所以SD2001和SD2002的成功分離是我國內首次從蛋雞上分離到B亞型的aMPV，這為蛋雞群開展aMPV的流行病調查、遺傳演化分析和防控提供了參考。

G和F蛋白是aMPV的主要抗原結構蛋白和保護性抗原，根據基因不同可將aMPV分為A、B、C和D 4個亞型。F蛋白決定aMPV的宿主范圍，介導病毒囊膜與細胞膜相互融合，是病毒感染最關鍵的一步。本研究分析了3個分離株與其他B亞型aMPV毒株的遺傳演化關系，和基因同源性分析結果顯示，3個分離株與其他國家的不同宿主(火雞和雞)來源的B亞型aMPV的基因的核苷酸相似性為93.4%～96.0%，基因的核苷酸相似性為95.6%～98.2%，相對保守，這與之前的報道相似；3個分離株的和基因與我國2016年遼寧某肉種雞場分離的B亞型aMPV(LN16株)的核苷酸的相似性更高，均在98.4%以上，高度保守，且遺傳演化樹顯示，我國毒株已經形成獨立的分支，這證實我國流行的B亞型aMPV的主要保護性抗原非常保守，為aMPV疫苗的研制提供了理論依據。

SPF雞感染肉雞源的分離株和肉雞感染火雞源的分離株后主要出現精神沉郁、流鼻涕和咳嗽等癥狀和上呼吸道出現炎性細胞浸潤的現象。在本研究中，SPF雞感染蛋雞SD2001分離株后的臨床癥狀和病理損傷等指標與感染肉雞源或火雞源的指標無明顯的差異，這說明宿主來源對B亞型aMPV的致病性影響不大。

4 結 論

本研究從疑似aMPV感染的雞群采集病料，首先利用aMPV特異性的RT-PCR方法對臨床樣品進行初步檢測，再將RT-PCR檢測陽性的樣品利用Vero細胞進行病毒分離，然后通過CPE、IFA和基因序列測定分析等方法證實，本研究成功分離到3株B亞型aMPV(SD2001、SD2002和HLJ2101)。SD2001分離株感染SPF雞后導致90%的雞出現臨床癥狀，第4天排毒率達100%，引起鼻甲骨、氣管和肺等組織出現病理性損傷，對SPF雞有明顯的致病性。