ART3抑制劑3-MBA對小鼠睪丸生精功能的影響

段晨瑩，李 欣，趙羚均，許師源，原開敏，董智豪,3，郭冠華,4，王 棟*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471203； 4.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801)

睪丸和附睪是哺乳動物精子發(fā)生和成熟的主要場所，精子發(fā)生需經(jīng)過精原干細胞增殖、減數(shù)分裂和精子變形等過程，變形后的精子離開睪丸進入附睪后，進一步發(fā)育成熟并逐漸獲得運動能力。該過程正常、高效、有序運行，是確保精子功能正常的必要條件，需要精細而復雜的表達調(diào)控，期間的基因表達也就成為精子發(fā)生機制研究的重要內(nèi)容，為此，很多研究通過精子基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組挖掘雄性生育力的分子靶標。據(jù)統(tǒng)計，1頭種公牛一次射精可產(chǎn)生數(shù)十億精子，但精子功能基因組缺陷導致種公牛生精功能紊亂，生育能力變差，增加不孕風險，降低生產(chǎn)效率。為深入探究精子發(fā)生機制，深度挖掘種公畜的繁殖潛能，本團隊前期對牛和小鼠精子變形期間差異基因進行富集分析和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，發(fā)現(xiàn)了差異表達基因ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶3(ADP-ribosyl transferase 3，3)，該基因?qū)幼冃伟l(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

ART3是單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(mono(ADP-ribosyl) transferases，ARTs)家族成員，該家族以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)為底物，將ADP-核糖基團轉(zhuǎn)移至目標蛋白的氨基酸殘基上，完成對目標蛋白的ADP-核糖基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，參與ADP-核糖基作用的主要氨基酸殘基為精氨酸和半胱氨酸，然而，F(xiàn)riedrich等通過ART3蛋白結(jié)構(gòu)分析和體外轉(zhuǎn)染ART3酶活試驗，發(fā)現(xiàn)ART3不具有ARTs家族特有的精氨酸特異性酶活性，也不具有半胱氨酸特異性酶活性，推測體外條件下ART3可能完全喪失了ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，但是，該研究沒有深入挖掘該基因的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，在人和牛精母細胞上可檢測到ART3蛋白，也可在小鼠和牛精子變形期間檢測到其表達，并且檢測到3基因與人非阻塞性無精癥(non-obstructive azoospermia，NOA)顯著相關(guān)，是導致男性不育的重要因素。但是，目前尚未見到關(guān)于3基因參與調(diào)控精子發(fā)生機制的報道，也未見到該基因缺陷導致NOA和男性不育機制的報道，ART3的確切生物學功能還需深入研究。

為此，本試驗以小鼠為模式動物，通過睪丸注射不同劑量ART3抑制劑3-甲氧基苯甲酰胺(3-methoxybenzamide，3-MBA)，檢測小鼠睪丸生理指標，分析附睪尾精子的動力學和形態(tài)學特征，探究ART3調(diào)控小鼠精子發(fā)生機制，為提高雄性動物繁殖性能提供理論依據(jù)，也為治療雄性不育提供可治療的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗動物為6～8周齡健康且繁殖性能正常的雄性ICR小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。整個試驗過程中，試驗動物在20～25 ℃、自然光照條件下飼養(yǎng)，自由采食、飲水，每周更換1次墊料。試驗鼠及試驗方法均符合中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物實驗福利倫理審查(No：IAS2019-13)要求。

1.2 主要試劑及藥品配制

3-MBA、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；無水乙醇、75%醫(yī)用酒精和二甲苯購自北京化學試劑公司；石蠟購自上海華靈康復器械廠；多聚甲醛購自天津市光復精細化工研究所；生理鹽水購自北京萃鋒科技有限公司；蘇木素、蘇木素分化液、蘇木素返藍液、伊紅購自武漢賽維爾生物有限公司。

3-MBA溶液配制：參考Shi和Lodhi等的方法，用DMSO將3-MBA粉末配置為濃度為0.302、0.906和1.510 mg·mL的溶液，配置方法如下：電子天平稱取0.302、0.906和1.510 mg的3-MBA粉末，分別溶解在1 mL DMSO中。

1.3 試驗鼠注射ART3抑制劑

隨機選取66只雄性小鼠，其中63只分為3組，每組21只，分別注射濃度為0.302、0.906和1.510 mg·mL的3-MBA，其余3只為對照組，注射DMSO溶液。在注射3-MBA前，以60 mg·kg體重劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉，待小鼠完全處于麻醉狀態(tài)后使其保持仰臥姿勢，將睪丸從腹腔輕輕揉入陰囊后，用75%醫(yī)用酒精對陰囊部位消毒，左手食指與拇指固定單側(cè)睪丸，右手持連接1 mL注射器的無菌靜脈輸液針(內(nèi)含3-MBA注射液)，根據(jù)睪丸表面血管分布情況，避開睪丸白膜上的血管直接穿透陰囊進入睪丸，用力推注射器將3-MBA注射液緩慢注入睪丸，根據(jù)小鼠體重決定注射劑量，計算方法為3-MBA注射液體積等于小鼠體重(V=M，V為注射體積，單位μL；M為小鼠體重，單位g)。對側(cè)睪丸同樣處理后，處理鼠單籠飼養(yǎng)。對照組雄性ICR小鼠雙側(cè)睪丸分別注射與處理組等體積的DMSO溶液。

1.4 樣本采集

于注射3-MBA溶液3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d后，脫頸處死試驗鼠，用剪刀打開小鼠腹腔，從陰囊中取出小鼠雙側(cè)睪丸和附睪，將睪丸置于含4%多聚甲醛溶液的1.5 mL離心管中固定24～48 h；附睪置于含1 mL生理鹽水的1.5 mL離心管中，并用眼科剪剪碎附睪尾組織。然后，將離心管置于37 ℃水浴鍋恒溫保存20 min，以使精子從附睪尾充分浮游至上清液。

1.5 睪丸組織HE染色

1.5.1 制作睪丸組織石蠟切片 將固定好的小鼠睪丸組織依次置于50%乙醇(1.5 h)、75%乙醇(1.5 h)、85%乙醇(1 h)、95%乙醇(1 h)、無水乙醇Ⅰ(30 min)、無水乙醇Ⅱ(30 min)的梯度酒精中脫水，然后依次采用二甲苯∶無水乙醇=1∶1的混合液(1 h)、二甲苯Ⅰ(1 h)、二甲苯Ⅱ(1 h)透明后，于溶解好的石蠟中浸泡3 h。包埋好后，經(jīng)石蠟切片機切割成5 μm厚睪丸切片，將切片置于40 ℃左右溫水中展片，再用黏附載玻片貼片后置于55 ℃恒溫干燥箱中烤片5 h，使組織切片完全貼合在載玻片上。

1.5.2 HE染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ(30 min)、二甲苯Ⅱ(30 min)脫蠟后，依次置于二甲苯∶無水乙醇=1∶1的混合液、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各復水5 min，再用蒸餾水洗5 min；然后用蘇木素染色3 min、蒸餾水洗3 min、分化液分化10 s、蒸餾水洗2 min、返藍液返藍20 s、蒸餾水洗2 min、伊紅染色8 min、蒸餾水洗5 min，睪丸石蠟切片經(jīng)H&E染色后，依次經(jīng)85%乙醇(1 min)、95%乙醇(1 min)、無水乙醇Ⅰ(5 min)、無水乙醇Ⅱ(5 min)的梯度酒精脫水，再經(jīng)二甲苯Ⅰ(5 min)、二甲苯Ⅱ(5 min)透明；最后，用中性樹脂封片，置于正置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 3-MBA處理鼠附睪尾精子的生理指標檢測

1.6.1 附睪尾精子的精液質(zhì)量分析 用移液槍從附睪上清液中吸取10份精子懸液(每份5～10 μL)分別滴至37 ℃預(yù)熱的Leja板中，靜置2 min，用HamiltonThorne IVOS II全自動精子分析儀分別在200×和400×鏡下進行鏡檢。鏡檢時，隨機選取Leja板中的8個不同區(qū)域進行分析。鏡檢后統(tǒng)計每份精液的濃度、前向運動精子百分率和活力，并計算出均值。

1.6.2 精子畸形率分析 用移液槍從附睪上清液中吸取10 μL精子懸液滴至黏附載玻片上，并用槍頭涂抹均勻，涂片后用酒精擦拭過的蓋玻片封片，并在室溫下風干。然后，將制作好的切片置于100×油鏡下檢查精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整和畸形的精子，畸形精子主要類別有：胖頭精子、圓頭精子、雙頭精子、無頭精子和尾部角彎折、卷曲、斷裂、雙尾精子等。每只小鼠檢查1 000個精子，畸形率(%)=((1 000-正常精子)/1 000)×100。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，采用單因素ANOVA法進行方差分析，采用檢驗進行組間差異顯著性檢驗，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量3-MBA對小鼠睪丸生精細胞的影響

圖1顯示，小鼠睪丸注射不同劑量3-MBA后，0.302、0.906和1.510 mg·mL劑量組分別在注射后12 h、6 h和3 h曲細精管內(nèi)觀察到空泡，并隨時間推移空泡逐漸增多增大，同時觀察到曲細精管內(nèi)生精細胞逐漸減少，排布變得散亂不規(guī)則。0.906 和1.510 mg·mL劑量組于注射后5 d空泡面積達到最大，且曲細精管出現(xiàn)空管現(xiàn)象，而0.302 mg·mL劑量組則于注射后3 d空泡面積達到最大，與注射后3 d相比，注射后5 d空泡面積減少，生精細胞數(shù)量增加，有恢復趨勢。

A.對照組小鼠睪丸切片;B1-B7分別為注射0.302 mg·mL-1 3-MBA后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d和5 d切片；C1-C7分別為注射0.906 mg·mL-1 3-MBA后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d和5 d切片；D1-D7分別為注射1.510 mg·mL-1 3-MBA后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d和5 d切片A. Testicular section of control mice; B1-B7 are sections at 3 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d and 5 d after 0.302 mg·mL-1 3-MBA injection, respectively; C1-C7 are sections at 3 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d and 5 d after 0.906 mg·mL-1 3-MBA injection, respectively; D1-D7 are sections at 3 h, 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d and 5 d after 1.510 mg·mL-1 3-MBA injection, respectively 圖1 不同劑量3-MBA處理后小鼠睪丸切片HE染色結(jié)果(40×)Fig.1 HE staining results of testicular section of mice treated with different doses of 3-MBA(40×)

2.2 注射不同劑量3-MBA后附睪尾精子動力學分析

2.2.1 不同劑量3-MBA對精子密度的影響 表1顯示，小鼠睪丸注射不同劑量3-MBA后，與對照組相比，0.302 mg·mL劑量組無顯著差異(>0.05)，而0.906和1.510 mg·mL劑量組附睪尾精子密度從注射后3 d開始極顯著降低(<0.01)，且呈劑量依賴性降低。

表1 注射不同劑量3-MBA后附睪尾的精子密度Table 1 The density of sperms in caudal epididymis after injection of different doses of 3-MBA 106·mL-1

2.2.2 不同劑量3-MBA對精子活力的影響 表2顯示，小鼠睪丸注射不同劑量3-MBA后，與對照組相比，3個劑量組于注射后3、6和12 h附睪尾精子活力均無顯著差異(>0.05)，1.510 mg·mL劑量組從注射后1 d開始顯著降低(<0.05)，注射后2 d達到極顯著水平(<0.01)。0.906 mg·mL劑量組從注射后2 d開始精子活力極顯著降低(<0.01)，且隨時間推移進一步降低，而0.302 mg·mL劑量組精子活力于注射后5 d后才開始顯著降低(<0.05)。

表2 注射不同劑量3-MBA后附睪尾精子活力Table 2 The motility of sperm in caudal epididymis after injection of different doses of 3-MBA %

2.2.3 不同劑量3-MBA對精子前向運動比例的影響 表3顯示，小鼠睪丸注射不同劑量3-MBA后，與對照組相比，3個劑量組于注射后3、6和12 h附睪尾前向運動精子比例均無顯著差異(>0.05)，1.510 mg·mL劑量組于注射后1 d極顯著降低(<0.01)，0.906 mg·mL劑量組于注射后2 d開始顯著降低(<0.05)，第3天達到極顯著水平(<0.01)，且隨時間推移進一步降低，而0.302 mg·mL劑量組于注射后3 d精子前向運動比例才開始極顯著降低(<0.01)。

表3 注射不同劑量3-MBA后附睪尾精子前向運動比率Table 3 The progressive of sperms in caudal epididymis after injection of different doses of 3-MBA %

2.3 不同劑量3-MBA對附睪尾精子形態(tài)的影響

表4顯示，小鼠睪丸注射不同劑量3-MBA后，與對照組相比，3個劑量組于注射后3 h、6 h、12 h和1 d附睪尾精子畸形率均無顯著差異(>0.05)，1.510和0.906 mg·mL劑量組均從注射后2 d開始精子畸形率顯著增加(<0.05)，第3天達到極顯著水平(<0.01)，而0.302 mg·mL劑量組則從注射后3 d才觀察到精子畸形率極顯著增加(<0.01)。與對照組小鼠相比，抑制ART3后，小鼠精子頭部與頸部連接處斷裂(圖2C)，精子尾部出現(xiàn)斷裂(圖2B)、彎折(圖2D～F)和卷曲(圖2G～H)等異常形態(tài)。

表4 注射不同劑量3-MBA后附睪尾精子畸形率Table 4 The malformation rate of sperms in caudal epididymis after injection of different doses of 3-MBA %

A.形態(tài)正常的精子。B～H.異常形態(tài)精子(紅色箭頭指向精子畸形處)：B.精子尾部斷裂；C.頭部和頸部彎折；D～E.精子尾部彎折；F精子尾部成角彎折；G～H.精子尾部卷曲A. The normal morphology sperms. B-H. The abnormal morphology sperms (the red arrows point to the site of the sperm deformity): B. Break of the sperm tail; C. Bent of the sperm head and tail; D-E. Bent of the sperm tail; F. Angular bending of the sperm tail; G-H. Curl of the sperm tail圖2 3-MBA處理后附睪尾精子畸形形態(tài)圖片(100×)Fig.2 Image of abnormal morphology sperms in caudal epididymis after 3-MBA treatment(100×)

3 討 論

ART3參與細胞代謝的多種途徑，對腫瘤細胞增殖、分化、凋亡均具有重要意義，但ART3調(diào)控精子發(fā)生過程中細胞增殖、分化的研究還未見報道。研究表明，人和牛精母細胞均檢測到ART3表達，推測其可能為信號傳導重要分子節(jié)點，可確保精母細胞成熟和分裂有序發(fā)生，促進精母細胞向單倍體精細胞發(fā)育。本研究通過在小鼠睪丸注射3-MBA抑制ART3后，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸曲細精管內(nèi)生精細胞明顯減少，附睪尾精子濃度在注射3-MBA 后不同處理組均逐漸降低，到5 d后約降低0.358×10·mL～1.528×10·mL，降低的顯著程度因抑制劑用量和處理時間而異。結(jié)果表明，抑制ART3導致小鼠睪丸精子發(fā)生過程受阻，降低了生精數(shù)量，損害了雄性生育力。研究發(fā)現(xiàn)，精子發(fā)生和腫瘤發(fā)生具有相似性，目前，已發(fā)現(xiàn)28B、2、等是在睪丸生殖細胞和癌癥細胞特異性表達的腫瘤-睪丸(cancer-testis，CT)基因。研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancers，TNBCs)是基因顯著表達的癌癥之一，TNBCs細胞過表達3研究發(fā)現(xiàn)，過表達使細胞增殖更快，凋亡率更低，并發(fā)現(xiàn)ART3通過誘導Akt和ERK磷酸化促進了TNBC細胞增殖并抑制其凋亡。因此，推測3基因可能也像上述基因一樣，是一種新型基因，其在睪丸生殖細胞和TNBCs細胞中的表達模式可能具有一定相似性。未來的研究將繼續(xù)通過在小鼠睪丸抑制ART3，探討ART3是否通過誘導Akt和ERK磷酸化，進而調(diào)控生精細胞增殖分化，以深入闡明ART3在小鼠精子發(fā)生過程中的分子機制。

精子發(fā)生是以支持細胞(sertoli cells，SCs)與生殖細胞相互協(xié)調(diào)為前提的，SCs與生殖細胞相互作用，為精子發(fā)生提供形態(tài)學和營養(yǎng)支持，SCs還通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌釋放各種細胞因子，以維持精子發(fā)生所需的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，確保精子發(fā)生正常高效。一旦SCs功能障礙，將直接導致精子發(fā)生失敗。據(jù)報道，無精子癥患者中支持細胞綜合征(sertoli cell-only syndrome，SCOS)患病率高達26.3%～57.8%。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制3后小鼠睪丸曲細精管內(nèi)出現(xiàn)空泡化，且隨劑量增加和時間的推移，空泡面積也隨之增大，生精細胞排布紊亂。作為一種GPI錨定膜蛋白，ART3可能與SCs產(chǎn)生的各種分泌因子及細胞連接蛋白相互作用，參與并維持了SCs和生殖細胞之間的相互支撐和相互調(diào)節(jié)關(guān)系。抑制3后，可能導致SCs和生精細胞間的連接變得松散，SCs對生精細胞的支撐、營養(yǎng)、調(diào)控作用受損，使精子發(fā)生受阻，影響了精子發(fā)生的進程，并導致精子發(fā)生不完全不充分。

精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性可直接影響精子成熟、活力、獲能等，是動物成功受精的先決條件，是提升家畜精液品質(zhì)需要研究和解決的重要瓶頸之一。本研究中，注射3-MBA后小鼠精子活力和前向運動精子比例這兩個運動參數(shù)均逐漸降低，雖然因注射劑量不同下降程度有所差異，但都逐漸達到了顯著水平，尤其是注射5 d后，精子活力顯著降低了5.93%～26.33%；前向運動精子減少了7.39%～22.68%。結(jié)果表明，注射3-MBA抑制了ART3蛋白的生理功能，可能損害了睪丸精子結(jié)構(gòu)的完整性，進而影響到精子活力和前向運動等功能。已有研究表明，附睪尾精子活力降低是雄性生育能力下降的關(guān)鍵因素。另外，精子尾部結(jié)構(gòu)的完整性和功能性是精子活力的重要影響因素，也是精子能夠成功抵達受精地點，確保精卵結(jié)合和融合的前提條件，若精子尾部形成相關(guān)基因表達缺陷或蛋白結(jié)構(gòu)和功能缺陷，就可能導致少精子癥和畸形精子癥，最終導致受精失敗或生育能力喪失。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，ART3定位于牛和小鼠圓形、長形精細胞，且呈趨向于精子尾部形成方向的極性分布特點，ART3還定位于牛和小鼠附睪尾精子的頭部以及尾部靠近頭部部分，推測ART3可能與精子頭和尾部形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸注射3-MBA后，小鼠精子畸形率逐漸增加，5 d后達到顯著水平，比注射前增加約10.2%～26.9%，精子尾部主要表現(xiàn)為斷裂、彎折和卷曲等，頭頸出現(xiàn)對折，說明ART3與精子尾部、頸部形成有關(guān)，并通過影響精子形態(tài)結(jié)構(gòu)，進一步影響了精子的活力、精卵結(jié)合等功能。

綜上所述，本研究推測，精子發(fā)生是在SCs構(gòu)成的穩(wěn)態(tài)微環(huán)境下有序進行的，ART3作為一個膜錨定蛋白，可能在維持SCs與生精細胞的關(guān)系中發(fā)揮了重要作用，也可能促進了精子發(fā)生過程中系列生精細胞的有序遷移，并且，ART3還可能促進了曲細精管中進行性變化的系列生精細胞的結(jié)構(gòu)完善和功能發(fā)揮。總而言之，該基因的正常表達是精子發(fā)生正常有序進行的前提基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過抑制ART3導致附睪尾精子尾部形成發(fā)生缺陷，精子畸形率增加，結(jié)構(gòu)異常，進一步影響了精子運動能力、活力等功能，說明ART3通過參與調(diào)控精子發(fā)生影響精子的結(jié)構(gòu)和功能，降低精子數(shù)量和質(zhì)量，并導致精子發(fā)生紊亂。然而其調(diào)控精子發(fā)生的詳細機制還需進一步研究確認。相關(guān)研究將對提高動物精液品質(zhì)具有重要意義，也可為治療雄性不育提供新的靶向基因。