miR-138靶向PGC-1α調控牦牛肌內前體脂肪細胞增殖及分化

冉宏標，王 會 *，柴志欣，王嘉博，張 明，蔡 欣，鐘金城*

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省/教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛()是我國青藏高原地區重要的牛種，具備抗逆性強、耐低氧和高壓、抗強紫外線特點等。牦牛肉極低的肌內脂肪含量嚴重影響牦牛肉口感、嫩度、肉色及風味，制約了牦牛肉產業的發展。肌內脂肪沉積的影響因素有品種、年齡、營養、管理等，研究表明其遺傳力為0.36～0.54，屬于中高遺傳力性狀；且營養與管理等因素也是通過調控基因表達及蛋白修飾等方式影響肌內脂肪含量。因此，闡明牦牛肌內脂肪沉積的調控機制對于牦牛優良品種選育和牦牛肉品質改善及牦牛產業健康發展具有重要的社會經濟意義。

miR-138作為一種腫瘤抑制因子，在疾病的發生與干預過程中得到了廣泛研究。研究表明，miR-138表達水平在肥胖患者結腸和血清中都呈顯著下調，對肥胖及正常孕婦羊膜間充質干細胞進行測序分析發現，miR-138-5p在肥胖孕婦羊膜間充質干細胞中的表達顯著高于正常孕婦，通過生物信息學分析發現，miR-138靶基因的KEGG pathway富集于脂肪細胞分化、脂肪沉積和脂肪代謝等通路。miR-138在人脂肪間充質干細胞(hAD-MSCs)成脂分化過程中被顯著下調，當miR-138過表達時可靶向負調控E1A樣分化抑制因子1(-1)的表達，從而抑制hAD-MSCs成脂分化，減少脂滴沉積。這些研究表明，miR-138在動物脂肪生成過程中具有重要的調控作用。且在黃牛上的研究結果表明，不同品種間肌內脂肪差異表達基因也存在較大差異，提示不同品種對肌內脂肪代謝調控存在特異性。因此，研究miR-138對牦牛肌內前體脂肪細胞脂質沉積的影響對揭示牦牛肉低肌內脂肪含量形成的機制具有重要意義。

本研究旨在利用過表達和干擾技術探究miR-138對牦牛肌內前體脂肪細胞增殖、分化及脂質沉積的影響；利用生物信息學分析預測miR-138在牦牛脂肪生成過程中的潛在靶基因，初步篩選miR-138在脂質沉積中的下游調控靶基因并進行驗證，為闡明miR-138在牦牛肌內脂肪沉積過程中的遺傳調控機制、構建相關的調控網絡奠定基礎和提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12(1∶1)基礎培養基購自Hyclone公司；HBSS緩沖液購自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素(雙抗)購自博士德(北京)公司；I型膠原酶、II型膠原酶、油紅O染料和油酸試劑均購自Sigma公司；4%多聚甲醛購自Biosharp生物科技公司；DEPC水、PBS溶液、胎牛血清和Lipofectamine3000購自賽默飛(Thermo Fisher Scientific)公司；反轉錄及定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；PI試劑購自索萊寶科技公司；CCK-8試劑盒和TRIzol試劑購自天根生物；miR-138 mimics、inhibitor及引物均由擎科生物公司合成。

1.2 主要儀器

倒置光學顯微鏡購自蔡司(Zeiss)公司；水浴鍋(HWS-240)；多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific Varioskan LUX)；熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific QuantStudio 3.0)；流式細胞儀(SYSMEX CyFlow Cube 8)。

1.3 試劑配制

稱取0.1 g油紅O染色液溶于100 mL異丙醇制成油紅O染色原液，于4 ℃冰箱避光保存，染色前按(原液)∶(滅菌水)=3∶2配制并過濾；稱取0.1 g Ⅰ型膠原酶和0.1 g Ⅱ型膠原酶分別溶于100 mL HBSS緩沖溶液，過0.22 μm除菌過濾器后，按(0.1% Ⅰ型膠原酶)∶(0.1% Ⅱ型膠原酶)=2∶1比例配制組織消化液；完全培養基(10%血清+1% 雙抗的DMEM/F12基礎培養基)；誘導分化培養基(10% 血清+1% 雙抗+50 μmol·L油酸的DMEM/F12基礎培養基)。

1.4 試驗方法

1.4.1 牦牛前體脂肪細胞分離 于都江堰(成都)輝潤屠宰場采集新鮮屠宰的，年齡約2歲的健康麥洼牦牛的背最長肌，使用含3%雙抗冰PBS緩沖液清洗樣本數次至無血漬，轉移至含3%雙抗基礎培養基中于冰上帶回實驗室，使用含2%雙抗的PBS緩沖液清洗采回的組織樣本，在PBS濕潤環境下使用無菌剪刀剔除肉眼可見筋膜、血管，將剩余組織剪碎至1 mm大小肉糜；按(組織)∶(消化液)約為2∶1加入消化液，于37 ℃水浴消化4 h，期間每5 min混勻1次；消化結束后依次過70 μm和40 μm細胞篩，取濾液2 000 r·min離心5 min，使用無血清DMEM/F12基礎培養基重懸沉淀，并依次1 800、1 500 r·min梯度離心5 min，沉淀加入完全培養基重懸后轉移至培養皿，37 ℃恒溫培養箱(50 mL·LCO)貼壁1.5 h后更換新鮮培養基，之后每2 d更換培養基培養至傳代及凍存。

1.4.2 Mimics、inhibitor設計合成及轉染濃度篩選 參照bta-miR-138成熟序列(MIMAT 0003813)設計mimics和inhibitor，交由擎科(北京)生物公司合成。設置30、50、100和150 nmol·L共4個濃度，待肌內前體脂肪細胞培養至第三代(F3)開始轉染。細胞按參考接種量接種至12孔板，設置mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC 組，每組3個重復，待細胞密度達80%～90%時參照Lipofectamine3000說明書進行mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC轉染。37 ℃恒溫培養箱轉染6 h后更換誘導培養基誘導分化48 h，收集細胞并提取總RNA用于測定miR-138表達情況，篩選轉染效率最優濃度用于后續試驗。

1.4.3 MiR-138靶基因預測及功能分析 利用在線預測網站TargetScan7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRDB(http://www.mirdb.org/)對bta-miR-138靶基因進行預測，并對預測結果取交集；利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對預測靶基因進行KEGG和GO富集分析，篩選脂質代謝過程相關的潛在靶基因。

1.4.4 總RNA提取及cDNA合成 按TRIzol法提取細胞總RNA，具體方法參照說明書。miR-138 定量用cDNA合成參照PrimerScriptRT reagent kit with gDNA Eraser說明書(TaKaRa RR047A)進行，miR-138反轉錄引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT-TGAGCGGCCTGA-3′；內參6引物參照前人研究。

1.4.5 實時熒光定量(qPCR) 使用TB GreenPremix EX TaqII試劑盒(TaKaRa RR820A)進行qPCR試驗，定量引物序列信息見表1。反應體系為95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃(引物退火溫度詳見表1)退火30 s，共40個循環。分別以6和作為miR-138及目的mRNA內參，采用2法計算相對表達量。

表1 qPCR引物信息Table 1 qPCR primer information

1.4.6 油紅O染色 細胞誘導分化后進行油紅O染色測定細胞脂滴積累情況：吸去培養基后使用PBS輕柔沖洗細胞，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫固定1 h；使用無菌ddHO輕柔沖洗細胞3次，加入油紅O染液室溫染色30 min；無菌ddHO沖洗細胞5次，每次1 min，至無明顯紅色背景，鏡檢拍照。轉染后細胞參照正常細胞誘導分化時間點和染色步驟進行油紅O染色，用于檢測miR-138對細胞脂質沉積的影響。鏡檢完成后每孔加入200 μL異丙醇萃取細胞中油紅O染色液，于510 nm波長下測定萃取液OD值。

1.4.7 細胞增殖活性測定 轉染后細胞接種至96孔板，加入新鮮完全培養基培養分別在12、24、36和48 h后進行CCK-8測定：向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養箱孵育1 h，恢復室溫后于480 nm波長下測定OD值。劃痕試驗待細胞密度達80%～90%時進行：使用無菌槍頭沿貼壁細胞中軸勻速劃出劃痕，分別培養12、24和36 h后觀察細胞增殖情況并拍照。

1.4.8 流式細胞周期檢測 細胞培養至12孔板，待細胞密度達80%～90%時進行轉染；48 h后使用胰蛋白酶消化收集細胞，PBS清洗細胞沉淀并加入70%乙醇于4 ℃過夜固定細胞；加入濃度為100 μg·mL的PI染料室溫避光孵育30 min后上機檢測。

1.4.9 雙熒光素酶報告試驗 根據TargetScan7.2數據庫預測結合位點，參考-1序列設計3′ UTR擴增引物(F：5′-AACCATTCTTTTCCTTTCTC-3′，R：5′-ATACCTGCATTTAACCTACA-3′)，用于擴增包含結合位點3′ UTR序列，連接pmD-19T載體后轉化感受態細胞，擴大培養并測序驗證。設計突變引物Fm：5′-GCATTCATTTATAGCATATTGTGTTC-AGAGTGAATCCACTGTCTGTCCTGTCGG-3′；Rm：5′-AACACAATATGCTATAAATGA-ATGCAGCTTTCAAAATTAGCTGCATTGGCC-3′(粗體為突變位點)。采用overlap PCR完成結合位點突變，回收片段并轉化感受態細胞，擴大培養并提取質粒用于測序驗證。使用I和II雙酶切構建野生型表達載體(-1-Wt-PGL3-basic)和突變型表達載體(-1-Mut-PGL3-basic)。利用Lipofectamine3000將miR-138 mimics或mimics NC與雙熒光素酶表達載體分別共轉入牦牛前體脂肪細胞，轉染48 h后參照雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega E1910)說明書測定相對熒光強度。

1.4.10 數據分析 數據均用“Mean±SD”表示，試驗結果使用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，兩組樣本采用獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan’s 法進行多重比較，使用GraphPad Prism 8完成數據可視化作圖。

2 結 果

2.1 牦牛肌內前體脂肪細胞分離鑒定

原代肌內前體脂肪細胞分離后貼壁1.5 h可觀察到前體脂肪細胞呈梭型貼壁生長；培養24 h后細胞數量增多，形態呈梭形或橢圓形；72 h細胞開始融合；培養至第8天，細胞密度達到90%左右，呈梭形、螺旋狀排列，此時開始傳代培養。對F3代細胞誘導分化鑒定，油紅O染色結果顯示，誘導分化第8天時，細胞質出現大量脂滴積累，形成較大脂滴(圖1)。獲得細胞與實驗室前期分離鑒定獲得的肌內前體脂肪細胞特征相符，表明成功獲得具有分化潛能的牦牛背最長肌肌內前體脂肪細胞。

A. 培養1.5 h，箭頭所示為梭形貼壁細胞(100×)；B. 分離培養72 h，細胞開始融合(100×)；C. 誘導分化第8天油紅O染色(100×)；D. 誘導第8天脂滴形成情況(400×)A. Cell culture for 1.5 h, the arrowheads indicates fusiform adherent cell (100×); B. Cell culture for 72 h, cells begin to fusion (100×); C. The Oil red O staining after induced differentiation for 8 days (100×); D. Lipid droplet formation after induced 8 days (400×)圖1 前體脂肪細胞分離鑒定Fig.1 Preadipocyte isolation and identification

2.2 miR-138 mimics及inhibitor轉染效率

利用RT-qPCR技術分別測定4個不同轉染濃度下miR-138相對表達情況，結果顯示(圖2)，相較NC組，細胞轉染miR-138 mimics后miR-138表達量極顯著上調(<0.01)，轉染miR-138 inhibitor后miR-138表達水平極顯著下調(<0.01)，且mimics和inhibitor轉染濃度為100 nmol·L時過表達及干擾效率分別為570%和63%，因此選擇100 nmol·L作為后續試驗轉染濃度。

A. miR-138 mimics 轉染結果；B. miR-138 inhibitor 轉染結果。*表示P <0.05，**表示P <0.01，下同A. Transfection result of miR-138 mimics; A. Transfection result of miR-138 inhibitor. *indicate P <0.05, **indicate P <0.01, the same as below圖2 轉染濃度篩選Fig.2 Transfection concentration screening

2.3 miR-138抑制前體脂肪細胞脂質沉積

F3代牦牛肌內前體脂肪細胞進行mimics和inhibitor轉染后，誘導分化至第8天，油紅O染色檢測脂肪細胞脂質沉積情況，結果如圖3所示，過表達miR-138后，細胞內脂滴累積顯著降低，而抑制miR-138后，細胞脂滴積累顯著增多；油紅O染液吸光值與染色結果一致(圖3A)，表明過表達miR-138可抑制牦牛肌內前體脂肪細胞脂質沉積，抑制miR-138可促進細胞脂質沉積。

A. 油紅O染色結果(100×)； B. 脂肪分化標志基因表達水平A. Oil red O staining result (100×); B. The expression level of adipose differentiation marker genes圖3 miR-138對脂肪細胞分化的影響Fig.3 Effects of miR-138 on adipocyte differentiation

利用qPCR測定miR-138過表達及干擾后脂肪細胞分化標志基因和表達水平(圖3B)，結果表明，過表達miR-138顯著降低了和的表達(<0.01)，干擾miR-138表達可顯著上調和的表達(<0.05)，表明miR-138可能通過抑制肌內前體脂肪細胞分化水平，從而減少胞內脂滴積累。

2.4 miR-138對前體脂肪細胞增殖活性的影響

轉染后細胞接種至96孔板，12 h后細胞密度可恢復至80%～90%，此時開始劃痕試驗。結果顯示，與mimics NC相比，過表達miR-138后36 h后細胞仍存在明顯空隙，而NC組轉染36 h后細胞空隙完全消失；抑制miR-138組細胞同樣在36 h時空隙完全消失，而對照組劃痕恢復速度明顯低于inhibitor組細胞(圖4A)。CCK-8檢測結果(圖4B)表明，轉染miR-138 mimics 24 h后細胞活性顯著低于NC組(<0.01)，并在36 h極顯著低于NC組；與inhibitor NC相比，轉染miR-138 inhibitor后細胞增殖活力表現為相反趨勢；該結果與劃痕試驗結果相符，表明過表達miR-138可顯著降低牦牛前體脂肪細胞增殖活性，抑制miR-138表達則可增強細胞增殖活性。

A. 劃痕試驗結果(50×)；B. CCK-8檢測結果A. Scratch test results (50×); B. CCK-8 test results圖4 miR-138對脂肪細胞增殖活性的影響Fig.4 Effects of miR-138 on adipocyte proliferation

進一步通過流式檢測分析細胞周期變化情況，結果(圖5A)顯示，與對照組相比，過表達miR-138后細胞主要停滯在G0期；抑制miR-138后G1期細胞數量顯著減少，而G2-M期細胞明顯增多。結果表明miR-138可能通過阻滯細胞由G1向S期的進程影響細胞增殖。通過RT-qPCR分析細胞增殖相關基因的mRNA表達變化(圖5)，結果表明，過表達miR-138后細胞周期相關基因1、1和增殖標記基因67 mRNA表達受到顯著抑制，而抑制miR-138則增強了上述基因的表達，且67和1表達量顯著上升(<005)。結果表明，過表達miR-138可通過影響細胞周期相關基因1和1以及增殖標志基因67的表達，阻滯細胞G1-S進程，抑制細胞增殖。

A. 流式周期分析；B. 增殖標志基因表達變化A. Flow analysis; B. Expression level of proliferation marker genes圖5 miR-138對細胞周期的影響Fig.5 Effects of miR-138 on cell cycle

2.5 miR-138靶基因預測與功能分析

利用TargetScan、miRWalk和miRDB數據庫分別預測到672、14 020和657個潛在靶基因，其中263個靶基因為共有靶基因(圖6A)，包括-1、1、1、11等與脂肪代謝相關基因。對潛在靶基因進行KEGG和GO富集分析，GO結果(圖6C)顯示主要富集在RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正/負調控、I型肺細胞分化、蛋白酶體介導的泛素依賴蛋白分解代謝過程、Wnt信號通路和磷脂酰肌醇磷酸化等生物學過程(BP)；核染色質、胞質mRNA處理體、細胞核等細胞定位(CC)過程；染色質DNA結合、RNA聚合酶II啟動子核心區特異性DNA結合和鋅離子結合等分子功能(MF)過程。KEGG通路富集分析結果(圖6B)顯示，相關靶基因參與軸突導引、胰島素抵抗、RNA降解和胰島素分泌等通路。由于胰島素抵抗與脂肪酸代謝過程密切相關，故從胰島素相關通路篩選出6個參與脂肪生成調控的潛在靶基因(表2)，進行后續驗證試驗。

A. 靶基因預測結果；B. GO富集分析；C. KEGG pathway 富集分析A. Target gene predict result; B. Analysis of GO enrichment; C. Analysis of KEGG pathway enrichment圖6 miR-138生物信息學分析Fig.6 Bioinformatics analysis of miR-138

表2 靶基因篩選結果Table 2 Results of target genes screening

2.6 過表達及抑制miR-138對靶基因的影響

細胞轉染mimics及inhibitor并誘導分化48 h后，利用RT-qPCR測定靶基因的mRNA表達水平。結果顯示過表達miR-138后，靶基因11、1和11的mRNA表達顯著下調(<0.05)，-1α和25 mRNA表達水平極顯著下調(<0.01)，的mRNA表達無顯著差異(>0.05,圖7A)；抑制miR-138的表達后，和25的mRNA表達水平顯著上調(<0.05)，11和-1α的mRNA表達水平極顯著上調(<0.01)，而1和11的mRNA表達水平無顯著差異(>0.05，圖7B)。

A. 過表達miR-138對靶基因的影響；B. 抑制miR-138表達對靶基因的影響A. Effects of miR-138 overexpression on target genes; B. Effects of miR-138 suppression on target genes圖7 miR-138對靶基因的影響Fig.7 Effects of miR-138 on target genes

2.7 miR-138靶向PGC-1α 3′ UTR序列

RT-qPCR結果顯示，過表達和抑制miR-138都可極顯著影響-1的mRNA表達水平，暗示miR-138可能通過靶向-1影響前體脂肪細胞增殖分化過程。利用雙熒光素酶試驗進一步驗證miR-138與-1的靶向關系，結果顯示，細胞共轉染miR-138 mimics和-1-Wt-PGL3-basic后，對比其他組熒光強度顯著降低(<0.01)，且轉染miR-138 inhibitor和-1-Wt-PGL3-basic后熒光強度最高(圖8)。結果表明-1是miR-138的下游直接作用靶標，miR-138可特異性結合-1mRNA的3′ UTR序列，降低mRNA表達水平。

A. 結合位點預測； B. 位點突變驗證; C.雙熒光素酶報告試驗結果A. Predicted binding site; B. Site mutation verification; C. The result of dual-luciferase reporter assay圖8 雙熒光素酶試驗結果Fig.8 Results of dual-luciferase reporter assay

3 討 論

動物脂肪生成是一個復雜的協作體系，受到脂肪細胞的分化、脂質代謝等生物學過程的影響，miRNAs在該過程中發揮著重要的轉錄后調控作用。前人研究發現，在細胞脂質代謝過程中miR-138可以靶向1基因，激活AMPK通路，進而抑制1表達，從而降低癌細胞甘油三酯(TG)和膽固醇含量，抑制前列腺癌細胞脂質代謝。在脂肪肝細胞中miR-138還可作為1上游調控因子，當抑制miR-138-5p表達時，可促進1表達，加速脂肪酸β-氧化，降低脂肪含量，進而改變肝脂肪變性進程。此外，miR-138可以靶向調控脂肪生成關鍵酶(lipoprotein lipase)的活性，抑制脂肪源干細胞向脂肪細胞分化；還可靶向-1影響人間充質干細胞分化過程，進而減少細胞脂滴沉積。本研究發現，在牦牛肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中，過表達miR-138可顯著下調脂肪分化標志基因和的表達(<0.01)，抑制脂肪細胞分化過程，進而減少細胞脂質沉積；抑制miR-138表達則可顯著上調、的表達水平(<0.05)，促進細胞分化和脂質沉積，此結果與前人研究結果一致。

miR-138常被視作為一種腫瘤抑制因子，可在腫瘤的發生與發展過程抑制細胞的增殖能力；在神經干細胞的分化過程中，miR-138可靶向結合6的3′UTR序列調節其mRNA表達水平，進而促進細胞分化，抑制細胞增殖；還可通過抑制RhoC的表達抑制去分化軟骨細胞的分化和增殖。此外，miR-138也可作為circRNA的海綿(sponges)，通過競爭性吸附從而降低對牛成肌細胞的凋亡和分化的抑制作用，抑制細胞增殖；這些研究證明miR-138可對細胞增殖能力起到抑制調控。此外，miR-138還可對細胞增殖發揮正向調控作用，如可靶向-1促進人肺動脈平滑肌細胞的增殖，抑制細胞線粒體去極化；在小鼠平滑肌細胞中，靶向1 3′ UTR促進小鼠平滑肌細胞的增殖；這些研究成果證明，miR-138在細胞增殖過程中發揮著重要的調控作用。在本研究中發現，過表達和抑制miR-138可分別抑制和增強牦牛肌內前體脂肪細胞增殖活性(<0.05)，表明miR-138在抑制牦牛肌內前體脂肪細胞分化的同時，可抑制脂肪細胞增殖能力。進一步研究發現，過表達miR-138可使細胞阻滯于G1期，過表達miR-138后細胞周期相關蛋白1、1，及細胞增殖標志基因67顯著下調。而抑制miR-138后，1和67顯著上調。表明miR-138在前體脂肪細胞中可通過影響細胞周期和增殖相關基因的表達調控細胞增殖，但其具體作用機制有待深入研究。

-1(過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α)是細胞線粒體生物合成與功能發揮的關鍵因子，可調控線粒體基因和線粒體蛋白的表達，參與調控葡萄糖穩態、脂質代謝平衡和生物時鐘穩態等多種生理進程。本研究發現，miR-138可特異性結合-1的3′UTR序列，下調其mRNA表達水平，并抑制前體脂肪細胞脂滴積累，結果暗示，miR-138可能是通過靶向-1影響前體脂肪細胞脂質代謝過程，進而降低細胞脂質沉積。此外，-1作為脂肪分化標志基因的共激活因子，上調-1的表達水平可增強的表達，促進胚胎干細胞向心肌細胞分化；而下調-1的表達水平可抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化并降低膠原蛋白的釋放；有研究發現，-1還在骨骼干細胞向成骨或成脂細胞分化過程中扮演著調控開關的角色；在小鼠胚胎成骨細胞前體細胞分化抑制改善后，細胞-1表達水平也顯著增加；這些研究結果表明-1的表達與細胞分化過程密切相關。本研究中過表達miR-138同時顯著降低了的表達水平，抑制miR-138的表達則相反的促進的表達，因此推測，miR-138在前體脂肪細胞分化過程中，可能是通過特異性調控-1的表達，進而影響的激活，從而抑制牦牛肌內前體脂肪細胞分化和脂滴形成。

PTPN11是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族成員之一，被報道可作為胰島素作用的負調節因子，與肥胖及糖尿病等疾病的發生發展密切相關，參與調節細胞存活、增殖、分化、遷移和黏附等生命過程；11編碼蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)，在骨髓間充質干細胞中可通過抑制AKT的磷酸化和Cyclin D1的表達，從而調控細胞的增殖分化水平。突觸體相關蛋白-25(SNAP25)屬于可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白受體(SNARE)家族成員，對腦膠質瘤細胞的增殖、遷移及谷氨酰胺代謝過程具有調控作用，還可促進神經元細胞的分化。本研究同時發現miR-138可影響11和25的mRNA表達情況，結果暗示miR-138對牦牛前體脂肪細胞增殖、分化的調控作用，可能與25和11的表達有關，這也為揭示miR-138在動物脂肪生成過程中的調控機制提供了研究方向。

4 結 論

本研究證明了miR-138可抑制牦牛肌內前體脂肪細胞分化及增殖，減少胞內脂滴沉積；進一步試驗表明miR-138可通過靶向-1參與肌內前體脂肪細胞的增殖分化調控。本研究為闡明miR-138對動物脂肪生成的調控機制提供了數據參考，為牦牛肉品質的改善奠定了基礎。